1. Казань
2014
к.м.н., ассистент
Шмонин Алексей Андреевич
Проведение экспериментальных
исследований острой фокальной ишемии мозга
Образовательная программа
«Школа врача-исследователя 1»

2. К чему мы пришли?
Jean-Cloude Barone and Urlich Dirnagl
2013 London

3. Документы и рекомендации регламентирующие
проведение исследований на животных в России и мире

4. Ишемический инсульт
Атеросклерозсосудов головногомозга
Лакунарныйинсульт
Кардиогенныеэмболии
Криптогенныйинсульт
Редкие
Гипоперфузия
Эмболии
Фибрилляцияпредсердий
Протромботическиесостояния
Расслоение стенкисосуда
Артериит
Мигрень/вазоспазм
Наркомания
Другие
15%
85%
25%
25%
25%
20%
5%
Первичное кровотечение
•Внутримозговое
•Субарахноидальное
Патогенетические варианты инсультов
ИНСУЛЬТ
1. Fifth ACCP Consensus Conference on Antithrombotic Therapy.Chest. 1998;114(5):480S.
пороки клапанов
тромбы в желудочках
другие
Тромбоз
Некардиоэмболический инсульт
Кардиоэмболический инсульт
Гемодинамтический
Агрессивная
антигипертензивная
терапия;
операции (АИК и др.)
другие
? %
2,5 %
20 %
2,5 %

5. Компоненты инсульта, которые следует смоделировать в эксперименте на модели у животных
•Окклюзия сосуда –собственно ишемия;
•Нарушение в системе гемостаза –гиперкоагуляция;
•Сопутствующие инсульту состояния и заболевания, оказывающие влияние на работу головного мозга (сахарный диабет, артериальная гипертензия, ожирение, гиперлипидемия);
•Отек головного мозга;
•Ремоделирование нервной ткани и дегенеративные постинсультные изменения (деменция, депрессия, аффективные расстройства и эпилепсия);
•Неврологические (функциональные) нарушения (дефицит), возникшие вследствие инсульта (спастичность, нарушение афферентации, нарушение речи, парез, потеря навыков передвижения и др.);
•Последствия инсульта для всего организма (синдром иммунодефицита, гиподинамия, нарушение питания, гиперкатаболизм, трофические нарушения и др.)
•Сосудистые события и их развитие в условиях различного физиологического состояния (сон и бодрствование). Возраст.

6. Временная последовательность развития молекулярных механизмов повреждения
при ишемии головного мозга
Chavez J. C. et al., 2009

7. Животные, которые используются для моделирования церебральной ишемии
•Крыса,
•Мышь,
•Песчанка,
•Свинья,
•Собака,
•Кошка,
•Макака,
•Шимпанзе

8. Планирование исследования:
•Проект экспериментально исследования до начала исследования должен быть утвержден на заседании локального этического комитета. Документы об утверждении проекта исследования должны храниться с ЛЭКе и в исследовательском центре.
•В проекте исследования должно быть подробно расписано характер и особенность модели инсульта, анестезия в ходе основного этапа исследования, продленная послеоперационное обезболивание и способ разрешенной эвтаназии животных после завершения исследования.
•Заранее требуется описать статистические методы, которым следовать на всех этапах исследования [Dirnagl2004 книга ].
•Ввиду малой выборки нецелесообразно использовать методы параметрической статистики (в том числе использовать критерий Стьюдента, среднюю арифметическую и стандартное отклонение, как в расчетах так и в графиках), даже при доказательстве правильности распределения.
•В случае получения негативного результата, считается неправомерным менять описанный в проекте статистический метод для спекуляции результатами.
•Для исследования необходимо использовать здоровых линейных животных.
•Приветствуется проведение предварительных («пилотных») исследований на небольшой группе животных для последующего более эффективного планирования экспериментов.

9. Содержание животных (клетки для крыс и мышей)
•Клетки с крысами и мышами должны быть высокими.
•Не более 5 крыс в клетке, не селить крыс в клетки по одному.
•У крыс должен быть свободный доступ к воде и питанию.
•Световой режим должен составлять 8-10/14 часов свет темнота для крыс и мышей.

10. Наркоз для крыс
1.Ингаляционные анестестетики
2.Золетил
3.Хлоралгидрат
4.Нембутал
5.Тиопентал
6.Уретан
Рометар –запрещен из-за грубого влияния на гемодинамику

11. K. Overgaard Experimental & Translational Stroke Medicine2010
Кровоснабжение головного мозга крысы

12. Характеристики ишемии мозга с позиции патофизиологии
•Полная и неполная ишемия
•С реперфузией и без реперфузии
•Общая и фокальная
•Одноочаговая и многоочаговая

13. Методы глобальной ишемии мозга(гемодинамический инсульт)
•Окклюзия сонных артерий у крыс;
•Четырёхсосудистая модель;
•Окклюзия сонных артерий у животных с незамкнутым Веллизиевым кругом; например, у монгольской песчанки;
•Окклюзия обеих сонных артерий с гипотензией;
•Остановка сердца животного;
•Декапитация.

14. Методы фокальной ишемии мозга
•Филаментная окклюзия средней мозговой артерии -СМА (по Коидзуми 1986 г).
•Перевязка или коагуляция СМА
•Окклюзия СМА и сонных артерий в различных модификациях (транзиторная и перманентная фокальная ишемия).
•Эмболизация СМА.
•Фототромбоз (с бенгальским розовым).
•Вазоспастическая окклюзия отдельного сосуда(аппликация эндотелина-I).

15. Методы верификации повреждения мозга при ишемии головного мозга у крыс
•Витальная окраска с применением трифенилтетразолия хлорида (ТТХ)
•Гистология с применением традиционных окрасок (гематоксилин-эозин, по Нислю)
•МРТ
•КТ, ПЭТ, ОФЭКТ

16. Зона некроза
Здоровая ткань
Белое вещество мозга
Витальная окраска срезов (2-3 мм) головного мозга крысы хлоридом трифенилтетразолия (ТТХ, 1,5 %)
24
48
72
Диагностическое окно ТТХ
часы
100%

17. МРТ и КТ головного мозга крысы

18. Срез головного мозга крысы, окрашенный ТТХ, через 48 часов после моделирования ишемии. Виден инфаркт коры мозга и выраженный

20. Методы оценки кровотока в головном мозге
•Лазерная допплерография.
•Ультразвуковая допплеррография,
•МР-перфузи и КТ-перфузия.
•Окраска Синим эванса.

21. Н
Допплерография ЛСМА

22. Лазерная флоуметрия

23. Зона ишемии –участок мозга, где нарушена перфузия
(ишемическая пенумбра + ядро ишемии)
Зона ишемии
Введение синего Эванса внутрисердечно и выведение животного из эксперимента через 5 секунд для препарирования мозга

24. •Контроль качества модели –использование контроля кровотока на протяжении всего эксперимента –ишемия/реперфузия.
•Дублирование методов оценки;
•Использование комплексного анализа (МРТ, ТТХ, неврологический дефицит, поведенческие тесты, отек мозга и оценка кровотока);
•Требуется предоперационное тестирование животных по общему соматическому здоровью, на наличие неврологического дефицита и особенностей поведения.
•При использовании неврологических и иных шкал требуется предоперационное тестирование.
•Большинство тестов для правильного использования требуют знания доминантности полушарий, и при проведении поведенческих тестов предпочтительнее оценить домитнантность полушарий (право/леволапости) у каждого животного.
Принципы
(методы оценкиповреждения и неврологического дефицита)

25. Способы оценки неврологического дефицита
Открытое поле
Водный тест Морисса
Угловой тест
Тест хождения по балке
Тест вытягивания передних лап
Тест установки поз
«Rota-rod»тест
«Adhesive –Removal Somatosensory test»
«Vermicelli Handling Test»
«mNSS»тест
Оценка по шкале Garcia

26. Изучение выраженности неврологического дефицита у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом
Шкала Garcia
1.Спонтанная активность в клетке за 5 мин
2.Симметричность движений
3.Симметричность вытягивания передних конечностей
4.Способность забираться по стенке проволочной клетки
5.Реакция на прикосновение к каждой стороне туловища
6.Ответ на прикосновение к вибриссам
Максимальный неврологический дефицит –3 балла, егополное отсутствие –18 баллов

28. 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Исходно
2
7
14
21
28
Дни
Ложнооперированные
Ишемия
Оценка неврологического дефицита по шкале mNSS в течение 28 дней после 30-минутной окклюзии левой СМА в сравнении с ложнооперированными животными.

29. 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Исходно
2
7
14
21
28
Дни
ложноперированные
ишемия
Оценка неврологического дефицита по Бедерсон-тесту в течение 28 дней после 30-минутной окклюзии левой СМА по методике Коидзуми в сравнении с ложнооперированными животными.

30. 10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Исходно
2 дня
7 дней
14 дней
21 день
28 дней
Ложнооперированные
Ишемия
Оценка неврологического дефицита шкале Гарсия в течение 28 дней после 30-минутной окклюзии левой СМА в сравнении с ложнооперированными животными.

31. Тест «открытое поле», водный тест Морриса
1.Широко применяется для исследования особенностей поведения (двигательной активности и эмоциональности) у крыс
2.Поведенческие показатели:
•количество пересеченных квадратов
•количество пересеченных вертикальных стоек
•дефекации
•уринации
3.дефекации и перебежки рассматриваются как величины, связанные с проявлением эмоциональности у грызунов
4.Испытание проводится в течение 3 минут

32. «Vermicelli Handling Test» (Тест обращения с вермишелью)
Условия проведения теста
Тест состоял из 4-5 испытаний на интактныхкрысах
Крысам давали неприготовленные вермишели 7 см длиной
Испытания проводились в домашних клетках
Крысы были приучены к поеданию пасты в присутствии экспериментатора перед тестированием
крыса располагается лицом к экспериментатору, и пальцы и суставы пясти и фаланг (суставы кисти) обеих предплечий хорошо видны
движения правой и левой лап подсчитываются в отдельных испытаниях
Типичные примеры движений
Атипичное и спорадическое поведение

33. Слуховые вызванные потенциалы -метод исследования электрической реакции мозга и нервной системы в целом на слуховые раздражители, позволяющий оценить сохранность структур слухового анализатора на различных уровнях (от слухового нерва до слуховой коры)

34. Объективный метод оценки сохранности слуховой функции -регистрация коротколатентных слуховых вызванных потенциалов
(«Нейро-аудио», ПО «Нейрософт», г. Иваново).
Датчики, устанавливались:лоб, vertex, заушные области с двух сторон.
Исследования проводили при подаче стимула (щелчки) интенсивностью 30, 50, 70 dB, отдельно на правое, левое и на оба уха.
Оценивались следующие показатели:
•Общий вид графика;
•Интервалы;
•Амплитуда;
•Соотношение амплитуд;
•Латентность (расстояние от щелчка до пика).

36. При ишемии в бассейне ЛСМА при стимуляции правого уха увеличивается интервал III –V
До ишемии
После начала реперфузии
III
V
IV
II
III
V
IV
II
Интенсивность стимуляции: 50 dB
1,88 млс
2,25 млс
Данный показатель отражает асимметрию в проведении афферентного импульса от стволовых структур к подкорковым ядрам головного мозга.

37. Выводы по методам оценки неврологического дефицита:
•При фокальной транзиторной 30-минутной ишемии головного мозга крысы, развиваются поведенческие нарушения и очаговый неврологический дефицит в виде силовых, чувствительных и координаторныхнарушений, а также снижения двигательных нарушений, которые постепенно регрессируют к 28 суткам. То есть данная модель ишемии у крыс позволяет воспроизводить ишемический инсульт с регрессом неврологических симптомов в течение месяца.
•Все предложенные тесты позволяют выявить и количественно оценить неврологический дефицит у крыс. Наиболее чувствительными и репрезентативными оказались шкала Гарсия, тест с вытягиванием лапы («Placing test») и Бедерсонтест (Bedersontest).
•Требуется разработка специфичных для крыс тестов для оценки неврологического дефицита, основанных на видовых особенностях используемых лабораторных животных и обладающих высокой чувствительностью.

39. Обзор наиболее используемых экспериментальных моделей инсульта

40. Пережатие ЛСМА на 40 минут
Перевязка ЛСМА без реперфузии
Перевязка ЛСМА и ЛОСА без реперфузии
Перевязка ЛСМА и обеих ОСА без реперфузии
Перевязка ЛСМА и окклюзия обеих ОСА на 40 минут
Модели ишемии мозга связанные с окклюзией СМА и сонных артерий
Zhao H. 2006

41. Вид через трепанационное отверстие.
Корковая ветвь левой средней мозговой артерии перевязана

42. Анатомические варианты ЛСМА (вид через трепанационное окно)
Магистральный тип (61%)
Смешанный тип (33%)
Рассыпной тип (6%)
СМА

43. W.Luo Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism(2008)
Способы окклюзии СМА
•Коагуляция;
•Перевязка главного ствола СМА;
•Перевязка отдельных ветвей СМА;
•Фототромбозу крыс с предварительным введением фотосензибилизатора(бенгальский розовый);
•Апликацияэндотелина1.

45. Систолическая линейная скорость в бассейне левой СМА после окклюзии основных артерий.

46. Оценка размера зоны нарушения перфузии
(«зона риска») во всех группах первого этапа.

47. Размер инфаркта во всех группах второго этапа через 48 часов после моделирования ишемии.

48. Оценка размера зоны нарушения перфузии («зона риска») во всех группах третьего этапа и сравнение размером некроза через 48 часов после моделирования ишемии.

49. Оценка неврологического дефицита по шкале Гарсия во всех группах второго этапа через 48 часов после моделирования ишемии.

50. Преимущества модели
Недостатки модели
•Возможность получить значимое поражение коры головного мозга и неврологический дефицит.
•Простота использования,
•Позволяет контролировать анатомию сосудов,
•Возможность допплерографического контроля из-за трепанации
•Необходимость трепанации черепа,
•Механическое повреждение ткани мозга при прошивании,
•Большая вариабельность результатов,
•Высокий риск послеоперационной инфекции.
Перевязка или коагуляция СМА

51. Методика эндоваскулярной окклюзии средней мозговой артерии крысы (Koizumi J. 1986, в модификации Longa E.Z. И Belaev)
Некроз
Общая сонная артерия
Внутренняясонная артерия
Средняя мозговая артерия
Передняя мозговая артерия
Наружная сонная артерия

53. Допплерограмма ЛСМА крысы во время эксперимента
Наложение клипсы на ЛОСА
Введение филамента
Извлечение филамента
Систолическая линейная скорость
54±14 см/сек
Систолическая линейная скорость
50±12 см/сек
Систолическая линейная скорость
2,1±1,3 см/сек

54. Результат неправильного введения филамента –разрыв ЛСМА и формирование гематомы
Кровоизлияние

55. Результат неправильного введения филамента –нет окклюзии, нет ишемии
Введение филамента
Нет зоны нарушения перфузии Нет зоны некроза
(Синий Эванса)(ТТС)

56. Размер зоны нарушения перфузии и инфаркта мозга
Зона нарушения перфузии (зона ишемического риска)
Зона некроза

57. Преимущества модели
Недостатки модели
•Малоинвазивная
•Малозатратна в отношении времени,
•Нет необходимости вскрывать череп,
•Большой очаг ишемии и заметный неврологический дефицит,
•Общепринятая модель –ваш результат может быть использован для метанализа.
•Трудна в обучении,
•Необходимость изготовления филамента.
•Нет точных данных о положении филамента в СМА, трудно определить есть окклюзия или нет.
•Зависимость от размера крысы (200-250 граммов)
•Необходимость перевязки НСА.
•Окклюзия сонной при введении филамента.
Методика эндоваскулярной окклюзии средней мозговой артерии крысы

58. Изучение защитного эффекта раннего ишемического прекондиционирования при фокальной ишемии мозга различной длительности у крыс (протокол эксперимента)
ИШЕМИЯ 30 минут
ИШЕМИЯ 60 минут
ИШЕМИЯ 60 минут
ИШЕМИЯ 30 минут
Группа №1
Группа №2
Группа №3
Группа №4
Определение размера инфаркта через 48 часов
РЕПЕРФУЗИЯ
РЕПЕРФУЗИЯ
РЕПЕРФУЗИЯ
РЕПЕРФУЗИЯ
ИШЕМИЯ
ИШЕМИЯ
Группа №5
Группа №6
Ишемия мозга по методике J. Koizumi
Ишемия мозга –перевязка ЛСМА и ЛОСА

59. Влияние раннего ишемического прекондиционирования на размер зоны инфаркта мозга при транзиторной и перманентной ишемии
p=0,00004
Подкорковые ядра
Ишемия мозга по методике J. Koizumi
(непараметрический критерий Манна-Уитни)
Ишемия мозга –перевязка ЛСМА и ЛОСА

60. Влияние прекондиционирования на размер зоны нарушения перфузиипри фокальной ишемии мозга (протокол эксперимента)
Ишемия мозга по методике J. Koizumi
Ишемия мозга –перевязка ЛСМА и ЛОСА
ИШЕМИЯ 30 минут
ИШЕМИЯ 30 минут
Группа №1
Группа №2
Группа №3
Группа №4
Эндоваскулярная окклюзия ЛСМА, введение СЭ через 5 минут и определение зоны ишемии
Эндоваскулярная окклюзия ЛСМА, введение СЭ через 5 минут и определение зоны ишемии
Введение СЭ и определение зоны ишемии
Введение СЭ и определение зоны ишемии
ИШЕМИЯ 40 минут
ИШЕМИЯ 40 минут
Группа №5
Перевязка ЛСМА, введение СЭ и определение зоны ишемии
Группа №7
Группа №8
Группа №6
Перевязка ЛСМА, введение СЭ и определение зоны ишемии
Введение СЭ и определение зоны ишемии
Введение СЭ и определение зоны ишемии

61. Влияние прекондиционирования на размер зоны нарушения перфузиипри фокальной ишемии мозга
(непараметрический критерий Манна-Уитни)
Подкорковые ядра
Ишемия мозга по методике J. Koizumi
Ишемия мозга –перевязка ЛСМА и ЛОСА

63. 50
Контроль
ICP
%
30
60
0
Продолжительность ишемии
Размер инфаркта
Инфаркт–лимитирующая эффективность ишемического прекондиционирования при различной продолжительности тестовой ишемии сердца и мозга
Блохин И.О., Галагудза М.М. и соавт., 2008 год

64. Эмболическая модель инсульта

65. Преимущества модели:
•Возможность тестировать тромболитики,
•Большой очаг ишемии и заметный неврологический дефицит,
•Общепринятая модель – ваш результат может быть использован для метанализа.
Недостатки модели:
•Трудность в обучении.
•Зависимость эффекта троболитикаот типа экспериментально эмбола.
•Возможность спонтанного незапланированного тромболизиса.
•Невозможность контролировать качество окклюзии, размер тромба и длительность ишемии.
•Большой разброс данных.
Эмболическая модель инсульта

66. Histological evidence of hippocampal injury (30 min ischemia+48 h reperfusion)
•Диффузная ишемия головного мозга,
•Отсутствие очага ишемии,
•Гибель отдельных нейронов и глиальных клеток
Модель глобальной ишемии головного мозга песчанки
(McGraw C.P., 1977)

67. Aortic arch with the ligatures undertr. brachiocephalicus, a. subclavia sin, a. carotis communis sin.
Shcherbak et al. Bull Exp Med Biol,2011
Модель глобальной ишемии головного мозга

68. Принципы проведения исследования на эксперимнетальной модели инсульта на животных:
-Отбор животных для эксперимента (особенно важно для России!!!). Условия содержания животных.
-Контроль АД и температуры тела.
-Контроль газов крови (СО2, О2…).
-Плацебо-контроль;
-Маскирование групп животных («ослепление» группа не известна для исследователя-хирурга, статистика, того кто оценивает неврологический дефицит);
-Рандомизация.

69. Методы регистрации АД в эксперименте
1. Прямой (кровавый)
2. Непрямой (неинвазивный)
Датчик
Усилитель
Регистратор
Катетер
Регистратор
Манжета
Датчик
Контрольный блок
3. Телеметрический (дистанционный)
Вживленный (пере)датчик
Приемник
Регистратор
Из презентации М.М.Галагудзы

70. Современный аппаратный комплекс для неинвазивного изменения АД у мелких лабораторных животных

71. Основные элементы аппаратного комплекса для неинвазивного изменения АД (1)
Хвостовые манжеты различных диаметров (мышь, крыса)
Существуют 3 варианта датчиков:
•Фотоплетизмографические
•Пьезоплетизмографические
•Волюметрические (оптимальные)
Датчик пульсаций, размещаемый на хвосте животного дистальнее манжеты

72. Публикация результатов исследования
Minnerup J. Journal of Cerebral
Blood Flow & Metabolism (2010)
 Для авторов и исследователей
целесообразно писать не только в
зарубежные высокорейтинговые
журналы, но и в отечественные для
развития экспериментальной
ангионеврологии в России.
 Для авторов и исследователей требуется
публикация как положительных
результатах, где препарат
продемонстрировал ожидаемый
лечебный эффект, так и негативные
результаты, где препарат увеличивал
повреждение мозга при ишемии или не
влиял на размер повреждения.
 Качество научной работы и оформление
статьи, где получен негативный результат
не должно отличаться от публикации
положительных результатов.
Зависимость качества публикации от
индекса цитируемости журнала
(Impact Factor)

73. Экспериментальные исследования Что нужно менять?
Адекватная доза
•Доказательства того, что препарат достигает мишени
•Соблюдение терапевтического окна
•Использование хорошо изученной адекватной модели инсульта
•слепые рандомизированные исследования с формулировкой критериев включения/исключения, с достаточной выборкой и адекватным числом оценок
•Одновременная оценка морфологических и функциональных исходов в остром и в отдаленном периодах
•Отсроченная оценка (недели-месяцы)
Marc Fisher, Stroke. 2011;42[suppl 1]:S24-S27Initial and Updated STAIR Preclinical Recommendations
Консенсус

74. •Эффективность должна быть исследована вначале на молодых здоровых животных- самцах с использованием перманентной ишемии
•Вначале исследования проводятся в отношении ствола и белого вещества, далее в отношении серого
•Проявившие эффективность препараты проверяют дополнительно в сериях с самками, пожилыми животными, животными с коморбидными состояниями (гипертензия, диабет, гиперхолестеринемия)
•Использование diffusion/perfusion MRI и сывороточных маркеров повреждения
•Проверка взаимодействия с наиболее часто используемыми препаратами базовой терапии
консенсус

75. Мельникова Е.В.
Власов Т.Д.
Мальцева М.Н.
Дайнеко А.С.
Соловьева Л.Н.
Просвирнина М.С.
Пономарев Г.В.
Симаненкова А.В.
Бондарева Е.А.
Первый СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова
Федеральный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова
Институт экспериментальной медицины ФМИЦ
Вербицкая Е.В.

76. Спасибо за внимание
Рекомендации по доклиническому исследованию лекарственных средств на моделях инсульта
Шмонин А.А., Мельникова Е.В., Стаховская Л.В., Иванова Г.Е., Звартау Э.Э., Белозерцева И.В., Мальцева М.Н., Шамалов Н.А., Галагудза М.М., Власов Т.Д.
Материалы данной лекции будут опубликованы в 2015году в виде обзора в Журнале неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова
Контакты для связи: langendorff@gmail.com
Шмонин Алексей Андреевич