Nghiên Cứu Thành Phần Aglycon Của Loài Huệ (Polianthes Tuberosa L.).doc

DỊCH VỤ VIẾT THUÊ ĐỀ TÀI TRỌN GÓI - ZALO / TEL: 0932.091.562 –
LUANVANPANDA.COM -
TẢI TÀI LIỆU – KẾT BẠN ZALO: 0932.091.562
LUANVANPANDA.COM -
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
––––––––––––––––––––
NGUYỄN HỮU PHONG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AGLYCON
CỦA LOÀI HUỆ (Polianthes tuberosa L.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT
THÁI NGUYÊN - 2016
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
––––––––––––––––––––
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AGLYCON
CỦA LOÀI HUỆ (Polianthes tuberosa L.)
Chuyên ngành: Hoá hữu cơ
Mã số: 60.44.01.14
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM VĂN KHANG
THÁI NGUYÊN - 2016

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả
Xác nhận
Khoa chuyên môn
Xác nhận
Người hướng dẫn khoa học
TS. PHẠM VĂN KHANG
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNi http://www.lrc.tnu.edu.vn

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
LỜI CẢM ƠN
Luận văn được hoàn thành tại phòng thí nghiệm Hoá hữu cơ trường Đại
học sư phạm Thái Nguyên.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Văn Khang -
Người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hoá - Trường Đại học Sư
phạm Thái Nguyên, các thầy cô đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ và đưa ra nhiều
ý kiến quý báu về mặt chuyên môn trong quá trình tôi nghiên cứu và hoàn
thành luận văn. Đồng thời tôi xin chân thành cảm ơn cử nhân Đào Mai
Phương và Doãn Thị Chinh đã giúp đỡ cá nhân tôi trong quá trình thực
nghiệm.
Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, khoa Sau Đại học Trường Đại
học Sư phạm Thái Nguyên, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
quá trình học tập và làm luận văn.
Thái nguyên, tháng 4 năm 2016
Tác giả
Nguyễn Hữu Phong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNii http://www.lrc.tnu.edu.vn

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
MỤC LỤC
Lời cam đoan................................................................................................................................................ i
Lời cảm ơn....................................................................................................................................................ii
Mục lục......................................................................................................................................................... iii
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt..........................................................................................iv
Danh mục các bảng ................................................................................................................................. v
Danh mục các hình, sơ đồ...................................................................................................................vi
Lời cam đoan ......................................................................................................iii
MỞ ĐẦU.............................................................................................................1
1. Lýdo choṇ đềtài ...............................................................................................1
2. Muc ̣tiêu của đềtài............................................................................................2
3. Nôịdung nghiên cứu ........................................................................................2
4. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................2
5. Dư ̣kiến kết quảđaṭđươc ̣...................................................................................3
6. Dư ̣kiến cấu trúc luâṇ văn................................................................................4
Chương 1: TỔNG QUAN .................................................................................5
1.1. Khái quát về các thực vật họ Thùa (Agavaceae)..........................................5
1.1.1. Giới thiệu về họ Thùa................................................................................5
1.1.2. Giới thiệu về chi Huệ (Polianthes)............................................................5
1.2. Giới thiệu về loài Huệ ..................................................................................7
1.2.1. Tên khoa học .............................................................................................7
1.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố trong tự nhiên ...........................................7
1.2.3. Kinh nghiệm sử dụng trong y học dân gian ............................................10
1.3. Tổng quan về nghiên cứu hoá học thực vật Huệ........................................10
1.3.1. Hợp chất saponin.....................................................................................10
1.3.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần tinh dầu hoa Huệ ..........................15
1.4. Tổng quan các nghiên cứu hoạt tính sinh học............................................18
1.4.1. Hoạt tính của hợp chất saponin ...............................................................18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNiii http://www.lrc.tnu.edu.vn

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
1.4.2. Hoạt tính và công dụng của tinh dầu Hoa huệ ........................................19
Chương 2: PHẦN THỰC NGHIỆM..............................................................20
2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................20
2.2. Hóa chất - dụng cụ......................................................................................20
2.2.1. Hóa chất...................................................................................................20
2.2.2. Dụng cụ....................................................................................................21
2.3. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các
chất phân lập được.............................................................................................21
2.3.1. Xử lý mẫu thưc vật ..................................................................................21
2.3.2. Chiết xuất dược liệu.................................................................................22
2.3.3. Thủy phân mẫu trong axit........................................................................22
2.3.4. Phương pháp định tính dịch chiết CHCl3................................................22
2.3.5. Phân lập các chất từ dịch chiết Huệ ........................................................24
2.3.6. Xác định cấu trúc các chất.......................................................................24
2.3.7. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật.......................................................24
2.4. Phương pháp xác định thành phần tinh dầu hoa Huệ.................................25
2.5. Thực nghiệm...............................................................................................25
2.5.1. Chiết xuất và xác định thành phần tinh dầu hoa Huệ..............................25
2.5.2. Phân lập các chất loài Huệ.......................................................................26
2.5.3. Dữ liệu phổ của các chất phân lập được..................................................30
2.5.4. Thực nghiệm GC/MS ..............................................................................33
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................34
3.1. Kết quả định tính nhóm hợp chất trong cao chiết CHCl3 ..........................34
3.2. Kết quả phân lập các hợp chất....................................................................35
3.3. Xác định cấu trúc của các chất phân lập ....................................................35
3.3.1. Xác định cấu trúc của chất 1....................................................................35
3.3.2. Xác định cấu trúc của chất 2....................................................................38
3.3.3. Xác định cấu trúc của chất 3...................................................................41
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNiv http://www.lrc.tnu.edu.vn

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
3.4. Kết quả phân tích thành phần tinh dầu từ hoa Huệ ....................................46
3.5. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ....................................49
3.5.1. Chuẩn bị vi sinh vật kiểm định và nuôi cấy ............................................49
3.5.2. Qui trình thử nghiệm nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định49
3.5.3. Kết quả kháng vi sinh vật kiểm định.......................................................50
KẾT LUẬN ......................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................52
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNv http://www.lrc.tnu.edu.vn

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
1
H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
13
C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13
GC-MS: Sắc ký khí khối phổ
HMBC: Phổ hai chiều( tương tác xa)
Tế bào A549: Tế bào ung thư phổi
SKLM: Sắc kí lớp mỏng
MIC: Nồng độ ức chế tối thiểu
IC50 : Nồng độ ức chế 50%
MBC: Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
MMP-2: Gen nằm trên nhiễm sắc thể 16
Hl-60: Dong tế bào ung thư máu người
̀
MDA-MB-231: Dong tế bào ung thư vu người
̀ ́
LC-MS: Sắc kí lỏng ghép đầu dò khối phổ
HT-29: Ung thư tuyến đại tràng
ERK1/2: Các protein ERK1/2 tham gia phân chia tế bào
HSC: Tế bào gốc sinh ra các dòng tế bào máu và các
tế bào miễn dịch
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNiv http://www.lrc.tnu.edu.vn

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần các chất trong nước ép hoa Huệ....................................16
Bảng 1.2: Thành phần hóa học trong dịch chiết n-Hexan.................................17
Bảng 2.1: Số liệu phổ 1
H, 13
C-NMR của 1 ......................................................30
Bảng 2.2 : Số liệu phổ 1
H, 13
C-NMR của 2 .....................................................31
H, 13
C-NMR của 3 .....................................................32
Bảng 3.1: Kết quả định tính một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết CHCl3
...........................................................................................................................34
Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của 1 và hợp chất tham khảo...............................36
Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của chất 2 và hợp chất tham khảo .......................39
Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của chất 3 và hợp chất tham khảo .......................42
Bảng 3.5. Thành phần hóa học của tinh dầu trong loài Huệ .............................48
Bảng 3.6: Kết quả kháng vi sinh vật kiểm định của chất 2 và 3 .......................50
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNv http://www.lrc.tnu.edu.vn

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ẢNH
Hình 1.1. Sắc ký đồ GC của nước ép hoa Huệ[14]
............................................15
Hình 1.2. Sắc ký GC của dịch chiết n-hexan của hoa Huệ [14]
.........................16
Hình 3.1. Phổ 1
H-NMR của chất 1 ...................................................................37
Hình 3.2. Phổ 13
C-NMR của chất 1..................................................................38
Hình 3.3. Cấu trúc của stigmasterol ..................................................................38
Hình 3.4. Phổ 1
H-NMR của chất 2 ...................................................................40
Hình 3.5. Phổ 13
C-NMR của chất 2..................................................................41
Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của chất 2...............................................................41
Hình 3.7. Phổ 1
H-NMR của chất 3 ...................................................................43
Hình 3.8. Phổ 13
C -NMR của chất 3.................................................................44
Hình 3.9. Phổ 13
C -NMR của chất 3.................................................................44
Hình 3.10. Cấu trúc của Tigogenin ...................................................................45
Hình 3.11. Phổ HMBC của chất 3.....................................................................45
Hình 3.12. Phổ HMBC của chất 3.....................................................................46
Hình 3.13. Phổ GC/MS của tinh dầu Hoa huệ ..................................................47
Sơ đồ 2.1. Quy trình nghiên cứu tinh dầu Hoa huệ...........................................25
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ chiết và thủy phân dược liệu..................................................27
Sơ đồ 2.3. Sơ đồ phân lập các chất trong cặn chiết clorofom loài hoa Huệ .....29
Ảnh 1.1. Hình ảnh loài Huệ.................................................................................9
Ảnh 1.2. Củ và rễ của loài Huệ ...........................................................................9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNvi http://www.lrc.tnu.edu.vn

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
MỞ ĐẦU
1. Lýdo choṇ đềtài
Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng các cây cỏ có trong tự nhiên để
làm thuốc chữa bệnh theo kinh nghiệm truyền từ đời này sang đời khác. Thực
vật trong tự nhiên đã trở thành vị thuốc quen thuộc có vai trò quan trọng đối
với chữa trị các bệnh cho con người.
Ngày nay, với sự phát triển của khoa học và công nghệ tổng hợp hóa
dược đã tạo ra nhiều biệt dược khác nhau nhằm phục vụ cho công tác phòng,
chữa bệnh. Tuy nhiên, việc dùng thuốc nam để chữa bệnh vẫn giữ vai trò quan
trọng trong nền y học bởi nó đem lại hiệu quả trị bệnh cao và hầu như không
gây ra các tác dụng phụ như các sản phẩm tổng hợp hóa học.
Nước ta là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ
động thực vật phong phú và đa dạng. Theo thống kê sơ bộ, ở Việt Nam hiện
nay đã biết khoảng trên mười ngàn loài thực vật bậc cao, khoảng 800 loài Rêu,
600 loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo, trong đó có nhiều loài đã được dùng làm
thuốc. Thực vật là nguồn phong phú các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh
học cao. Việc khai thác và sử dụng các loài động thực vật để làm thuốc và hỗ
trợ chữa bệnh đã được thực hiện từ lâu, đến nay vẫn được nhiều nhà khoa học
quan tâm nghiên cứu.
Loài thực vật Huệ (Polianthes tuberosa L.) thuộc họ Thùa (Agavaceae)
trước đây thường mọc hoang, nhưng ngày nay được trồng phổ biến để lấy hoa
làm cảnh. Trong y học dân gian, thực vật này đã được sử dụng để làm thuốc:
thuốc lợi tiểu, chống nôn, trị viêm nhiễm, thấp khớp, sốt rét.... Gần đây, nhiều
nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết và các hợp chất được phân lập từ loài
thực vật này có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư và có một số tác
dụng sinh học khác. Tuy nhiên, đến nay tại Việt Nam chưa có công trình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN1 http://www.lrc.tnu.edu.vn

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
nghiên cứu nào về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Hoa huệ ;
việc sử dụng thực vật này vào mục đích chữa bệnh cũng chưa được quan tâm
đúng mức. Căn cứ các lý do trên, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành
phần aglycon của loài Huệ (Polianthes tuberosa L.)’’
Đề tài này nhằm nghiên cứu thành phần hóa học, đánh giá hoạt tính sinh
học của các hợp chất, nhất là các aglycon đồng thời góp phần nâng cao hiểu
biết về loài thực vật này.
2. Muc ̣tiêu của đềtài
- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc aglycon có trong dịch thủy
phân axit của loài Huệ.
- Thử hoạt tính sinh học của các chất thu được.
3. Nôịdung nghiên cứu
- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc aglycon có trong dịch thủy
phân axit của loài Huệ.
- Đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất phân lập được.
4. Phương pháp nghiên cứu
a. Phương pháp lý thuyết
- Thu thập, tổng hợp, phân tích tài liệu trong và ngoài nước về loài Huệ
để có cái nhìn tổng quan về nó.
- Phương pháp nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên.
- Phân tích tài liệu để có cơ sở khoa học về phương pháp xác định cấu
trúc, thử hoạt tính sinh học cũng như mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc
của mẫu nghiên cứu.
b. Phương pháp thực nghiệm
+ Thu thập mẫu nguyên liệu thực vật
- Thu mẫu nguyên liệu từ lá, hoa, thân của loài Huệ.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
+ Xây dựng phương pháp chiết xuất các chất có trong thực vật.
- Xác định phương pháp phân tích chính xác, thuận tiện nhất cho quá
trình thực hiện.
- Xây dựng quy trình xử lý nguyên liệu và chiết xuất các hợp chất từ thực
vật trên.
- Xử lý mẫu thực vật và chiết mẫu bằng dung môi khảo sát để lựa chọn
dung môi an toàn, phù hợp và tạo dịch chiết cho nghiên cứu.
+ Xây dựng và dự kiến phương pháp để thu được các aglycon từ nguyên
liệu đã chọn, xác định cấu trúc hóa học của chúng
- Trên cơ sở quy trình chiết xuất dược liệu đã xây dựng được, tiến hành
thủy phân mẫu chiết cao tổng số, xử lý dung dịch sau thủy phân, chiết xuất các
aglycon bằng các dung môi hữu cơ.
- Sử dụng phương pháp sắc ký cột với các dung môi thích hợp để phân lập
các aglycon từ dịch chiết thủy phân.
- Xác định cấu trúc hóa học của các aglycon bằng phương pháp phổ 1
H-
NMR, 13
C-NMR và HMBC.
+ Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp
chất được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
5. Dư ̣kiến kết quảđaṭđươc ̣
- Kết quả phân lập và xác định được cấu trúc một số aglycon trong dịch
thủy phân từ mẫu nghiên cứu.
- Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của các chất phân lập được.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
6. Dư ̣kiến cấu trúc luâṇ văn
Mở đầu.
Chương 1: Tổng quan.
Chương 2: Thực nghiệm.
Chương 3: Kết quả và thảo
luận. Kết luận.
Tài liệu tham khảo.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về các thực vật họ Thùa (Agavaceae)
1.1.1. Giới thiệu về họ Thùa
Họ Thùa bao gồm khoảng 550-640 loài với khoảng 18-23 chi, phân bố
rộng khắp trong khu vực ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới trên thế giới. Các
loài trong họ Thùa có thể là cây mọng nước hoặc không mọng nước. Lá của các
loài trong họ này trông giống như một chiếc nơ, lá của chúng có các gân lá
song song, lá thường dài và nhọn mũi, thường có gai cứng ở đỉnh, đôi khi có
các gai phụ mọc dọc theo mép lá. Thực vật thuộc họ này thường có hoa sặc sỡ
và có hương thơm [1, 16].
Ở trung Mỹ, các loài thực vật thuộc họ Thùa thường được sử dụng để
sản xuất các dạng đồ uống chứa cồn như bia pulque và rượu mezcal, một số
loài dùng để lấy sợi cho công nghiệp dệt.
1.1.2. Giới thiệu về chi Huệ ( Polianthes)
Polianthes là một chi có khoảng 18 loài thuộc họ Thùa (Agavaceae). Hoa
của chúng có thể là màu trắng, hồng hoặc màu đỏ. Các loài hoa đỏ đôi khi được
tách ra thành chi Bravoa. Vào mùa hè các loài phát triển nhanh và nở hoa. Các
loài được lai giữa các loài khác nhau đã bắt đầu xuất hiện gần đây, như có
giống lai giữa Polianthes và manfreda [16] . Chi Huệ gồm các loài sau [16]:
1. Polianthes bicolor
2. Polianthes densiflora
3. Polianthes durangensis
4. Polianthes elongata
5. Polianthes geminiflora
6. Polianthes howardii

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
7. Polianthes longiflora
8. Polianthes michoacana
9. Polianthes montana
10. Polianthes multicolor
11. Polianthes nelsonii
12. Polianthes oaxacana
13. Polianthes palustris
14. Polianthes platyphylla
15. Polianthes pringlei
16. Polianthes sessiliflora
17. Polianthes tuberosa
18. Polianthes zapopanensis
Các loài thường gặp:
Polianthes geminiflora: Mọc tự nhiên trong rừng sồi vào mùa đông ở
Mexico. Hoa nở vào đầu đến giữa mùa hè và có màu đỏ cam hoặc màu vàng [1,
16].
Polianthes howardii: Có nguồn gốc ở Jalisco và Colima ở Mexico. Loài
này được trồng nhiều ở Honolulu, Hawaii và nở hoa quanh năm. Màu sắc hoa
rất đa dạng như: màu hồng, xám xanh và màu đen. Chùm hoa có thể phát triển
lên đến cao 1 m. Các lá có màu xanh [1, 16].
Polianthes longiflora: Loài
howardii và Polianthes tuberosa. Tuy
này
nhiên,
được
không
lai
giống
giữa Polianthes
như Polianthes
tuberosa, nó không có mùi thơm.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Polianthes tuberosa: Loài này thường được nói đến như loài hoa nở về
đêm và có hương thơm và được gọi tên là "Huệ". Thực vật này xuất hiện ở
châu Âu vào khoảng năm 1600 và đã được phát hiện ở Trung Mỹ. Ở Việt Nam
được trồng phổ biến để lấy hoa làm cảnh [1].
1.2. Giới thiệu về loài Huệ [1]
1.2.1. Tên khoa học
- Tên khoa học: Polianthes tuberosa L.
- Giới : Thực vật
- Lớp : Một lá mầm (Monocotylendon).
- Họ thùa (Agavaceae)
- Chi huệ (genus) Polianthes
Tên khác: Ngoài ra cây còn tên khác theo địa phương là Dạ lai hương
(thơm ban đêm) hoặc Vũ lai hương (thơm lúc mưa).
Tên Việt Nam: Huệ.
Tên Trung quốc: Wan Xyangyu, Ye lay Xyang, Yue Xya Xyang.
1.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố trong tự nhiên
1.2.2.1. Đặc điểm thực vật
Huệ (Polianthes tuberosa) [1, 16] là một cây lâu năm thuộc họ Thùa.
Tên thường xuất phát từ tiếng Latin tuberosa, có nghĩa là bị sưng. Trong tiếng
Hy Lạp Polianthes có nghĩa là "nhiều hoa", ở Ấn Độ có nghĩa là “thơm vào ban
đêm”.
Huệ có hai giống: Huệ đơn còn gọi là Huệ xẻ, cây thấp, hoa ngắn và
thưa. Huệ kép còn gọi là Huệ tứ diện, cây cao, hoa dày và bông dài hơn. Hai
giống này có thể phân thành nhiều loại trong đó có Huệ trâu cao khoảng 1,5-
1,6 met bông dài. Huệ ta thân lùn, cho bông trắng, có mùi thơm hơn, ngoài ra
còn có Huệ đỏ.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Thân: Huệ thuộc cây thân thảo, thân hành, hay còn gọi là thân giả được
kết hợp bởi các bẹ lá xếp chồng lên nhau, bẹ lá trước xếp chồng lên bẹ lá sau,
thân thẳng đứng, không phân nhánh, vươn lên thành ngồng hoa cao khoảng 0,8-
1m.
Lá: Cây Huệ có lá đơn mọc quanh gốc thành vòng hình hoa thị, hình dải,
gân lá song song, màu xanh và dài, cuống lá rộng và to thành hình như cái bao
bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá không phân biệt rõ ràng, chiều dài lá khoảng
20-30cm, bề rộng của lá từ 0,5-1cm.
Hoa: Cây Huệ là cây ưa ánh sáng, cho hoa quanh năm, nhưng hoa nở chủ
yếu vào mùa hè (tháng 6-9) còn mùa đông tỷ lệ ra hoa ít, hoa nhỏ và bông ngắn
hơn. Huệ có màu trắng, bao hoa hình phễu, nhị gắn giữa ống bầu, hoa có vị
ngọt, hơi chát, thơm, không độc. Cụm hoa chùm dài 15-20 cm, thẳng đứng, ở
nách mỗi lá có hai hoa màu trắng rất thơm có tràng đơn hay kép; nhị gắn giữa
ống. Cánh hoa có cấu tạo cánh khá đặc biệt, khi không khí có độ ẩm cao, những
khí khổng (lỗ trao đổi khí) trên cánh hoa tự động mở to để dầu thơm thoát ra
ngoài. Ban đêm tuy không có ánh sáng nhưng độ ẩm không khí lại cao hơn ban
ngày, cho nên các khí khổng mở to cho mùi thơm thoát ra (mở túi thơm). Chính
vì thế, ban ngày hoa Huệ chỉ toả hương thoang thoảng, nhưng ban đêm nó lại
thơm ngào ngạt. Hoa Huệ toả mùi thơm theo độ ẩm, vì vậy không chỉ ban đêm,
mà vào ban ngày, kể cả khi trời mưa, độ ẩm không khí cao, hoa Huệ cũng thơm
hơn ngày nắng. Tập tính nở về đêm của loài này hình thành qua quá trình tiến
hóa.
Củ và rễ: Cây Huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu ở
lớp đất mặt 0-15cm, củ của thực vật này thực chất chính là thân ngầm của nó.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Ảnh 1.1. Hình ảnh loài Huệ
Ảnh 1.2. Củ và rễ của loài Huệ

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
1.2.2.2. Phân bố trong tự nhiên
Cây Huệ có nguồn gốc chủ yếu từ Mexico và hiện nay đã có mặt ở nhiều
nước trên thế giới như: Singapore, Indonexia, Iran,... Loài cây này đã được du
nhập vào nước ta từ rất lâu. Hiện nay, loài cây này đang được trồng phổ biến ở
Việt Nam, đặc biệt là các vùng trồng hoa lân cận Hà Nội. Cây Huệ là cây ưa
ánh sáng, do vậy vườn trồng cần phải không bị cây che ánh sáng, cho hoa
quanh năm, ưa khí hậu mát, nhiệt độ thích hợp 20-25o
C, phù hợp với đất thịt
nhẹ, thoát nước tốt, giàu dinh dưỡng [16, 17]. Ở Việt Nam, hoa Huệ là thứ hoa
được dùng nhiều trong việc cúng lễ, mà ít dùng để tặng nhau [1].
1.2.3. Kinh nghiệm sử dụng trong y học dân gian [1, 16]
- Hoa Huệ có tác dụng lợi tiểu và chống nôn.
- Ở Ấn Độ, củ được phơi khô và tán bột dùng làm thuốc trị lậu.
- Ở Việt Nam, củ hoa Huệ thường dùng củ chữa bệnh sốt rét. Nhiều nơi
dùng củ chữa hóc xương bằng cách giã nát củ, vắt lấy nước, nhỏ vào cuống
họng.
- Huệ được trồng rộng rãi ở các phía nam của Ở Trung Quốc. Các củ của
loài này sử dụng như một thuốc dùng để điều trị các bệnh truyền nhiễm cấp
tính, điều trị ghẻ và viêm gây sốt.
1.3. Tổng quan về nghiên cứu hoá học thực vật Huệ
1.3.1. Hợp chất saponin
Trên thới giới, đến nay có một số công trình đã công bố nghiên cứu về
thành phần hóa học của loài Huệ. Các chất đã phân lập ra từ loài thực vật này
được xác định chủ yếu thuộc nhóm saponin có khung aglycon như là tigogenin,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN10http://www.lrc.tnu.edu.vn

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
hecogenin, 9-dehydroxyhecogenin, 5α-spirostan-12-one và một số hợp chất có
khung đã được mở dị vòng 6 cạnh chứa oxi ở vị trí cacbon số 22 [3-5,7, 12-15].
Ở vị trí cacbon số 3 thường có các liên kết glycozit với một hoặc nhiều phân tử
đường.
Cấu trúc của aglycon trong các hợp chất glycoside đã phân lập được từ
loài Hoa huệ được tổng hợp dưới đây:
Năm 2000, Yoshihiro Mimaki và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần
hóa học bộ phận trên mặt đất của Huệ. Họ đã phân lập được bisdesmosidic
cholestane glycosides (1) và ba saponin có khung spirostanol (2-4). Cấu trúc
hóa học của các chất này được xác định bằng cách phân tích phổ 1D và 2D
NMR, đồng thời đánh giá khả năng ức chế trên tế bào ung thư bạch cầu (HL-
60) ở người [14].

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
H3C
OH
CH3
H3C H C
3
H3C O O
H
CH3
H3C CH 3 O
CH3
O
H H
OH
HO HO OH
(1)
R3
H
3
C
O
CH3 CH3
H
O
H3C
HO
R2
H
HO O OOH
HO O
O O
O
O
HO
OH
H
HO
R1
O OH
HO
HO
OH
O
O
HO HO OH
(2) R1=OH, R2=H, R3=2H
(3) R1=H, R2=H, R3=O
(4) R1=OH, R2= -, R3=O
Năm 2002, cũng nhóm nghiên cứu của Yoshihiro Mimaki và cộng sự (ở
Nhật bản) đã phân tích thành phần hóa học và phân lập được trong củ của loài
Huệ bốn saponin có khung là spirostanol liên kết với năm phân tử monosacarit
(5-8) [15]. Cấu trúc của các hợp chất đó được xác định bằng phân tích phổ
cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D. Các hợp chất (5-8) có tác dụng ức chế tế
bào ung thư bạch cầu HL-60 ở người [15]

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
R
O
O
H
3
C
O
CH3 CH3
CH3H H
O
H
H
(5-8)
R1 =
R2 =
R3 =
R4 =
HO
HO HO O O OH
HO O O
O
O
HO
HO HO HO
O OH
HO
HO
OH
O
O
HO OH
(5)
HO
HO
O
O OOH
HO O
O
O
HO
HO
HO HO
O OH
HO
HO
OH
O
O
HO OH
(6)
HO
HO
O
O OOH
HO O
O
O
HO
HO
HO HO
O OH
HO HO
OH
O
HO O
HO OH
(7)
HO
HO HO O O OH
HO O O
O
O
HO
HO HO HO
O OH
HO
OH
O
O
HO
HO OH
(8)

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Ngoài ra, một vài hợp chất glycosides bao gồm: (22S)-2β, 3β,22-
trihydroxycholest-5-en-16β-yl-β-D-apiofuranoside[4], 29-hy-droxystigmast-5-
en-3β-yl-β-D-glucopyranoside [5] và diribo-furanosyl ethyleneglycol [7] được
phân lập từ các bộ phận dưới mặt đất của loài này.
Một số saponin gồm polianthosides B (9), C (10), và bốn polianthosides
D-G (11)-(14), cùng với tám saponin (15) đến (22) cũng được phân lập ra từ củ
tươi loài thực vậy này [3, 7-9, 12].
H3C O
H C CH3
3
O
HO H3C H
H
H
HO O OOH
O O
O
R2 O H
HO
HO
O OH R1
HO
OH
R3 (9) R1 = H, R2 =Glc, R3 = Xyl
O
(10) R1 = H, R2 =R3 = Glc
(19) R1 = R2 = H, R3 = Xyl
(20) R1 = H, R2 = R3 = Xyl
(21) R1 = OH, R2 = R3 = Xyl
HO
HO O OOH
O O
O
R2 O
HO
HO
O OH
HO
OH
O
R3
CH3
HO O
HO HO
R1
H
3
C HO
CH3
CH
3
H
O
H3C
H H
H
R
1
(11) R1 = O, R2 =Xyl, R3 = H
(12) R1 = O, R2 =R3 = Xyl
(13) R1 = 2H , R2 =R3 = Xyl
(14) R1 = 2H, R2 = Glc, R3 = Xyl
(22) R1 = 2H, R2 = Xyl, R3 = H

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
OH3C O
CH3 CH3
H
O
H3C
HO
H
H
HO O OOH
O O
O
R2 O H
HO
HO
O OH R1
HO
OH
O
R3 (15) R1 = R2 = H
(16) R1 = Xyl, R2 =H
(17) R1 = R2 = Xyl
(18) R1 = Glc, R2 = Xyl
1.3.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần tinh dầu Hoa Huệ
Tinh dầu cũng là thành phần hóa học quan trọng của loài Hoa huệ. Trong
loài thực vật này ngoài các hợp chất glycoside đã phân lập được còn chứa nhiều
tinh dầu và các thành phần dễ hóa hơi. Tinh dầu Hoa huệ được chiết xuất bằng
các phương pháp như: Chiết xuất bằng lôi cuốn hơi nước, chiết siêu âm siêu tới
hạn, chiết xuất bằng dung môi hữu cơ. Dựa trên phương pháp GC/MS đã xác
định được hơn ba mươi thành phần hóa học có trong loài hoa này [11].
Hình 1.1: Sắc ký đồ GC của nước ép hoa Huệ[11]

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Bảng 1.1: Thành phần các chất trong nước ép hoa Huệ [11]
TT Peak
Thời gian
% Diện tích píc Chất
lưu(phút)
1 10.996 30.17 methyl benzoate
2 12.896 12.11 Methylsalicylate
3 14.567 1.78 Indole
4 14.818 1.47 (E)-citral
5 15.297 4.45 methyl anthranilate
6 16.021 1.80 Methyleugenol
7 17.306 8.83 (E)-methyl isoeugenol
8 17.373 13.33 7-decen-5-olide
9 20.755 2.43 (z)-beta-farnesene
10 21.943 23.64 benzyl benzoate
Hình 1.2. Sắc ký GC của dịch chiết n-hexan của hoa Huệ [11]

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Bảng 1.2: Thành phần hóa học trong dịch chiết n-Hexan[11]
TT Thời gian lưu
% Diện tích píc Chất
Peak (phút)
1 14.804 3.70
(Z)-3-hexenyl 2-
oxopropanoate
2 16.009 1.07 Methyleugenol
3 16.744 2.32 methyl isoeugenol
4 17.294 1.89 (E)-methyl isoeugenol
5 17.364 14.96 7-decen-5-olide
6 17.494 8.36 2,4,-di-tert-butylphenol
7 18.449 8.85 1-hexadecene
8 20.736 1.94 alpha-farnesol
9 21.901 24.25 benzyl benzoate
10 24.198 1.39 benzyl salicylate
11 26.245 4.96 Ecosanol
12 32.440 2.47 Tricosane
13 36.972 19.23 Pentacosane
14 43.542 4.60 Heptacosane
Từ nghiên cứu trên ta có thể thấy trong tinh dầu Hoa huệ thành phần
chính gồm: 7-decen-5-olide, 2,4,-di-tert-butylphenol, 1-hexadecene, benzyl
benzoate, pentacosane.
Đến nay, theo tìm hiểu của tôi ở Việt Nam chưa có báo cáo nào về thành
phần hóa học của loài Huệ.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
1.4. Tổng quan các nghiên cứu hoạt tính sinh học
Như đã trình bày ở trên, trong loài thực vật này thì thành phần hóa học
chủ yếu là các saponin. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài này cũng
định hướng theo hoạt tính của loại hợp chất đó, đồng thời tinh dầu của loài thực
vật này (nhất là trong hoa) thể hiện nhiều hoạt tính và công dụng tốt.
1.4.1. Hoạt tính của hợp chất saponin
1.4.1.1. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư
Năm 2002, Yoshihiro Mimaki và công sự đã tiến hành thử hoạt tính ức
chế của các saponin phân lập từ loài Huệ. Kết quả cho thấy các hợp chất
glycozit của spirostan (5-8) có khả năng ức chế tế bào ung thư bạch cầu HL-60
ở người [15].
Năm 2015, Gasparotto và cộng sự đã nghiên cứu cơ chế tác dụng của
hecogenin (là một sapogenin có trong loài Hoa huệ) ức chế sự gia tăng các loại
phản ứng trong tế bào gây ra bởi H2O2. Ngoài ra, hecogenin ngăn chặn sự
phosphoryl hóa của ERK1/2 và ức chế sự tăng MMP-2 gây ra bởi H2O2, làm
giảm sự tăng trưởng các tế bào ung thư [8].
Bên cạnh đó, từ hecogenin cũng được điều chế một số loại dẫn xuất dị
vòng có hoạt tính mạnh hơn so với hecogenin [6].
1.4.1.2. Hoạt tính chống viêm và ức chế enzym
Năm 2012, Kelly Barbosa Gama đã nghiên cứu về khả năng kháng viêm
của hecogenin. Nghiên cứu này đã được thực hiện để đánh giá hecogenin có tác
dụng hạ sốt [9].
Năm 2016, Lai-King Sy và các công sự đã khảo sát khả nắng chế enzym
β-Amyloid protein 42 một trong những tác nhân gây ra bệnh alzheimer

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
và parkison, của tigogenin và timosaponin. Kết quả nhận thấy tigogenin có hoạt
tính kém hơn so với timosaponin [10].
1.4.2. Hoạt tính và công dụng của tinh dầu hoa Huệ
- Cải thiện thần kinh và hệ hô hấp: các mùi thơm dễ chịu và các thành
phần hóa học khác nhau của tinh dầu có ảnh hưởng đến não, dây thần kinh và
giúp các cơ bắp được thư giãn; làm giảm stress, căng thẳng, lo âu, trầm cảm, co
giật và tiêu chảy. Tuy nhiên, để có hiệu quả tốt nhất khi sử dụng tinh dầu này
với tác dụng an thần, nên sử dụng với nồng độ thật loãng [16].
- Tác dụng làm ấm: Tinh dầu hoa Huệ có tác dụng làm ấm vào các cơ
quan vì nó làm tăng lưu thông máu. Giữ cho hệ hô hấp ấm áp, ngăn ngừa sự
lắng đọng đờm, tăng hoạt động, và cũng giúp để chữa trị các rối loạn tình dục
[16].
- Tác dụng giảm đau: Tinh dầu này có hiệu quả rất tốt trong giảm đau,
kháng viêm [1, 17].
- Độc tính: bên cạnh các tác dụng trên, các hợp chất phân cực nhỏ của hoa loài
Huệ thể hiện độc tính tế bào nhưng hoạt tính không quá mạnh [16,17].

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Chương 2
PHẦN THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là thân, lá của loài Huệ (Polianthes tuberosa L.) được
thu hái tại huyện Phú Lương - tỉnh Thái Nguyên vào tháng 6 và 7 năm 2015.
Thu hái cây Hoa huệ sau khi đã ra hoa và lấy cả các bộ phận thân và lá, rửa
sạch mẫu bằng nước lọc. Phần hoa tươi bảo quản trong tủ lạnh để xác định
thành phần tinh dầu.
2.2. Hóa chất - dụng cụ
2.2.1. Hóa chất
Các loại dung môi dùng để ngâm, chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure).
Còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng hay dùng trong phân
tích là loại tinh khiết.
- Dung dịch H2SO4 đặc.
- Dung dịch NaOH loãng.
- Silicagen ( cỡ hạt 0,043-0,063 mm; 200 g).
- Dung môi n-hexan, Etanol, Metanol, Cacbon tetraclorua, Etylaxetat,
axeton, Clorofom.
- Giấy pH.
- Thuốc hiện màu là hỗn hợp axit sunfuric đặc (H2SO4) và etanol 90%
(C2H5OH) theo ti lệ axit sunfuric : etanol là 3:7.
Các hệ dung môi khai triển SKLM:

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
1. n-hexan – axeton 25:1 Hệ A
2. n-hexan – etyl axetat 25:1 Hệ B
3. n-hexan – etyl axetat 20:1 Hệ C
4. n-hexan – etyl axetat 15:1 Hệ D
5. n-hexan – etyl axetat 10:1 Hệ E
6. CCl4- CHCl3 1:1 Hệ F
7. CHCl3- EA 25:1 Hệ G
2.2.2. Dụng cụ
- Máy cất quay chân không IKA*RV-10, các thiết bị phụ trợ cho thí
nghiệm phân lập chất hữu cơ.
- Cân phân tích, máy đo OD Microplate Reader.
- Cột sắc ký lớn và nhỏ.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân trên máy 500 MHz, Bruker.
- Sắc kí lớp mỏng bản nhôm silicagen 60 F254, độ dày 0,2 mm được sử
dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn
chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được.
2.3. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các
chất phân lập được
2.3.1. Xử lý mẫu thưc vật
Mẫu cây tươi cắt lấy phần trên củ gồm thân và lá của loài Huệ rồi rửa
sạch và phơi cho ráo nước. Lấy mẫu thái nhỏ từ 1 cm đến 2 cm, đem phơi dưới
nắng cho mẫu khô đều rồi cho vào túi kín, bảo quản nơi khô ráo thoáng mát.
Phần hoa tươi bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-4o
C.

DỊCH VỤ VIẾT THUÊ ĐỀ TÀI TRỌN GÓI - ZALO / TEL: 0932.091.562 – LUANVANPANDA.COM
-
-
2.3.2. Chiết xuất dược liệu
Mẫu cây Huệ sau khi đã được xử lí xong được ngâm chiết trong etanol
90% ở nhiệt độ 70-80˚C, mỗi lần 1 kg mẫu/5 lít etanol 90%. Quá trình chiết
được lặp lại ba lần, mỗi lần chiết là 4 giờ. Sau khi chiết xong, lọc bỏ bã và thu
dịch chiết. Phần dịch chiết được cho vào máy cất quay dưới áp suất thấp để thu
hồi dung môi ở nhiệt độ 500
C thu được cặn chiết etanol.
2.3.3. Thủy phân mẫu trong axit
Cho phần cặn etanol cho vào bình thủy phân, thêm 2 lít nước, và khuấy
đều. Cho thêm vào hỗn hợp 70 ml axit H2SO4 đặc vào bình thủy phân, đun hồi
lưu ở nhiệt độ 60-70˚C trong 6h. Trong lúc đun, cứ 1 giờ phải khuấy đều 1 lần
để quá trình thủy phân hoàn toàn. Sau khi kết thúc thủy phân, axit dư được
trung hòa bằng NaOH 1M. Lọc thu phần không tan trong nước.
Phần cặn được rửa với nước để loại bỏ các muối vô cơ. Nghiền nhỏ cặn
và lần lượt chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần clorofom,
etylaxetat, thu được các dịch chiết CHCl3 và EA. Cất thu hồi dung môi dưới áp
suất giảm ở nhiệt độ 40o
C thu được các cặn chiết tương ứng.
2.3.4. Phương pháp định tính dịch chiết CHCl3
2.3.4.1. Định tính hợp chất phenolic
- Phản ứng với muối sắt (III):
Tùy theo sốlương̣vàvi ̣trínhóm hydroxyl trong phân tử polyphenol mà
cho màu lục, xanh hoăc ̣nâu.
- Tác duṇg với H2SO4 đăc:̣
Khi nhỏH2SO4 lên các dâñ xuất của flavon vàflavonol thìcho màu vàng
đâm,̣ đối với chalcon vàauron cho màu đỏ, đỏthắm vàđỏtươi; flavanon cho màu
đỏda cam do sư ̣chuyển thành chalcon.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
2.3.4.2. Định tính alkaloid
* Các thuốc thử sử dụng:
- Thuốc thử Dragendorff.
Dung dịch A: Hòa tan 0,05 g bitmut nitrat (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 mL
dung dịch axit axetic 20%. Dung dịch B: 5 mL dung dịch KI 40% trong nước.
Trước khi sử dụng trộn 20 mL dung dịch A, 5 mL dung dịch B và 70 mL H2O.
- Thuốc thử Mayer:
Dung dịch A: hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60mL H2O. Dung dịch B: Hòa
tan 5g KI trong 10mL H2O. Trộn hai dung dịch lại, thêm nước vừa đủ 100mL.
* Thí nghiệm: Lấy 0,05g cặn chiết cho thêm 5 mL H2SO4 5%, khuấy đều,
lọc qua giấy lọc. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 mL nước lọc axít rồi thêm:
+ Ống 1: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff, xuất hiện màu da cam là phản
ứng dương tính.
+ Ống 2: 3-5 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện kết tủa trắng là dương
tính. * Hiện tượng
+ Ống 1: Dung dịch chuyển sang màu da cam.
+ Ống 2: Xuất hiện kết tủa trắng.
2.3.4.3. Định tính các flavonoit
* Thuốc thử: Dung dịch axit HCl đặc 36% và bột Mg kim loại.
* Thí nghiệm: Lấy 0,05g cặn chiết thêm 10mL CH3OH, đun nóng cho
tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2mL nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg
kim loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút
đến và quan sát thấy dung dịch có màu từ vàng, đỏ đến xanh là dương tính với
các flavonoit.
* Hiện tượng: Dịch metanol có màu hồng. Khi thêm thuốc thử thì có
màu hồng hơn.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
2.3.4.4. Định tính các cumarin
* Thuốc thử: Dung dịch NaOH 10%.
* Thí nghiệm: Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch thử, cho vào một
trong hai ống đó 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thuỷ
đến sôi, lấy ra để nguội cho thêm 4 ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm
trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính. Nếu đem axít hoá ống
nghiệm có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc mà làm cho dịch đang trong suốt
hoặc có màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra kết tủa là dương tính.
2.3.4.5. Phản ứng của steroid
Phản ứng Liebermann–Burchardt: Cho vào ống nghiệm có chứa cặn
glycosid tim 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cặn. Nghiêng ống 450
.
Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng
trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím
đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.
2.3.5. Phân lập các chất từ dịch chiết loài Huệ
Phân lập các chất từ cặn chiết CHCl3 thu được bằng phương pháp sắc ký
cột silica gel với các hệ dung môi rửa giải thích hợp.
2.3.6. Xác định cấu trúc các chất
Cấu trúc của các hợp chất sau khi tách ra được xác định bằng sự kết hợp
các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và
hai chiều trên hệ máy có tần số 500 MHz tại Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự
nhiên, ĐHQG Hà Nội và so sánh với giá trị phổ trong các công trình đã công
bố trước đó.
2.3.7. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương
pháp pha loãng đa nồng độ của Vanden Bergher và Vlietlinck hiện đang được
áp dụng tại trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
2.4. Phương pháp xác định thành phần tinh dầu hoa Huệ
Lấy cánh hoa của Hoa huệ tươi cho vào bình sạch ngâm với dung môi n-
hexan tinh khiết, đậy kín trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Đem phần dịch lọc bỏ
cánh hoa rồi chiết lấy dịch chiết n-hexan. Dịch thu được dùng để thực nghiệm
GC (FID) kết hợp với phổ khối MS để xác định thành phần và hàm lượng tinh
dầu trong Hoa huệ.
2.5. Thực nghiệm
2.5.1. Chiết xuất và xác định thành phần tinh dầu Hoa huệ
Lấy 50 gam cánh Hoa huệ tươi cho vào bình sạch ngâm với 200ml dung
môi n-hexan, đậy kín trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Đem phần dịch lọc bỏ cánh
hoa rồi chiết lấy dịch chiết n-hexan. Dịch chiết n-hexan dùng thực nghiệm GC/MS
để xác định thành phần và hàm lượng tinh dầu có trong hoa loài Hoa huệ.
50 g cánh hoa Huệ
- Chiết trong n-hexan( 48 giờ)
- Lọc bỏ cánh hoa
Dịch n-hexan
- Chiết lấy tinh dầu
Tinh dầu hoa Huệ
Thực nghiệm GC/MS để
xác định
hàm lượng tinh dầu
Sơ đồ 2.1. Quy trình nghiên cứu tinh dầu Hoa huệ
Kết quả nhận thấy trong tinh dầu Hoa huệ thu hái tại Thái Nguyên có
chứa 37 thành phần hóa học khác nhau. Trong tinh dầu này có một số các thành
phần chiếm hàm lượng lớn.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
2.5.2. Phân lập các chất loài Huệ
2.5.2.1.Chiết xuất mẫu nghiên cứu
Mẫu hoa Huệ sau khi đã được xử lí xong tiếp tục chia thành các phần
nhỏ và chiết hồi lưu trong etanol 90% ở nhiệt độ 80˚C trong thời 3h, lặp lại 3
lần. Sau khi ngâm chiết xong lọc bỏ phần bã hoa Huệ và thu lấy dịch chiết.
Dung môi được thu hồi bằng quay cất dưới áp suất thấp thu cao chiết tổng số có
khối lượng 1 kg.
2.5.2.2. Thủy phân cặn chiết etanol của loài Huệ
Cao chiết tổng số được thủy phân trong môi trường axit trong bình thủy
tinh. Hỗn hợp cao chiết và nước (2 lít) được thêm vào 70ml axit H2SO4 đặc
vào đun nóng hồi lưu ở nhiệt độ 60-70˚C trong 6h. Trong lúc đun, cứ sau 1 giờ
phải khuấy đều 1 lần để quá trình thủy phân hoàn toàn. Sau khi thủy phân xong
axit được trung hòa bằng NaOH. Lọc thu sản phẩm không tan trong nước. Phần
cặn được rửa với nước để loại bỏ các muối vô cơ. Nghiền nhỏ cặn và lần lượt
chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần clorofom, etylaxetat thu được
các dịch chiết. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40o
C thu được
các cặn chiết có khối lượng tương ứng là: 50 gam cao chiết clorofom ; 50g cao
chiết etylaxetat.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
2.5.2.3. Phân lập các chất từ cặn chiết CHCl3
3 kg mẫu khô
loài Huệ
- Chặt nhỏ
- Chiết trong etanol (90%)
Cặn chiết etanol (1 kg)
- Thủy phân với H2SO4
- Trung hòa axit dư với NaOH
- Lọc lấy cặn
Cặn sau khi thủy phân (200g)
- Nghiền nhỏ
- Chiết lần lượt với clorofom,
etyl axetat
Phần không tan Cao clorofom
(50 g)
Cao etyl axetat
(50 g)
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ chiết và thủy phân dược liệu
2.5.2.4. Phân lập các chất từ cặn chiết CHCl3
Từ 50 gam cao chiết CHCl3, tiến hành phân lập các chất bằng phương
pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel. Hòa tan cao chiết trong lượng vừa
đủ CHCl3 và nhỏ từ từ vào 50g silica gel để tạo hỗn hợp chạy cột. Cột sắc ký
được nhồi với lượng silica gel là 700g. Hệ dung môi rửa giải: n-hexan:axeton
với tỉ lệ 25/1 đến 1/1 (v/v) thu được 7 phân đoạn khác nhau.
Phân đoạn 1 gộp các ống từ số 1 đến 5.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Từ 2,5 gam cặn chiết từ phân đoạn số 2 được tiến hành sắc ký cột với chất
hấp phụ silica gel và hệ dung môi rửa giải là n-hexan: etylaxetat với tỉ lệ 15/1
đến 1/1 (v/v) thu được 6 phân đoạn, ký hiệu A đến F.
Trong các phân đoạn A đến F, phân đoạn B gồm 3 ống đem thử với bản
mỏng có 2 vết chất, tiết hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CCl4/CHCl3
có tỉ lệ từ 3/1 đến 1:1 (v/v) tách được 2 chất tinh khiết không màu 1 và 2. Từ
phân đoạn C có 1 vết chất đậm, tiếp tục được sắc ký cột silica gel với hệ dung
môi CCl4/CHCl3 với tỉ lệ 1/1 thu được chất rắn 3, chất này cho màu vàng khi
hiện màu với thuốc thử H2SO4 đặc trong etanol và hơ nóng.

DỊCH VỤ VIẾT THUÊ ĐỀ TÀI TRỌN GÓI - ZALO / TEL: 0932.091.562 – LUANVANPANDA.COM -
DỊCH VỤ VIẾT THUÊ ĐỀ TÀI TRỌN GÓI - ZALO / TEL: 0932.091.562 – LUANVANPANDA.COM -
Cao CHCl3
( 50 g)
- Chạy sắc kí cột( lần 1)
- Hệ dung môi n-hexan:axeton = 25/1 đến 1/1 (v/v)
- Thông cột bằng axeton.
Phân đoạn1
ống 01-05
Phân đoạn 2
ống 06-10
Phân đoạn 3
ống 11-15
Phân đoạn
4 ống 16-18
Phân đoạn 5
ống 19-22
Phân đoạn 6
ống 23-25
Phân đoạn 7
ống 26-28
- Sắc kí cột silica gel
- Hệ dung môi n-hexan:
etylaxetat = 15/1 đến 1/1 (v/v)
Phân đoạn A Phân đoạn B Phân đoạn C Phân đoạn D Phân đoạn E
- Sắc kí cột silicagel
- Sắc kí cột silica gel
- Hệ dung môi CCl4:CHCl3 =
- CCl4:CHCl3 với tỉ lệ 1/1 (v/v)
3/1 đến 1/1(v/v)
Phân đoạn F
Chất rắn 1 (15 mg)
Chất rắn 2 (17 mg)
Chất 3
( 11 mg)
Sơ đồ 2.3. Sơ đồ phân lập các chất trong cặn chiết clorofom loài hoa Huệ

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
2.5.3. Dữ liệu phổ của các chất phân lập được
2.5.3.1. Dữ liệu phổ 1
H và 13
C-NMR của chất 1
Các giá trị phổ 1
H-NMR, 13
C-NMR của 1 được đo trên hệ máy cộng
hưởng từ 500 MHz trong dung môi CDCl3, chất chuẩn TMS. Kết quả dữ liệu
phổ cộng hưởng từ của chất 1 được tổng hợp ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Số liệu phổ 1
H, 13
C-NMR của 1
Ví trí Số liệu đo 13
C NMR (ppm) 1
H NMR (ppm), J (Hz)
1 37.21 1.53-1.78 (m)
2 31.62 1.16-1.78 (m)
3 71.81 3.53 (m)
4 42.29 1.40-1.67 (m)
5 140.73
6 121.73 5.35 (br d, 3,5)
7 31.87 1.40-1.95 (m)
8 31.88 1.78 (m)
9 50.08 1.76 (m)
10 36.48
11 21.08 1.56 (m); 1.67 (m)
12 39.65 1.55 (m); 1.65 (m)
13 42.29
14 56.83 2.03 (m)
15 24.35
16 28.92
17 55.90
18 12.03 0.84 (s)
19 19.38 1.03 (s)
20 40.50
21 21.05 0.91 (d, 6.6)
22 138.33 5.16 (dd, 8.5, 15.4)
23 129.27 5.03 (dd, 8.5, 15.4)
24 51.21 2.01 (m)
25 31.87 1.87 (m); 1.89 (m)
26 21.20 0.84 (t, 8.5)
27 25.40 1.98 (m)
28 18.95 0.81 (d, 6.9)
29 12.25 0.86 (d, 9.6)
30

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
2.5.3.2. Dữ liệu phổ của chất 2
H, 13
C-NMR của 2 được đo trên hệ máy cộng hưởng từ
500 MHz trong dung môi CDCl3, chất chuẩn TMS. Kết quả dữ liệu phổ của
chất 2 được tổng hợp ở bảng 2.2.
H, 13
C-NMR của 2
C NMR (ppm) 1
H NMR (ppm), J (Hz)
1 37.26 1.53-1.78 (m)
2 31.64 1.16-1.78 (m)
3 71.80 3.57 (m)
4 42.29 1.40-1.67 (m)
5 140.76
6 121.71 5.35 (br d, 3.5)
7 31.91 1.40-1.95 (m)
8 31.91 1.78 (m)
9 50.15 1.76 (m)
10 36.51
11 21.08 1.56 (m); 1.67 (m)
12 39.79 1.55 (m); 1.65 (m)
13 42.33
14 56.79 2.03 (m)
15 24.31
16 29.17
17 56.07
18 11.98 0.84 (s)
19 19.40 1.03 (s)
20 33.96
21 26.11 0.91 (d, 6.6)
22 45.85 1.16 -1.18 (m)
23 23.08 1.76-1.83 (m)
24 11.98 1.87 (m)
25 29.71 1.87 (m); 1.89 (m)
26 19.82 0.84 (t, 8.5)
27 19.05 1.98 (m)
28 18.79 0.82 (d, 6.9)
29 11.86 0.83 (d, 9.6)
31

-
-
2.5.3.3. Dữ liệu phổ của chất 3
H-NMR, 13
C-NMR của 3 được đo trên hệ máy cộng
hưởng từ 500 MHz trong dung môi CDCl3, chất chuẩn TMS. Kết quả dữ liệu
phổ của chất 3 được tổng hợp ở bảng 2.3.
H, 13
C-NMR của 3
C NMR (ppm) 1
H NMR (ppm), J (Hz)
1 29.61 1.53-1.76 (m)
2 27.47 1.16-1.75 (m)
3 66.74 4.05 (1H, m)
4 33.19 1.40-1.65 (m)
5 36.18 2.02 (m)
6 26.22 1.36 (m)
7 26.20 1.40-1.97 (m)
8 34.93 1.75 (m)
9 39.97 1.76 (m)
10 34.93
11 20.56 1.55 (m); 1.65 (m)
12 39.51 1.55 (m); 1.66(m)
13 40.33
14 56.13 2.03 (m)
15 31.40 1.98 (m)
16 80.69 4.32 (1H, q, J = 7.8)
17 61.74
18 16.16 0.78 (3H, s)
19 23.58 0.98 (3H, s)
20 41.78 2.03 (m)
21 14.00 1.06 (3H, d, J = 7.2)
22 109.41
23 27.47 1.76-1.83 (m)
24 25.60 1.88 (m)
25 26.2 1.87 (m); 1.91 (m)
26 64.80
3.89 (1H, dd, J = 11.3, 2.5 ).
3.41 (1H, d, J = 11.3 )
27 16.16 0.99 (3H, d, J = 7.5)
32

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
2.5.4. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
- Các chủng vi sinh vật: mua tại ngân hàng ATCC gồm
Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis ATCC 27212
Staphylococcus aureus ATCC 12222
Lactobacillus fermentum ATCC 14931
Vi khuẩn Gr (-) : Escherichia coli ATCC 25922
Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923
Salmonella enterica ATCC 14028
Nấm : Candida albican
- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Sabouraud Dextrose Broth (SDB)-
Sigma cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong môi trường Trypcase Soya
Broth (TSB)-Sigma.
Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn,
Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.
- Qui trình thử nghiệm nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương
pháp pha loãng đa nồng độ của Vanden Bergher và Vlietlinck hiện đang được
áp dụng tại trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Đây
là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh
giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể
hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế 50%),
MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả định tính nhóm hợp chất trong cao chiết CHCl3
Kết quả định tính nhóm chất trong dịch chiết CHCl3 của loài Huệ được
thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.1: Kết quả định tính một số nhóm chất hữu cơ có
trong cao chiết CHCl3
Số TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả
dd FeCl3 5% Xanh nhạt
1 Phenolic
H2SO4 đăc ̣ Màu hồng
Dragendoff Không rõ
2 Alkaloid
Mayer Không rõ
3 Flavonoid Mg/HCl đặc Xuất hiện màu đỏ nhạt
4 Coumarin NaOH đặc Không rõ
5 Steroid Liebermann-Burchardt Xanh vàng
Từ kết quả phân tích ở bảng trên ta thấy trong cao chiết CHCl3 của loài
Hoa huệ có mặt nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học như hợp chất
phenol, flavonoit, steroid. Các nhóm hợp chất này có ý nghĩa trong việc ứng
dụng làm thuốc chữa bệnh: flavonoit có tác dụng chống oxi hóa, tác động lên
enzym, các bệnh tim mạch; hợp chất phenolnic có tác dụng kháng sinh, chống
viêm; steroid có tác động tới hệ thần kinh, điều trị ung thư, diệt khuẩn, hạ huyết
áp. Đây là cơ sở để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
3.2. Kết quả phân lập các hợp chất
Mẫu cây tươi của loài Huệ đã cắt nhỏ phơi khô (3 kg) được ngâm chiết
(xem mục 2.5.2.1) thu được 1 kg cặn etanol (sơ đồ 2.2). Quá trình thủy phân
các chất từ cặn etanol chiết của loài hoa Huệ được trình bày chi tiết ở phần thực
nghiệm (xem mục 2.5.2.2).
Từ 200 gam cặn thu được sau thủy phân ngâm chiết lần lượt với các
dung môi có độ phân cực tăng dần clorofom, etylaxetat, thu được dịch chiết
khác nhau. Cất loại dung môi được các cặn chiết có khối lượng tương ứng là:
50g cao tổng tan trong dung môi clorofom; 50g cao tổng tan trong dung môi
etylaxetat.
Từ 50 gam cặn chiết CHCl3 được tiến hành sắc ký cột silicagel với các
hệ dung môi thích hợp thu được các phân đoạn từ 1 đến 7.
Từ phân đoạn 2, sắc ký cột silica gel thu được 6 phân đoạn A-F. Từ đoạn
B được tiến hành sắc ký cột silica gel ta thu được hai chất tinh khiết 1 (15 mg)
và 2 (17 mg). Từ phân đoạn C tiến hành sắc ký cột thu được chất 3 (11 mg).
+ Chất 1: 15 mg, hiệu suất 5.10-4
% so với lượng mẫu khô.
+ Chất 2: 17 mg, hiệu suất 5,7.10-4
+ Chất 3: 11 mg, hiệu suất 3,7.10-4
3.3. Xác định cấu trúc của các chất phân lập
Cấu trúc hóa học của 3 chất sạch: 1, 2 và 3 được xác định dựa vào dữ
liệu phổ 1
H-NMR, 13
C-NMR, HMBC và so sánh với tài liệu tham khảo.
3.3.1. Xác định cấu trúc của chất 1
Cấu trúc hóa học của 1 được xác định dựa vào 1
H-NMR, 13
C-NMR và
có so sánh với các tài liệu tham khảo.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của 1 và hợp chất tham khảo
Số liệu đo 13
C
Số liệu tham khảo 13
C
1
H NMR (ppm), J
Ví trí NMR (ppm) của
NMR (ppm) (Hz)
stigmasterol [2]
1 37.21 37.24 1.53-1.78 (m)
2 31.62 31.65 1.16-1.78 (m)
3 71.81 71.81 3.53 (m)
4 42.29 42.30 1.40-1.67 (m)
5 140.75 140.74
6 121.73 121.73 5.35 (br d, 3.5)
7 31.87 31.90 1.40-1.95 (m)
8 31.88 31.91 1.78 (m)
9 50.08 50.15 1.76 (m)
10 36.48 36.51
11 21.08 21.09 1.56 (m); 1.67 (m)
12 39.65 39.77 1.55 (m); 1.65 (m)
13 42.29 42.30
14 56.83 56.87 2.03 (m)
15 24.35 24.37
16 28.92 28.93
17 55.90 56.05
18 12.03 11.99 0.84 (s)
19 19.38 19.41 1.03 (s)
20 40.50 40.51
21 21.05 21.22 0.91 (d, 6.6)
22 138.33 138.33 5.16 (dd, 8.5, 15.4)
23 129.27 129.27 5.03 (dd, 8.5, 15.4)
24 51.21 51.24 2.01 (m)
25 31.87 31.90 1.87 (m); 1.89 (m)
26 21.20 21.22 0.84 (t, 8,5)
27 25.40 25.41 1.98 (m)
28 18.95 19.04 0.81 (d, 6.9)
29 12.25 12.26 0.86 (d, 9.6)

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Hợp chất 1 thu được dưới dạng tinh thể màu trắng. Phổ 1
H-NMR thấy
xuất hiện tín hiệu của nhóm β-OH (δH 3.53, m, H-3). Trên phổ cộng hưởng
proton cũng xác nhận sự có mặt của liên kết đôi tại δH 5.32 (br s) và một liên
kết đôi trans khác tại δH 5.16 (dd, 8.5, 15.4)/ 5,03 (dd, 8.5, 15.4). Tín hiệu
cộng hưởng của 2 nhóm metyl bậc ba tại δH 0.84 (s), 1.03 (s); 3 nhóm metyl
bậc hai t.ại δH 0.91 (d, J = 6.6 Hz), 0.81 (d, J = 6.9 Hz), δH 0.86 (3H, d, J = 9.6
Hz) và 1 nhóm thế metyl bậc một tại δH 0.84 (t, J = 8.5 Hz).
Hình 3.1. Phổ 1
H-NMR của chất 1
Phổ 13
C-NMR của 1 xuất hiện 29 tín hiệu cacbon, đặc biệt, tín hiệu của
hai cặp olefin được xác nhận tại C-5 (δC 140.75)/C-6 (δC 121.73) và C-22 (δC
138.33)/C-23(δC 129.27). Dựa vào các phân tích trên và kết hợp so sánh số liệu
phổ 13
C-NMR của 1 với các số liệu đã được công bố của stigmasterol [2] thấy
hoàn toàn phù hợp. Như vậy, 1 có thể được khẳng định là stigmasterol.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Hình 3.2. Phổ 13
C-NMR của chất 1
Hình 3.3. Cấu trúc của stigmasterol
Cấu trúc hóa học của chất 2 được xác định dựa và 1
H-NMR, 13
C-NMR
và có so sánh với các tài liệu tham khảo.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của chất 2 và hợp chất tham khảo
Số liệu đo 13
C
Số liệu tham khảo 13
C -
1
H NMR (ppm), J
Ví trí NMR (ppm) của
NMR (ppm) (Hz)
β-Sitosterol [2]
1 37.26 37.51 1.53-1.78 (m)
2 31.64 31.90 1.16-1.78 (m)
3 71.80 72.01 3.57 (m)
4 42.29 42.50 1.40-1.67 (m)
5 140.76 140.91
6 121.71 121.9 5.35 (br d, 3.5)
7 31.91 32.10 1.40-1.95 (m)
8 31.91 32.11 1.78 (m)
9 50.15 50.32 1.76 (m)
10 36.51 36.74
11 21.08 21.35 1.56 (m); 1.67 (m)
12 39.79 39.96 1.55 (m); 1.65 (m)
13 42.33 42.67
14 56.79 56.93 2.03 (m)
15 24.31 26.34
16 29.17 28.56
17 56.07 56.37
18 11.98 13.38 0.84 (s)
19 19.40 19.25 1.03 (s)
20 33.96 34.24
21 26.11 26.33 0.91 (d, 6.6)
22 45.85 45.85 1.16 -1.18 (m)
23 23.08 23.32 1.76-1.83 (m)
24 11.98 12.28 1.87 (m)
25 29.71 29.46 1.87 (m); 1.89 (m)
26 19.82 20.15 0.84 (t, 8.5)
27 19.05 19.66 1.98 (m)
28 18.79 19.07 0.82 (d, 6.9)
29 11.86 12.08 0.83 (d, 9.6)

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Hợp chất 2 cũng thu được dưới dạng tinh thể màu trắng. Phổ
1
H-NMR
thấy xuất hiện tín hiệu của nhóm β-OH (δH 3.57, m, H-3). Trên phổ cộng
hưởng proton cũng xác nhận sự có mặt của liên đôi tại δH 5.32 (br d, 3.5). Tín
hiệu cộng hưởng của 2 nhóm metyl bậc ba tại δH 0.84 (s), 1.03 (s); 3 nhóm
metyl bậc hai tại δH 0.91 (d, J = 6.6 Hz), 0.81 (d, J = 6.9 Hz), δH 0,86 (3H, d, J
= 9.6 Hz) và 1 nhóm thế metyl bậc một tại δH 0.84 (t, J = 8.5 Hz).
Hình 3.4. Phổ 1
Phổ 13
C-NMR của 2 xuất hiện 29 tín hiệu cacbon, đặc biệt, tín hiệu của
hai cặp olefin được xác nhận tại C-5 (δC 140.75)/C-6 (δC 121.73). Dựa vào các
phân tích trên và kết hợp so sánh số liệu phổ 13
C-NMR của 2 với các số liệu
đã được công bố của β-Sitosterol [2] thấy hoàn toàn phù hợp. Như vậy, 2 có
thể được khẳng định là β-Sitosterol.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Hình 3.5. Phổ 13
C-NMR của chất 2
Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của chất 2
Cấu trúc hóa học của chất 3 được xác định dựa và 1
H-NMR, 13
C-NMR
và có so sánh với các tài liệu tham khảo.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của chất 3 và hợp chất tham khảo
Số liệu đo 13C
Số liệu tham khảo
Ví trí
13
C -NMR (ppm) của 1
H NMR (ppm), J (Hz)
NMR (ppm)
Tigogenin [10, 17]
1 29.61 29.60 1.53-1.76 (m)
2 27.47 27.58 1.16-1.75 (m)
3 66.74 66.84 4.05 (1H, m)
4 33.19 33.65 1.40-1.65 (m)
5 36.18 36.29 2.02 (m)
6 26.22 26.60 1.36 (m)
7 26.20 26.55 1.40-1.97 (m)
8 34.93 35.00 1.75 (m)
9 39.97 40.11 1.76 (m)
10 34.93 34.95
11 20.56 20.54 1.55 (m); 1.65 (m)
12 39.51 39.54 1.55 (m); 1.66(m)
13 40.33 40.33
14 56.13 56.14 2.03 (m)
15 31.40 31.60 1.98 (m)
16 80.69 81.01 4.32 (1H, q, J = 7.8)
17 61.74 62.11
18 16.16 16.41 0.78 (3H, s)
19 23.58 23.65 0.98 (3H, s)
20 41.78 42.11 2.03 (m)
21 14.00 14.33 1.06 (3H, d, J = 7.2)
22 109.41 109.70
23 27.47 27.34 1.76-1.83 (m)
24 25.60 25.83 1.88 (m)
25 26.2 26.02 1.87 (m); 1.91 (m)
26 64.80 64.78
3.89 (1H, dd, J = 11.3, 2.5 ).
3.41 (1H, d, J = 11.3 )
27 15.71 16.08 0.99 (3H, d, J = 7.5 )

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Hợp chất 3 cũng thu được dưới dạng tinh thể màu trắng. Phổ 1
H-NMR
thấy xuất hiện tín hiệu của nhóm β-OH (δH 4.05,m, 1H). Tín hiệu cộng hưởng
của nhóm metyl bậc ba tại δH 0.78 (s); 0.98 (s); 3 nhóm metyl bậc hai tại δH
0,99 (d, J = 7,5 Hz), 1,06 (d, J = 7,2 Hz); hai proton ở vị trí C-26 (δH 3.89 (1H,
dd, J = 11.3, 2.5 Hz); δH 3.41 (1H, d, J = 11.3 Hz)) và một proton ở C-16 δH
4.32 (1H, q, J= 7.8 Hz).
Hình 3.7: Phổ 1
Phổ 13
C-NMR của 3 xuất hiện 27 tín hiệu cacbon; đặc biệt, tín hiệu của
C-22 (δC 109.41) tương ứng với nguyên tử C có liên kết trực tiếp với hai
nguyên tử oxi; C-16 (δC 80.69) tương ứng với cacbon bậc 3 liên kết với oxi.
Các tín hiệu cộng hưởng của các nhóm metyl (-CH3) δC 16.16 (C-18); 23.58
(C-19); 14.00 (C-21); 15.71 (C-27). Ngoài ra, cấu hình 25R của hợp chất đang
cần xác định cấu trúc được suy luận dựa trên sự khác nhau trong sự thay đổi độ
chuyển dịch hóa học của proton dạng geminal của H-26 (δ = 3.89) (Hα-26) và
(δ = 3.41) (Hβ-26) (Δαβ:0.48) trong khi sự khác nhau thông thường của hợp
chất 25S là ≥ 0.57 còn 25R là ≤ 0.48 [18].

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Đồng thời trên phổ HMBC của chất 3 cho thấy các tương tác H-C ở các
vị trí liên kết cơ bản như H-26 với C-22 cho thấy trong phân tử có sự khép
vòng tại dị vòng sáu cạnh chứa oxi và các tương tác ở các vị trí khác biểu hiện
trên hình: 3.11 và 3.12
Hình 3.8. Phổ 13
C -NMR của chất 3
Hình 3.9. Phổ 13
C -NMR của chất 3

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Dựa vào các phân tích trên và kết hợp so sánh số liệu phổ 13
C-NMR của
3 với các số liệu đã được công bố của tigogenin [10, 17] thấy hoàn toàn phù
hợp. Như vậy, chất 3 có thể được khẳng định là Tigogenin.
Hình 3.10. Cấu trúc của Tigogenin
Hình 3.11. Phổ HMBC của chất 3

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
Hình 3.12. Phổ HMBC của chất 3
(Các Phổ 13
C, 1
H-NMR , HMBC của chất 3 xem thêm ở phụ lục)
3.4. Kết quả phân tích thành phần tinh dầu từ hoa Huệ
Do trong hoa Huệ có hàm lượng các chất phân cực nhỏ lớn, nhất là tinh
dầu, đồng thời tinh dầu hoa Huệ cũng được sử dụng rộng rãi nên chúng tôi tiến
hành xác định thành phần và hàm lượng các chất phân cực nhỏ tan được trong
n-hexan có trong hoa loài thực vật này.
Mùi hương hoa Huệ được biết đến có ảnh hưởng có ích đến não bộ và
tim, điều này giúp cải thiện được cảm xúc, tâm lý và cảm hứng nghệ thuật bằng
việc khuyến khích não phải điều khiển tâm trí [11]. Tính đến nay, những
nghiên cứu trước đây đã từng trình bày thành phần cơ bản của tinh dầu của hoa
tuberose ở Ấn Độ và Hàn quốc [11]. Tuy nhiên, tính đến những gì kiến thức
chúng ta được biết về thành phần hóa học cơ bản của dầu trong

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
những cây thực vật đó bị hạn chế dựa vào những khu vực địa lý và bộ phận
khác nhau của thực vật.
Thành phần chủ yếu và hàm lượng của các tinh dầu trên thành phần có
trong dịch chiết n-hexan của hoa Hoa huệ được phân tích bằng GC(FID)/MS và
so sánh với phổ khối lương trong thư viện Nist 8. Các thực nghiệm GC/MS
được thực hiện tại Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội .
Kết quả đã xác nhận được 37 thành phần hóa học trong tinh dầu đã
được nhận diện, trong đó có các thành phần chính là methyl 2-amino benzoate
(11.06%), Isoeugenol (10.19 %), 1-Eicosene (9.56%), 5-Octadecene (6.67%).
Trong đó, 1-eicosene and 1-nonadecene được xác nhận như là thành phần chính
lần đầu tiên được xác nhận có trong loài thực vật này. Thành phần và hàm
lượng của 37 tinh dầu được trình bày trong bảng dưới đây.
Hình 3.13. Phổ GC (FID) của tinh dầu hoa Huệ

-
-
Bảng 3.5. Thành phần hóa học của tinh dầu trong loài hoa Huệ
Thời
gian lưu Tên hợp chất %
(min)
17.404 Benzeneacetaldehyde 2.32
18.204 1,8-Cineole 0.33
18.428 Methylbenzoate 0.35
19.166 Nonanal 0.54
19.968 5-Octadecene 6.76
20.275 (E)-Citral 0.15
21.438 Dodecane 0.34
21.552 1-Icosene 9.56
21.796 Decanal 0.59
23.083 1-Nonadecene 5.12
24.169 2-Ethylhexylacrylate 0.48
25.300 Geraniol 3.40
26.040 Geranylacetate 2.19
26.228 Tetradecane 0.37
26.660 Indole 7.02
27.352 Methyl2-aminobenzoate 11.06
27.693 Geranial 0.53
27.954 Eugenol 3.90
29.064 Methyleugenol 0.50
Thời gian
Tên hợp chất %
lưu (min)
29.402 Isoeugenol 10.19
29.739 3,4- 0.34
Dimethoxybenzaldehyde
29.977 Methylisoeugenol 0.46
30.067 Ecosanol 1.38
30.425 Tricosane 0.97
30.503 α-Farnesene 2.28
30.776 trans-Farnesol 4.52
31.195 Heneicosane 1.79
31.361 Benzylbenzoate 6.04
31.570 (Z)-nerolidol 3.16
31.685 Phenylethylbenzoate 0.62
32.014 2-heptadecanone 1.38
32.270 Diisobutylphthalate 5.80
33.702 Pentacosane 0.52
33.744 Tetradecanol 0.10
34.423 Benzylsalicylate 3.07
35.314 Hexadecanol 0.50
35.362 Heptacosane 0.13

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
3.5. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
3.5.1. Chuẩn bị vi sinh vật kiểm định và nuôi cấy
- Các chủng vi sinh vật: mua tại ngân hàng ATCC gồm
Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis ATCC 27212
Staphylococcus aureus ATCC 12222
Lactobacillus fermentum ATCC 14931
Vi khuẩn Gr (-) : Escherichia coli ATCC 25922
Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923
Salmonella enterica ATCC 14028
Nấm : Candida albican
- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Sabouraud Dextrose Broth (SDB)-
Sigma cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong môi trường Trypcase Soya
Broth (TSB)-Sigma.
Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn,
Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.
3.5.2. Qui trình thử nghiệm nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm
nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các
giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức
chế 50%), MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).
a. Pha loãng mẫu thử:
- Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành
một dãy 05 nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao
nhất là 256g/ml, tiếp theo là 32g/ml, 8g/ml, 2g/ml, 0,5g/ml

-
-
b. Thử hoạt tính
Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 5.105
CFU/ml khi
tiến hành thử
- Lấy 10l dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng,
thêm 200l dung dịch vi khuẩn và nấm, ủ ở 37o
C. Sau 24h, đọc giá trị MIC
bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp
nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính
toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ TECAN và phần
mềm raw data.
c. Chất tham khảo
- Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+) và chủng E.c
với giá trị IC50 trong khoảng 0.05-2g/ml.
- Kháng sinh Pen/Step cho chủng Pseudomonas aeruginosa với giá trị
- Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5-1g/ml.
3.5.3. Kết quả kháng vi sinh vật kiểm định
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm
và dữ liệu. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.6
Bảng 3.6: Kết quả kháng vi sinh vật kiểm định của chất 2 và 3
Giá trị IC50 đối với các chủng (g/ml)
Tên Gram (+) Gram (-) Nấm
TT
mẫu
Staphylococ Bacillus
Lactobacill
Salmonell Escherich
Pseudomon
Candida
us asaerugino
cus aureus subtilis a enterica ia coli albican
fermentum sa
1 2 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256
1 3 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 > 256
Nhận xét:
Với kết quả thu được như bảng trên, ta nhận thấy hai chất 2 và 3 không thể
hiện hoạt tính kháng ví sinh vật kiểm định ở các nồng độ nghiên cứu

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
KẾT LUẬN
1- Từ phần thân và lá của loài Huệ (Polianthes tuberosa) được thu hái tại
Phú Lương - tỉnh Thái Nguyên; đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học được
03 chất trong cặn CHCl3 của dịch thủy phân cao chiết cồn 90% của loài này.
Cấu trúc hóa học của các chất được xác định bởi dữ liệu phổ 1D và 2D NMR
và so sánh với tài liệu tham khảo, các chất đó được xác định là:
- Chất 1: Stigmasterol
- Chất 2: β-Sitosterol
- Chất 3: Tigogenin
2- Hai chất 2 và 3 được tiến hành đánh giá hoạt tính kháng ví sinh vật
kiểm định nhưng không thể hiện hoạt tính ở nồng độ nghiên cứu.
Cả ba hợp chất aglycon phân lập được loài này đều có vai trò là các dẫn
chất trong tổng hợp hữu cơ và là dược chất được sử dụng rộng rãi trong y học.
3- Từ hoa loài Huệ chúng tôi đã tiến hành chiết xuất tinh dầu và xác định
thành phần hóa học, hàm lượng của các chất có trong đó bằng phương pháp
GC(FID)/MS. Kết quả đã xác định được 37 thành phần hóa học và hàm lượng
của chúng.

LUANVANPANDA.COM -
LUANVANPANDA.COM -
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng việt
1. Đỗ Tất Lợi, (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà XB Y học.
II. Tài liệu tiếng anh
2. A.P. Rajput and T.A. Rajput, (2012), “Isolation of Stigmasterol and β-
Sitosterol from Chloroform Extract of Leaves of Corchorus fascicularis
Lam”, International Journal of Biological Chemistry, 6: 130-135.
3. Firdous S, Khan K.M, Ahmad V.U, Usmani S.B, Ahmed M, Rashid A,
(1999), “A new glycoside from Polianthes tuberosa”, Fitoterapia, 70, 203-
204.[15]
4. Firdous, S.; Rashid, A.; Ahmad, V. U.; Khan, K. M.; Usmani, S. B, (1999),
“A novel steroidal saponin from Polianthes tuberosa L.” B. Nat. Prod. Lett,
14, 115-122.
5. Firdous, S.; Khan, K. M.; Ahmad, V. U.; Usmani, S. B.; Ahmed, M.;
Rashid, A., (1999), “ A new glicoside from Polianthes tuberosa”
Fitoterapia, 70, 203-204.
6. George R. Pettit; Moser, B. R.; Mendonç a, R. F.; Knight, J. C.; Hogan, F,
(2012), “The Cephalostatins. 23. Conversion of Hecogenin to a Steroidal
1,6-Dioxaspiro[5.5]nonane Analogue for Cephalostatin 11” J. Nat. Prod,
78, 1067–1072.
7. Jian-Ming Jin, Ying-Jun Zhang, Chong-Ren Yang, (2004), “Spirostanol and
Furostanol Glycosides from the Fresh Tubers of Polianthes tuberosa”, J.
Nat. Prod, 67, 5-9.
8. Juciano Gasparotto, Nauana Somensi, Alice Kunzler, Carolina Saibro Girardi,
Matheus Augusto de Bittencourt Pasquali, Vitor Miranda Ramos, Andre
Simoes-Pires, Lucindo Jose Quintans-Junior, Alexsandro Branco, Jose Claudio
Fonseca Moreira and Daniel Pens Gelain, (2015), “Hecogenin Acetate Inhibits

Nghiên Cứu Thành Phần Aglycon Của Loài Huệ (Polianthes Tuberosa L.).doc

Nghiên Cứu Thành Phần Aglycon Của Loài Huệ (Polianthes Tuberosa L.).doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên Cứu Thành Phần Aglycon Của Loài Huệ (Polianthes Tuberosa L.).doc

Similar to Nghiên Cứu Thành Phần Aglycon Của Loài Huệ (Polianthes Tuberosa L.).doc (20)

More from DỊCH VỤ VIẾT ĐỀ TÀI TRỌN GÓI ZALO/ TEL: 0909.232.620

More from DỊCH VỤ VIẾT ĐỀ TÀI TRỌN GÓI ZALO/ TEL: 0909.232.620 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên Cứu Thành Phần Aglycon Của Loài Huệ (Polianthes Tuberosa L.).doc