Fiksacija tkiva i organa u edukacijske i znanstvene svrhe

1. Improved Medical Education in Basic Sciences
for Better Medical Practicing
ImproveMEd
Fiksacija tkiva i organa u edukacijske i znanstvene
svrhe

2. 1.Cilj fiksacije
 Primarni cilj fiksacije i zašto se tkivo uopće fiksira je prevenstveno u znanstvene
i edukacijske svrhe. Tkivo se fiksacijom pokušava očuvati u što je mouguće
prirodnijem obliku, odnosno „life like“ stanju
 Na ovom slajdu lijevo vidimo sliku bubrega koji su uslikani prilikom patološke
obrade pacijenta, a desno je slika bubrega nakon odrađene fiksacije koja se
obavlja u svrhu edukacije. Makroskopski je vidljivo da do znatnije promjene u
volumenu i morfologiji tkiva nije doslo, jedina promjena je u boji što je rezultat
kemijskih reakcija koje se odvijaju prilikom samog procesa fiksacije
 Također osim mogućnosti fiksacije pojedinih organa, fiksacija se koristi i za
cijela tijela, odnosno za fiksaciju kadavera (tijela donirana u svrhu znanosti) koji
se koriste u edukacijske svrhe studenata. Samom fiksacijom donirano tijelo
možemo očuvati duži vremenski period te tako našim studentima omogućiti što
je kvalitetnije moguće obrazovanje. Na slikama su prikazani dijelovi kadavera
koji je prošao kroz fiksaciju s posebno izoliranim dijelovima i strukturama za
edukaciju studenata
 Sredstva za fiksaciju tkiva djeluju tako što zaustavljaju enzimsku razgradnju –
autoliza - izazvana staničnim enzimima i putrefakciju - izazvana enzimima
bakterija
 Mehanizam fiksacije (najčešći) je proces ireverzibilnog križnog povezivanja
amino skupine jedne aminokiseline s dušikom susjedne aminokiseline pomoću
–CH2- skupine, stvarajući tzv. METILENSKI MOST.
 Posljedica križnog povezivanja aminokiselina je tvrdoća tkiva koje se fiksira

3. 2.Sredstva za fiksaciju
 Postoje četiri glavne skupine fiksativa: ALDEHIDI (formaldehid, glutaraldehid),
OKSIDIRAJUĆI AGENSI (osmij-tetraoksid, kalijev permanganat), FIKSATIVI NA
BAZI ALKOHOLA (metilni alkohol, etilni alkohol) te FIKSATIVI NA BAZI METALA
(živin klorid, pikrična kiselina)
 Aldehidi su najčešće rabljeni fiksativi u anatomskim studijama, i to na bazi
formaldehida
 Fiksacija je uvijek fizikalni i kemijski proces, jer osim kemijskih reakcija uključuje
i proces difuzije ili perfuzije fiksativa u tkivo. Difuzija podrazumijeva
suspendiranje preparata u fiksativ, prilikom čega on polako i postepeno prodire
u tkivo, dok perfuzija podrazumijeva ubrizgavanje fiksativa izravno u tkivo, i
obično se rabi kada je preparat voluminozan, te je difuzija otežana. Također je
bitno imati na umu da već i fiksirano tkivo može djelovati kao fizička barijera za
daljnu fiksaciju, odnosno prodiranje fiksativa dalje u tkivo
 FORMALDEHID je spoj male molekulske mase, u standardnim uvijetima je u
plinovitom agregatnom stanju i vrlo dobro se otapa u vodi.
 FORMALIN, sastoji se od 37 – 40% formaldehida i 60 – 63% vode. U formalinu
većina molekula formaldehida egzistira u obliku kraćih polimera koji su topljivi
u vodi, a tek manji dio čine veći polimeri koji su vrlo slabo ili nikako topljivi u
vodi (paraformaldehid)
 Idealni fiksativ sadrži što je više moguće monomera formaldehida, jer jedino
oni mogu uspješno reagirati s proteinima. Razrijeđivanje fiksativa vodovodnom
vodom uzrokuje depolimerizaciju formaldehida u roku od nekoliko dana. Ako
se, pak, umjesto vode rabi otopina pufera s fiziološkim pH vrijednostima,
depolimerizacija je gotovo instantna jer u blago alkalnim otpinama hidroksidni
ioni kataliziraju hidrolizu polimera
 U formalinu se molekule formaldehida hidriraju prilikom čega nastaje
metanediol (metilen-glikol). Molekule metilen-glikola ako dugo stoje zatim
spontano formiraju polimere (polioksimetilen-glikol). U neutralnim do blago
alkaličnim uvjetima (približno fiziološki pH) odvija se depolimerizacija
polioksimetilen-glikola, a slobodne se molekule metilen-glikola zatim
dehidriraju do karbonil-formaldehida. I hidrirani i dehidrirani oblici posjeduju
fiksacijska svojstva. Tijekom procesa fiksacije, formaldehid prodire (difundira)
u tkivo u obliku metilen-glikola, a tek nakon toga, zbog pomaka u ravnoteži
reakcije, metilen-glikol se ponovno prevodi u formaldehid

4.  Opisane reakcije se odvijaju isključivo u neutralnoj do blago alkaličnoj sredini,
stoga je važno osigurati da tkivo koje fiksiramo zadovoljava taj kriterij. Jedan od
načina je da se temeljito ukloni krv iz preparata, odnosno kadavera jer prisustvo
deoksigenirane krvi čini slobodne molekule formaldehida neučinkovitima. To
se događa zato što u kiselim uvijetima primarni amini (NH2) reagiraju s
prisutnim viškom H+ formirajući NH3, pa ne mogu reagirati s formaldehidom
 Preporučuje se u formalin dodati 10% metanola, jer metanol ometa
polimerizaciju te tako usporava nastanak paraformaldehida. Štoviše,
komercijalno proziveden paraformaldehid gotovo uvijek sadrži 10% metanola.
Zbog toga takav paraformaldehid tkivo fiksira u dvijema fazama: prvo pomoću
metanola (fiksacija alkoholom), što za posljedicu ima dehidraciju površine tkiva,
odnosno određeni stupanj skvrčavanja i otvrdnuća tkiva; u drugoj pak fazi,
nakon dostatne difuzije formaldehida u tkivo, započinje denaturacijska fiksacija
pomoću križnoga povezivanja aminokiselina u proteinima
 Ako duže vremena stoji na zraku, formalin se oksidira, prilikom čega nastaje
mravlja kiselina. Formalin kontaminiran mravljom kiselinom ima slabija
fiksacijska svojstva
 Formaldehid je kancerogen (alkilirajući agens). Uzokuje iritaciju kože,
konjuktiva, sluznice respiratornog sustava te jake glavobolje
 Idealan fiksativ trebao bi imati određena svojstva:
 Da ne očvršćuje tkivo, organe ili tijelo
 Da omogućuje savršeno bojanje tkiva za analize
 Da ne bude toksičan za ljude i životinje
 Da mu cijena bude prihvatljiva
 Idealan fiksativ NE postoji

5. 3.Postupak fiksacije
 Isključivo uporaba formaldehida ne daje dobre rezultate. Za optimiziranje
fiksacije kadavera i pojedinačnih organa potrebno je formaldehid kombinirati s
drugim agensima. Važno je imati na umu da se pojedini opisani protokoli ne
mogu univerzalno rabiti za fiksaciju kadavera i organa, već postoje
specijalizirani protokoli samo za kadavere, odnosno samo za izolirane organe.
Većina fiksativa na bazi formaldehida značajno mijenjaju prirodnu boju tkiva u
sivkasto-žućkastu nijansu. Razvijena je nekolicina protokola kojima se postiže
zadovoljavajuće očuvanje prirodne boje tkiva
 U nastavku slijede primjeri protokola koji se rabe za očuvanje pojedinih
izoliranih organa, odnosno za fiksaciju čitavoga kadavera
 Kaiserlingov se protokol rabi za očuvanje pojedinih izoliranih organa u svrhu
nastave. Prednost je ovoga protokola mogućnost očuvanja približno prirodne
boje tkiva
 Priprema otopina:
 Kaiserling I: 85 g kalijeva acetata, 45 g kalijeva nitrata, 4800 mL formalina
(3-4%)
 Kaiserling II: etilni alkohol, 80-95%
 Kaiserling III: 200 g kalijeva acetata, 300 mL glicerina, 900 mL vodovodne
vode
 Protokol:
 Fiksirajte organ u otopini Kaiserling I jedan do pet dana, ovisno o veličini
organa, odnosno debiljini stijenke. Ako se radi o većem organu (primjerice
jetra), preporučuje se injicirati fiksativ izravno u parenhim. Fiksacija u
Kaiserlingu I uzrokuje dekolorizaciju tkiva. Zatim organ premjestite u
otopinu Kaiserling II na nekoliko sati – u njoj će kiseli hematin prijeći u
alkalni hematin, koji aproksimira boju hemoglobina i daje organu priblližno
prirodno obojenje. Preparat treba ostaviti u Kaiserlingu II dok se ne
postigne zadovoljavajuće obojenje. Ako se preparat ostavi u ovoj otopini
duže, dolazi do nepovratne dekoloracije tkiva. Organ se čuva u otopini
Kaiserling III

6.  Standardizirana formula za fiksaciju kadavera po Pretoriusu jest prilagođena formula
po Woodburnu i Lawrenceu (1952.), a služi za pripremu tijela za disekciju u svrhu
nastave. Formula se empirijski pokazala vrlo uspješnom jer uporabom ovoga protokola
ne dolazi do porasta gljivica na kadaveru. Prednosti ovoga protokola su niska cijena i
zadovoljavajuća trajnost kadavera. Glavni je nedostatak smećkasto obojenje tkiva
 Priprema fiksativa:
- 96% etanol
- Formalin (3-4%) 500 mL
- Vodovodna voda 750 mL
- 80% tekući fenol 3,5 L
 Protokol:
- Pripremljeni se fiksativ pomoću crpke injicira u radijalnu arteriju pod
tlakom od 1 do 1.5 kPa, sve dok se kadaver potpuno ne ispuni. Potrebno
je oko 25 L fiksativa za kadavera od 60 kg
 Održavanje:
- Kadaver vrlo brzo može propasti ako se nepravilno održava i pohranjuje.
Pravilna pohrana uključuje zatvaranje kadavera pokrivenog tkaninom
umočenom u humektant u plastičnu vreću te pohranu u hladnoj
prostoriji. Održavanje podrazumijeva redovito prskanje humektantom
tijekom rada na kadaveru.
 Priprema humektanta:
- Glicerin – 250 mL
- 80% tekući fenol – 250 mL
- Vodovodna voda – do 1 L

7. Reference
 Fox CH, Johnson FB, Whiting J, Roller PP. Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem. 1985
Aug; 33(8):845-53.
 Grizzle WE, Fredenburgh JL, Myers RB. Fixation of tissues. In: Bancroft JD, Gamble M, editors.
Theory and Practice of Histological Techniques. 6th ed. Philadelphia, USA: Elsevier; 2008. pp.
56–63.
 Kiernan JA. Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde and glutaraldehyde: What they are
and what they do. Microscopy Today. 2000;1:8–12.
 International Agency for Research on Cancer. IARC Monographs on the Evaluation of
Carcinogenic Risks to Humans, Volume 88 (2006): Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-
Butoxypropan-2-ol.
 Brenner, E. (2014). Human body preservation–old and new techniques. Journal of anatomy,
224(3), 316-344.
 Pulvertaft, RJV. (1950). Museum techniques: a review. Journal of clinical pathology, 3(1), 1.
 Waters, BL. (2009). Museum techniques. Handbook of Autopsy Practice, 151-156.
 Pretorius, WF. (1997). Formula for embalming of cadavers for student dissection and the
modification thereof for plastination. J mt Soc Plastination, 9(2), 28-30.
 Thavarajah R, Mudimbaimannar VK, Elizabeth J, Rao UK, and Ranganathan K. Chemical and
physical basics of routine formaldehyde fixation. J Oral Maxillofac Pathol. 2012 Sep-Dec, 16(3):
400–405.