1. Bordetella pertussis ViraStripe® IgG, IgA Диагностический набор для определения IgG, IgA
Иммунодиагностический метод для качественного обнаружения специфичных IgG-, или IgA антител к Bordetella pertussis в человеческой
сыворотке.
Bordetella pertussis ViraStripe® IgG, IgA использует специфичные антигены Bordetella: нитевидный гемагглютинин (FHA) и токсин коклюша (PT)
Каждая полоска имеет интегрированную систему контроля, включая контроль сыворотки, конъюгат-контроль и пороговый контроль.
IgG диагностический набор 50 тестов:
Bordetella pertussis ViraStripe® № продукта: V-BPSGOK
IgA диагностический набор 50 тестов:
Bordetella pertussis ViraStripe® № продукта: V-BPSAOK
20 µl сыворотки
Исследуемый образец:
90 минут
Время проведениятеста:
около 12 месяцев при 2-8 °C
Хранение/Стабильность:
Компоненты комплекта
50 Полоски с антигенами, полоски из нитроцеллюлозы с системой контроля и специфичными антигенами Bordetella в аналитической секции;
код полоски: BP, пронумерованные от 1-50
(№ продукта: V-BPSBAS)
9 мл Конъюгат щелочной фосфатазы с антителами против человеческого IgG
или IgA, 10-кратный концентрат (№ продукта: V-UVNG/AKI)
100 мл Буфер для разведения/промывки, 10-кратный концентрат (№ продукта: V-UVNUWP)
1 уп. Порошок для разведения/промывки, 5г (№ продукта: V-UVNUMP)
90 мл Раствор хромоген/субстрата, готовый к использованию (№ продукта: V-UVNUCS)
1 шт. Инструкции по использованию диагностического набора Bordetella pertussis ViraStripe® IgG, IgA
2 шт. Протокол оценки Bordetella pertussis ViraStripe® IgG, IgA с изображением полоски положительного контрольного образца (PC BP)
Буфер для разведения/промывки, порошок для разведения/промывки, раствор хромоген/субстрата взаимозаменяемы между различными ViraStripe
®, или ViraBlot ® тестами.
Доступны дополнительно:
0,33 мл B. pertussis IgG Положительный контроль, человеческая сыворотка, готовая к использованию (№ продукта: V-BPSGPK)
0,33 мл B. pertussis IgA Положительный контроль, человеческая сыворотка, готовая к использованию (№ продукта: V-BPSAPK)
0,33 мл B. pertussis IgG, IgM, IgA Отрицательный контроль, человеческая сыворотка, готовая к использованию (№ продукта: V-BPSPNK)
9 мл Конъюгат щелочной фосфатазы с антителами против человеческих IgM, 10x концентрации, жидкий (№ продукта: V-UVNMKI)
Хранение и стабильность реактивов
Полоски антигена: Полоски с антигенами: полоски в закрытых пакетах устойчивы до истечения срока годности, если хранятся при 2 - 8°C. Пакеты с
неиспользованными полосками хранить плотно закрытыми.
Конъюгат, 10-кратный концентрат: устойчив до истечения срока годности, если хранится при 2-8°C.
Рабочий раствор: использовать немедленно.
Буфер для разведения/промывки: концентрат и порошок:устойчив до истечения срока годности если хранится при 2 - 8°C.
Рабочий раствор буфера: пригоден к использованию 2 недели, если хранится при 2 - 8°C. Рабочий раствор буфера может быть сохранен в
определенных количествах в течение более длительного времени в замороженном состоянии.
Раствор хромоген/субстрата: устойчив до истечения срока годности, если хранится при 2 - 8°C. Хранить в темноте! Избегать сильного освещения.
Подготовка реактивов и образца
Перед использованием доведите все компоненты теста до комнатной температуры (20-25°C).
Аккуратно отделите требуемое количество полосок при помощи пинцета. Касайтесь полосок пинцетом только в области маркировки.
Рабочий раствор буфера для разведения/промывки: чтобы подготовить рабочий раствор буфера, растворите 10-кратный
концентрат 1:10 дистиллированной водой (100 мл концентрата + 900 мл дистиллированной воды), и добавьте порошок для
разведения/промывки до полного растворения. Поместите рабочий раствор буфера на 10 - 15 минут на магнитную мешалку, pH =
7,5±
Конъюгат, рабочий раствор:
Растворите необходимое количество 10-кратного концентрата согласно таблице 1 в течение первой процедуры промывки (шаг 7
проведение теста).
Другие реактивы: готовы к использованию.
Образцы пациента:
Используйте 20 мкл неразведенной сыворотки пациента на одно испытание.
Дополнительный доступный контроль:
Используйте 100 мкл каждого из контролей (слабоположительный, положительный и отрицательный) неразведенным на серию
испытаний.
1
3. Проведение теста:
1. Ополоснуть инкубационную ванну буфером для Маркировать подносы несмываемым маркером. Удалять
разведения/промывки и удалить раствор. загрязнения кратким ополаскиванием буфером.
2. Разместить по одной полоске в каждый канал. Разместить полосы в каналы подноса инкубации, одна
полоса для каждого образца, соответственно для
контроля, номером вверх. Используйте пинцет.
3. Добавить в каждый канал по 1.5 мл буфера и Визуально удостоверьтесь, что полосы полностью
инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре смочены и не плавают частично на поверхности буфера.
на шейкере. Используйте платформу шейкера с частотой колебаний
40 циклов/мин.
4. Добавить 20 мкл каждого образца пациента или 100 мкл Пипеткой наносите контроль и образцы
каждого контроля соответственно непосредственно на номер полоски, в то время как
происходят колебания платформы.
5. Инкубировать при колебаниях в течение 30 минут Работайте при комнатной температуре (20 - 25°C).
6. Декантировать жидкость Полоски прилипают к подносу инкубации. Удалите
оставшуюся жидкость тщательным осушением подноса
инкубации фильтровальной бумагой.
7. 3x5 минут промывка: добавьте разбавитель/промывной Промойте платформу шейкера. При промывке готовят
буфер 1.5 мл, выдержите 5 мин., декантируйте жидкость рабочий раствор конъюгата, как описано в таблице
полностью. растворения конъюгата. Осушите инкубационный
поднос фильтровальной бумагой, чтобы удалить
оставшуюся жидкость.
8. Пипеткой добавить 1,5 мл рабочего раствора конъюгата в Удостоверьтесь, что полоски антигена полностью
каждый канал покрыты конъюгатом. Визуально проверьте, что
полоски частично не плавают на поверхности буфера.
9. Инкубировать в течение 15 минут на шейкере, при Полоски прилипают к инкубационному подносу.
комнатной температуре. Удалите оставшуюся жидкость, тщательно осушая
инкубационный поднос фильтровальной бумагой.
10.Декантировать конъюгат. Полоски прилипают к инкубационному подносу.
Удалите оставшуюся жидкость, тщательно осушая
инкубационный поднос фильтровальной бумагой
11. Повторить шаг 7 - 3 раза. .
12. Добавить 1,5 мл дистиллированной воды, инкубировать в Визуально проверьте, что полоски частично не плавают
течение 1 минуты на шейкере, при комнатной температуре. на поверхности буфера.
13. Инкубировать в течение 1 минуты при колебаниях. Работайте при комнатной температуре (20 - 25°C).
14. Декантировать жидкость Полоски прилипают к инкубационному подносу.
Тщательно осушите поднос фильтровальной бумагой.
15. Добавить 1,5 мл раствора хромоген/субстрата. Визуально проверьте, что полоски частично не плавают
на поверхности раствора хромоген/субстрата.
16. Инкубировать на шейкере: 5-15 минут Остановите реакцию, как только полоса порогового
контроля станет ясно видима. Предостережение:
избегайте превышения срока инкубации, что ведет к
появлению фоновых пятен!
Внимание!:Полоса порогового контроля IgG: OspC (25
kD)
17. Остановить реакцию, декантируя жидкость. Удалите остающуюся жидкость, тщательно осушая
инкубационный поднос фильтровальной бумагой.
18. Промыть 3 раза с 1,5 мл дистиллированной воды. Вне времени инкубации.
19. Высушить полоски для интерпретации результатов. Удалить полоски из каналов во влажном состоянии,
используя пинцет. Разместить влажные полоски на
фильтровальной бумаге, высушить на воздухе перед
интерпретацией данных.
3
4. Принцип теста.
При помощи Bordetella pertussis ViraStripe® cпецифичные к Bordetella pertussis антитела могут быть определены в человеческой
сыворотке.
Специфические антитела связываются с установленным антигеном на полоске во время инкубации сыворотки. Конъюгат щелочной
фосфатазы связывается с комплексом антиген-антитело во время своей инкубации. Щелочная фосфатаза конвертирует
хромоген/субстрат и окрашивает комплекс антиген-антитело на полоске в фиолетовый цвет.
Процедуры промывки между инкубацией сыворотки, конъюгата и хромоген/субстрата удаляют непрореагировавшие реактивы.
Иммунологический тест с интегрированной системой контроля: зеленая линия разделения делит полоску на секцию контроля и
аналитическую секцию. Секция контроля содержит контроль сыворотки, три конъюгат-контроля (IgG, IgA, IgM) и пороговый
контроль. Аналитическая секция содержит специфичные антигены Bordetella pertussis.
Оценка результатов теста
Подготовить протокол оценки: Регистрируйте данные в протоколе оценки. Приклейте или закрепите
1.
пленкой полоски на протокол. Поместите зеленую линию разделения
точно на напечатанную линию разделения в протоколе.
Действиельность
теста
Действиельность Тест считается действительным, если полосы функционального контроля,
2.
теста конъюгат контроля и порогового контроля становится четко видимыми на
каждой полоске. Если нет реакции по крайней мере одного из них, тест
считается недействительным и должен быть проведен повторно при
точном соблюдении инструкций.
Не оценивайте недействительные полоски.
Оценка образцов пациента Протокол оценки включает в себя напечатанную полосу положительного
3.
контроля (обозначенную как PC TP). Выровняйте разделяющие линии на
полоске пациента и на полоске положительного контроля. Позиция
полосы показана на полоске положительного контроля. Определите
полосы на полоске пациента и отметьте их в протоколе. Неопределенные
полосы не оцениваются.
Оценка полос с помощью порогового В соответствии с лабораторными качественными методиками, пороговый
4.
контроля: контроль должен использоваться для каждой серии испытаний (11).
Полоса порогового контроля интегрирована в контрольной секции каждой
полоски диагностического теста Bordetella pertussis Virastripe.
Интенсивность полосы порогового контроля отражает границу, по
которой оценивают полосы.
Полосу считают реактивной, если ее интенсивность равна или выше, чем
интенсивность полосы порогового контроля. Четкие полосы отмечаются
знаком X в протоколе. Полосу считают нечеткой, если ее интенсивность
меньше, чем интенсивность полосы порогового контроля.
Нечеткие полосы отмечают знаком (X) в протоколе.
4
5. Оценка образцов пациента.
Полосы нужно рассматривать как симптомы болезни. Для заключительного клинического диагноза все результаты этого и других
испытаний должны быть соотнесены с клинической историей, эпидемиологическими данными и другими данными, доступными
лечащему врачу.
Антиген PT (28 kD) характеризуется как специфичный для Bordetella pertussis. Антиген FHA (220 kD) характеризуется как
специфичный для разновидностей Bordetella. Могут появиться дополнительные неохарактеризованные полосы, но их не
оценивают.
Bordetella pertussis ViraStripe®:
Результат Интерпретация
Идентифицированные полосы / kD
Нет никаких полос Нет никаких поддающихся обнаружению специфичных
Отрицательный
антител к антигенам Bordetella pertussis.
Низкие титры антител к разновидностям Bordetella, или
Нечеткая полоса от: FHA (220 kD)
Неясный соотв. Bordetella pertussis, поддающиеся обнаружению. В
Нечеткая полоса от: PT (28 kD)
случае клинического подозрения на инфекцию Bordetella,
для контроля проверьте второй образец спустя 2-3 недели.
Четкая полоса от: FHA (220 kD) Обнаружены антитела к разновидностям Bordetella.
Положительный
ОБнаружены антитела к Bordetella pertussis.
Четкая полоса от: PT (28 kD) Положительный
Характеристики полос Bordetella pertussis ViraStripe
Молекулярный вес Антиген Специфичность антител
220 kD FHA, Специфичен для разновидностей Bordetella: IgG-антитела к FHA появляются у 80-
Нитевидный 90% инфицированных пациентов, IgA-антитела к FHA появляются у 50-60%
Гемагглютинин пациентов (11). Данные, содержащиеся в литературе о реакции IgM являются
противоречивыми.
Антитела к FHA развиваются после прививки и после инфицирования Bordetella
pertussis или Bordetella parapertussis.
28 kD PT, Специфичен для Bordetella pertussis: IgG-антитела к PT появляются у более чем
B-олигомер 90% инфицированных пациентов, IgA-антитела к PT появляются у 40-50%
(Подгруппа S1) пациентов (11). Данные, содержащиеся в литературе о реакции IgM являются
токсина коклюша противоречивыми.
Антитела к PT развиваются после прививки и после инфицирования Bordetella
pertussis, но не после инфицирования Bordetella parapertussis
5
6. Клиническая корреляция антител Bordetella pertussis
1. IgG-антитела появляются спустя 15-20 дней с начала болезни (Stadium catarrhale). На начальной стадии инфекции они еще не
поддаются обнаружению (13). В случае подозрения на недавно начавшуюся инфекцию должны быть проверены IgM- и IgA-
антитела. В этом случае, второй образец должен быть проверен некоторое время спустя. IgG-антитела часто продолжают
существовать спустя более чем 10 лет, или по крайней мере спустя 6 месяцев с момента начала болезни (13,14). Поэтому
пациенты, находящиеся на стадии болезни 2 (Stadium convulsivum) или 3 (Stadium decrementi), главным образом положительно
реагируют на IgG-антитела. Титры антитела устойчиво уменьшаются при выздоровлении (12). Младенцы могут получать IgG-
антитела от матери через плаценту (11, 15).
2. IgM-антитела обычно появляются спустя 8-15 дней с момента начала болезни (13). Они достигают своей самой высокой
концентрации спустя порядка 8-10 недель с момента начала болезни (12). IgM-антитела поддаются обнаружению у более чем 90%
инфицированных пациентов между 20 и 50 днями с момента начала болезни. IgM-титр может подняться после прививки (10). В
отдельных случаях IgM появляется у младенцев и взрослых только в ослабленной форме, с запозданием или вообще не
появляется (14). Есть признаки того, что IgM-реакция на FHA и PT возможно меньше, чем на неспецифичные антигены Bord.
pertussis; в отличие от IgG и IgA (18).
3. IgA-антитела почти исключительно поддаются обнаружению после спонтанной инфекции и только в очень редких случаях
после активной прививки (14). IgA поддается обнаружению главным образом не дольше чем 6 месяцев после инфицирования
(13). IgA-антитела достигают своей самой высокой концентрации спустя около 8-10 недель с момента начала начала болезни (12).
IgA не развиваются на первых месяцах жизни младенцев, или развиваются только с низкой амплитудой. Поэтому младенцев
следует проверять на IgM-антитела (10).
Есть признаки существования специфичных антител pertussis в нормальной совокупности, вызванного субклиническими
инфекциями (10).
4. Обнаружение токсина pertussis (28 kD9 является специфичным для Bordetella pertussis. Корреляция этого антигена неизвестна
для других разновидностей Bordetella и gra-отрицательных бактерий (11, 13, 15, 16).
5. Препараты и терапия с использованием антител могут привести к неспецифическому иммунному ответу (19).
Таблица 2: Результаты Bordetella pertussis ViraStripe® IgG, IgA и диагностическое исследование
IgG IgM IgA Окончательный Интерпретация полной комбинации результатов IgG,
IgM и IgA ViraStripe®
результат
исследования
Не обнаружено никаких антител к Bordetella. Нет
указаний на инфекцию Bordetella, соотв. нет титра
антитела после прививки. В случае клинически
Отрицательный
∅ ∅ ∅ обоснованного подозрения на инфекцию Bordetella,
проверьте второй образец спустя 10-14 дней, вместе с
первым образцом.
Обнаружены IgG-антитела к Bordetella. Это может быть
Положительный вызвано титром антител после прививки или оставшимся
∅
+ ∅
титром антител после перенесенной инфекции.
Положительный Обнаружены IgA- антитела и/или IgM-антитела к
+
∅ ∅
Bordetella. Вероятна инфекция Bordetella в ранней стадии.
После прививки также есть IgM-антитела, IgA-антитела,
+ Положительный
∅ ∅ но только в очень редких случаях. Проверьте второй
образец спустя 2-3 недели, вместе с первым образцом на
+ + Положительный присутствие IgG-антител, IgM- и IgA-антител.
∅
Положительный Обнаружены соответствующие антитела к Bordetella.
∅
+ +
Вероятна острая инфекция Bordetella. После прививки
также присутствуют IgM-антитела, а IgA-антитела –
+ + Положительный
∅ только в очень редких случаях. Проверьте второй
образец спустя 2-3 недели, вместе с первым образцом,
+ + + Положительный для обнаружения IgG-, IgM- и IgA-антител.
6
7. Параметры выполнения
Всесторонняя совокупность данных по аналитической и диагностической чувствительности, специфичности и воспроизводимости
испытаний доступна при запросе.
Предупреждения и предосторожности
1. Все человеческие компоненты сыворотки в наших изделиях были проверены на отсутствие ВИЧ - и HCV-антител и Hbs-антигена.
Однако все человеческие компоненты диагностического теста, а также образцы пациентов нужно считать потенциально
инфекционными и обращаться с соответственными предосторожностями..
2. Не набирать пипетку ртом.
3. Носить одноразовые перчатки при работе.
4. Не есть, не пить и не курить в рабочей зоне.
5. Конъюгат содержит азид натрия 0,1 %, контроль и буфер для разведения/промывки содержат 0,02 % тимеросал:
Внимание: вреден для здоровья.
Промыть большим количеством воды после контакта с кожей или глазами. Ядовит при попадании внутрь! (см. листы данных о
безопасности).
6. Раствор Хромоген/субстрата содержит BCIP и нитросиний тетразолий. Избегайте контакта с кожей и глазами. В случае контакта с
кожей и глазами промыть большим количеством воды.
7. Образцы и все потенциально загрязненные материалы должны быть дезактивированы, используя установленные лабораторные
методы, например путем автоклавирования при 121,5°C в течение 20 минут. Жидкие отходы смешать с гипохлоритом натрия в
окончательной концентрации 1%-гипохлорита натрия. Выдержать 30 минут для окончательной дезинфекции.
Литература:
1. Burstyn, D.G., L.J. Baraff, M.S. Peppler, R.D. Leake, J. St. Geme, Младший, и C.R. Manclark. 1983. Серологическая реакция на
нитевидный гемагглютинин и лимфоцитарный лейкоцитоз, стимулирующий токсин Bordetella p.. Infect. Immun. 41:1150-1156. 2.
Freidman, R.L. 1988. Pertussis: заболевание и новые диагностические методы. Clin. Microbiol. Rev. 1:365-376. 3. Gilchrist, M.J.R., 1990.
Лабораторный диагноз pertussis. Clin. Microbiol. Newslet. 12:49-53. 4. Gilchrist, M.J.R., 1991. Bordetella p. 471-477. В A. Balows, W.J.
Hausler, младший, K.L. Herrnann, H.D. Isenberg, и H.J. Shadomy (редактор)., Руководство для клинической микробиологии, 5-ый
редакция, Американское Общество Микробиологии, Вашингтон, округ Колумбия 5. Cherry, J.D. 1984. Эпидемиология pertussis и
иммунизации pertussis в Великобритании и США: сравнительное изучение Curr. Prob. Pediatr. 14:1-78. 6. Manclark. C.R., и J.L. Cowell.
1984. Pertussis, p. 60-106. В R. Germanier (редактор). Противобактериальные вакцины. Academic Press, Inc. Орландо, Fla. 7. Nagel, J., и
E.J. Poot-Scholtens. 1983. IgA-антитело сыворотки как индикатор инфекции. J. Медиана. Microbiol. 16:417-426. 8. Olson, L.C. 1975.
Pertussis. Терапия (Балтимор) 54:427-469. 9. Redd, S.C., H.S. Rumschlag, R.J. Biellik, G.N. Sanden, C.B. Reimer, и M.L.Cohen. 1988.
Иммуноблот-анализ гуморальной реакции во время инфекции Bordetella p. или иммунизацией с вакциной коклюша-столбняка-
дифтерии. J. Clin. Microbiol. 26:1373-1377. 10.. Hahn, H., Falke, D., Klein, P., 1991 Mediz. Mikrobiologie, Springer Verlag, Kap. 12,
Bordetellen. 11. BRUCE D. Meade, Chrisanna M. Mink, и Charles R. Manclark, 1994, Серодиагностика Pertussis, Центр Биопрепаратов и
Исследования, Фармкомитет, Bethesda, Штат Мэриленд 20892. 12. Wirsing von König, C.H., 1985, Labordiagnostik des Keuchhustens, GI
Labor-Medizin 6:407-410. 13. Rapp J., Enders G., 1988, Diagnostische Verfahren zum Nachweis einer Pertussis-Infektion, Ärztl. Lab.. 34:181-
189. 14. Biber M., Enders G. Pertussisverdacht und Labordiagnose, 1988, Ärztl. Lab.. 34:97-102. 15. Guiso N. Grimpel E., Anjak I. Bégué P.,
1993, Вестернблот-анализ реакций антитела инфекции pertussis у младенцев, Eu. d. Clin. Microbiol. Infect. Dis., Vol 12. Номер 8:596-600.
16. STEPHAN К., 1993, Infektionskrankheiten. Keuchhusten Teil I, mta 8:686-689. 17. F. Zepp и другие., 1996, Клеточный иммунитет,
специфичный для pertussis, у младенцев после прививки трехкомпонентной бесклеточной вакциной Pertussis, Инфекцией и
Иммунитетом 64, Номер 10: 4078-4084. 18. Wirsing von König, C.H., 1996, Persönliche Mitteilung. 19. THOMAS L., 1995, Labor und
Diagnose, Med. Verlagsgesellschaft Marburg. 20. Abel Ulrich „Die Bewertung diagnostischer Tests“, Hippokrates, Stuttgart (1993). 21. H.- W.,
MiQ: Qualitätsstandards in der mikrobiologisch- infektiologischen Diagnostik 12-2000: Lyme –Borreliose, URBAN & FISCHER, 2000. 22.
RILI-BÄK: Bäk-Richtlinie zur Qualitätssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen, (1.1.2002),
www.bundesaerztekammer.de.
7
