I batteri patogeni
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Patogenesi.        Le proteine effettrici che sono traslocate        cooperano per riorganizzare il citoscheletro della   ...
Patogenesi.La proteina IcsA (intracellular spread, disseminazione intracellulare) è una outer membrane proteinnota anche c...
Patogenesi di Shigella In seguito all’invasione della cellula ospite Shigella sintetizza due proteine regolatrici codifica...
Patogenesi di ShigellaLa regolazione della trascrizione del gene icsA dipende anche dalla proteina nucleoide H-NS, che aba...
La curvatura del promotore di virF determina l’attivazione                                    trascrizionale da parte di H...
Shiga toxinsLe Shiga toxins (Stxs) sono enterotossine espresse da Shigella dysenteriae sierotipo 1 e alcuni ceppidi E. col...
Shiga toxinsLe subunità B si legano a un glicolipide di membrana delle cellule eucariotiche, ilglobotriaosilceramide (Gb3)...
Figura 7.12
Figura 7.13
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Tabella 7.5
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  1. 1. I batteri patogeni
  2. 2. I batteri patogeni Gli agenti patogeni sono in continua evoluzione, perché i batteri e l’ospite, così come le condizioni ecologiche che prevedono la loro interazione, subiscono continui cambiamenti. Gli agenti patogeni emergono e perdono virulenza nel corso tempo. Malattie infettive emergenti sono causate da organismi che esistono già come opportunisti o veri patogeni e che acquistano ulteriori elementi di DNA codificanti per un determinante di virulenza. La transizione verso la patogenicità può essere causata da cambiamenti nei batteri, o, in alternativa, nell ’ ospite divenuto sensibile, o per l ’ acquisita capacità di sopravvivere da parte dei batteri nell’uomo.Una ricerca sul sito di PubMed del National Institute of Heath degli Stati Uniti(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) alla voce bacterial pathogenicity listaquasi 60 000 articoli scientifici.
  3. 3. SalmonellaIl nome Salmonella deriva dal nome del veterinario americano DanielElmer Salmon, ma il vero scopritore di tale batterio, fu il suoassistente, il patologo Theobald Smith nel 1885.Smith e Salmon identificarono l’agente causale del colera nel maiale,e lo chiamarono Hog-cholera bacillus. Nel 1900 lo scienziato francese Joseph Léon Lignières propose di sostituire il nome Hog-cholera bacillus con Salmonella in onore di Salmon (solo successivamente si e scoperto che Salmonella cholerae- suis non è la vera causa della peste suina, che è invece una malattia virale). 3
  4. 4. Salmonella HabitatLhabitat principale delle salmonelle è il tratto intestinale delluomo e di altri animali sia asangue caldo che freddo.I serbatoi animali più comuni sono polli, tacchini, maiali e decine di altri animali domestici eselvatici.Attraverso le feci dell’animale, il batterio viene diffuso nell’ambiente (acqua, suolo, piante,successivamente ingerite) causando notevoli perdite di bestiame e rappresentando un graveproblema di salute pubblica.Nell ’ uomo la salmonellosi di solito è un ’ intossicazione alimentare autolimitante(gastroenterite), e solo occasionalmente si manifesta come una grave infezione sistemica Al genere Salmonella appartengono(febbre tifoide) che richiede immediato trattamento antibiotico. batteri Gram- della famiglia delle Enterobacteriaceae. Salmonella è un bacillo di 0.7 - 1.5 x 2-5 μ in grado di crescere sia in condizioni aerobiche che anaerobiche.Le salmonelle sono prive di capsula e sono asporigene.Le salmonelle crescono in modo ottimale a 37°C suterreni di coltura standard, dove si sviluppano piccolecolonie di 2-4 mm di diametro, lisce, brillanti e di coloreomogeneo. 4
  5. 5. Salmonella HabitatAlcune caratteristiche metaboliche di Salmonella sono lutilizzo di citrato come unica fonte dicarbonio e la produzione di gas a partire da glucosio.Generalmente, non fermentano il lattosio a eccezione di alcuni ceppi di S. diarizonae.Come per la maggior parte dei batteri, il loro pH ottimale di crescita è intorno alla neutralità (pH 6.5- 7.5), anche se possono crescere in una vasta gamma di pH (da 4.5 a 9.5) a seconda delle altrecondizioni ambientali. La temperatura più bassa alla quale è stata isolata Salmonella è di 2°C e la più alta è di 54°C(per S. typhimurium). La stragrande maggioranza delle salmonelle è mobile grazie alla presenza di flagelli peritrichi (flagelli distribuiti su tutta la superficie cellulare,) a eccezione di rari sierotipi non mobili come S. gallinarum e S. pullorum. Come altre cellule flagellate, le salmonelle mobili possono perdere la loro capacità di sviluppare flagelli sotto leffetto di stress sub-letali, quali la refrigerazione o l ’ alta temperatura. 5
  6. 6. Salmonella Struttura antigenica•Il genere Salmonella presenta tre tipi di antigeni principali:Antigeni somatici (antigene O, o dellaparete cellulare);Antigene capsulare (o di superficie);Antigene Flagellare (H).Gli antigeni somatici rappresentano i componenti più esterni del lipopolisaccaride (LPS), chesono stabili al calore e resistenti allalcool.Sono formati da due parti:•la prima, più interna, è composta da cinque carboidrati ed è comune a tutte le Enterobacteriaceae;•la seconda, più esterna, è formata da catene saccaridiche dalle quali dipende la diversità degliantigeni somatici.Gli antigeni capsulari (o di superficie) sono associati alla capsula che sono identificati con Studi di cross-assorbimento hanno individuato circa 67 diversi antigeni O polisaccaridica e sononumeri romani. sierotipi di Salmonella e in altri generi di batteri enterici (per esempio, E. coli epresenti in alcuniKlebsiella):•l’antigene Vi (Vi sta per virulenza, in quanto i sierotipi che lo possiedono risultano più virulenti);l’antigeni K (capsulare) di altri enterobatteri corrisponde all’antigene Vi delle salmonelle.Tali antigeni possono mascherare gli antigeni O impedendo l’agglutinazione del batterio conantisieri O.Su circa 2.500 sierotipi di Salmonella, questo antigene è presente solo in tre sierotipi: Typhi,Paratyphi C, e Dublino.Alcuni ceppi di questi sierotipi possono anche non avere lantigene Vi. 6
  7. 7. Salmonella Struttura antigenicaAntigene Flagellare (H)In Salmonella si conoscono circa 35 antigeni flagellari (la flagellina è una proteina termolabile chesi organizza in un cilindro cavo per formare il flagello).Salmonella è unico tra i batteri enterici in quanto, la maggior parte dei suoi sierotipi può esprimerealternativamente due flagelli con diversa specificità antigenica (Fase 1 o Fase 2).Poche salmonelle (a esempio, Enteritidis, Typhi) producono flagelli con un unico tipo di flagellina equindi con la stessa specificità antigenica (Antigene H monofasico);Salmonelle monofasiche si possono ottenere anche attraverso linattivazione del gene che codificaper la Fase 1 o per la Fase 2.Pochissime specie hanno 3 fasi sierologiche H e sono dette “trifasiche”, mentre, in rari casi lesalmonelle possono perdere tale struttura antigenica H, diventando immobili. 7
  8. 8. Salmonella TassonomiaLa parete cellulare dei microrganismi contiene una serie di proteine elipopolisaccaridi con molte varianti strutturali e molecolari.Ognuna di queste strutture può fungere da antigene e reagire con unanticorpo.Facendo reagire un microrganismo con diversi anticorpi si ottiene la suatipizzazione sierologica (stabilire cioè quali antigeni sono presenti su queldeterminato microrganismo).Sulla base della presenza di tali antigeni e in base a alcuni caratteribiochimici, una singola specie può essere suddivisa in centinaia o anchemigliaia di sierotipi diversi. 8
  9. 9. Salmonella TassonomiaS. enterica è suddivisa ulteriormente in sei sottospecie o gruppi (che sidifferenziano biochimicamente) e più di 2.500 sierotipi.Salmonella enterica sottospecie enterica, rappresenta quasi il 99% dellesalmonelle isolate nella pratica medica.Oggi il sierotipo non è più identificativo di una specie, peraltro i nomi sonomantenuti solamente per i sierotipi appartenenti a S. enterica subsp. enterica(per esempio, S. Typhimurium), mentre quelli ascrivibili alle altre sottospecievengono identificati attraverso le relative formule antigeniche. 9
  10. 10. Classificazione della Salmonella
  11. 11. Salmonella PatogenesiSalmonella enterica è soprattutto un patogeno gastrointestinale, che ha lacapacità di provocare un ampio spettro di malattie che vanno da unainfiammazione gastrointestinale locale autolimitante, a malattie sistemicheletali come la febbre tifoide.Lesito della malattia dipende principalmente dal sierotipo di S. enterica.S. enterica sierotipo Typhi e, in misura minore, S. enterica sierotipo Paratyphicausano infezioni sistemiche che rappresentano un grave problema di salutenei paesi emergenti e negli individui immunocompromessi (AIDS).Le infezioni gastrointestinali da Salmonella sono un problema globalecausato soprattutto da sierotipi come Enteritidis e Typhimurium. 11
  12. 12. Salmonella Patogenesi In seguito all ’ ingestione per via orale, Salmonella infetta le cellule dellepitelio gastrointestinale (cellule non fagocitiche), e in particolare colonizza lintestino tenue Sebbene la maggior parte delle infezioni da Salmonella rimangono localizzate a livello intestinale, in cui la stimolazione della risposta infiammatoria contribuisce alla diarrea, nel caso del tifo la Salmonella riesce a traslocare attraverso lo strato epiteliale intestinale e a raggiungere il vano sotto- epiteliale dove può interagire con le cellule dendritiche e i macrofagi. 12
  13. 13. SalmonellaSalmonella essendo anche un patogeno intracellulare facoltativo sia in grado di sopravvivere ereplicare anche all’interno di tali cellule fagocitiche, nelle quali non entra nel citoplasma ma risiede nelfagosoma, facendo fronte a cambiamenti ambientali quali la rapida diminuzione del pH e la carenzanutrizionale, per poi diffondere al fegato e alla milza attraverso il flusso sanguigno e il sistema linfatico.
  14. 14. Isole di Patogenicità e Sistemi di Secrezione di Tipo IIILa patogenesi delle malattie provocate da Salmonella spp. dipende dalcoordinamento dell’espressione temporale di numerosi fattori di virulenza, Isole diPatogenicità e Sistemi di Secrezione di Tipo III codificati dalle isole di patogenicità(PAI) che nel corso dellevoluzione Salmonella ha acquisito, anche da specie affini,attraverso eventi ripetuti di trasferimento genico orizzontale (HGT).
  15. 15. Isole di PatogenicitàLa patogenesi delle malattie provocate da Salmonella spp. dipende dal coordinamentodell’espressione temporale di numerosi fattori di virulenza, Isole di Patogenicità e Sistemidi Secrezione di Tipo III codificati dalle isole di patogenicità (PAI) che nel corsodellevoluzione Salmonella ha acquisito, anche da specie affini, attraverso eventi ripetuti ditrasferimento genico orizzontale (HGT).Le PAI possono avere sia una localizzazione cromosomiale che plasmidica e in Salmonellasono definite isole di patogenicità di Salmonella (SPI).Tra queste, SPI-1 e SPI-2 codificano per due distinti Sistemi di Secrezione di Tipo III(T3SS) chiamati T3SS-1 e T3SS-2.Questi sistemi rilasciano nella cellula ospite oltre 30 proteine specializzate (proteineeffettrici), che sono codificate dalle SPI e agiscono coordinatamente per•modificare il citoscheletro,•le vie di trasduzione del segnale,•il traffico di membrana della cellula ospite e•le risposte pro-infiammatorie dell’ospite.Ciò consente a Salmonella di•invadere le cellule epiteliali non fagocitiche,•stabilire e mantenere una nicchia intracellulare replicativa,•o vacuolo contenente Salmonella (SCV, Salmonella containing vacuole) e,•in alcuni casi, diffondere e causare malattie sistemiche.
  16. 16. Isole di Patogenicità e Sistemi di Secrezione di Tipo III Rappresentazione schematica degli stadi di infezione di Salmonella.SPI1 è necessario per linvasione di cellule ospiti non fagocitiche (invasione diretta), mentreSPI2 è essenziale per la sopravvivenza e replicazione dei batteri all’interno delle cellule fagocitiche.La trasmigrazione dei leucociti polimorfonucleati (PMN) contribuisce all’infiammazione intestinale.Gli effettori SPI-1 e SPI-2 non operano sequenzialmente e indipendentemente gli uni dagli altri, macooperano alla maturazione, posizionamento e replicazione degli SCV.I sierotipi di Salmonella associati a malattie sistemiche sono in grado di entrare nei macrofagi intestinali,inducendo la morte cellulare e/o utilizzandoli come veicolo per la diffusione al fegato e alla milza attraversoil flusso sanguigno e il sistema linfatico.
  17. 17. Isole di Patogenicità e Sistemi di Secrezione di Tipo IIII geni di SPI-1 sono espressi durante la tarda fase logaritmica in condizioni di alta osmolarità e bassatensione di ossigeno, tipiche dell’ambiente intestinale.In particolare, la funzione di SPI-1 è richiesta per le fasi iniziali della salmonellosi, cioè per lingresso diSalmonella in cellule non fagocitiche, innescando linvasione e la penetrazione dellepitelio gastrointestinale(sintomi diarroici).La funzione di SPI-2 è richiesta per le fasi successive del contagio, sopravvivenza e replicazione neifagociti, diffusione sistemica e colonizzazione degli organi dell’ospite.
  18. 18. Sistemi di Secrezione di Tipo II T3SS-1 Il T3SS-1 è un apparato multi-proteico costituito da più di 20 proteine altamente conservate, e comune a molti batteri patogeni Gram-. La regione centrale di questo sistema è una struttura macromolecolare conosciuta come il needle complex (il complesso dell ’ ago) che attraversa la parete batterica. I Sistemi di Secrezione di Tipo III hanno molte analogie con il corpo basale dei flagelli, suggerendo una relazione evolutiva tra questi due tipi di strutture. Il needle complex è composto da una base a più anelli e un sottile ago (un tubo rettilineo di circa 80 nm di lunghezza) formato da una singola proteina, PrgI (PhoP-repressed gene) che sporge verso lesterno della parete batterica e attraverso la quale vengono iniettate le proteine effettrici nel citoplasma della cellula ospite. L ’ anello associato alla membrana esterna del batterio (outer ring) che ha un diametro più piccolo ed è formato da 12-14 subunità della proteina InvG (secretin), mentre l ’ anello associato alla membrana interna (inner ring) ha un diametro maggiore ed è costituito da due anelli posti uno
  19. 19. Sistemi di Secrezione di Tipo II T3SS-1 Negli ultimi anni sono state identificate almeno 13 proteine effettrici iniettate dal T3SS-1 nelle cellule epiteliali dell’intestino: AvrA, SipA, SipB, SipC, SipD, SlrP, SopA, SopB, SopD, SopE, SopE2, SptP e SspH1. Alcune di queste proteine sono codificate da SPI-1 e altre da altre isole di patogenicità o altri loci cromosomici. Questo primo gruppo di effettori è fondamentale per l’ingresso dei batteri nelle cellule dei mammiferi, in quanto portano alla riorganizzazione dell’actina del citoscheletro della cellula ospite e ne deformano la membrana plasmatica. Per esempio, le proteine SipA e C (Salmonella invasion protein), legano l’actina raggruppandola in fasci nel punto di entrata del batterio. La proteina SopB (Salmonella outer protein B) è una fosfatasi fosfoinositide che de-fosforila la fosfatidil-inositolo- 4,5-bis-fosfato [PI(4,5)P2] a livello della membrana plasmatica alterandone la carica superficiale. SopB è anche considerata una enterotossina in quanto innalza i livelli di 1,4,5,6-tetrafosfato con conseguente perdita di ioni cloro e secrezione di fluidi nel lume intestinale. Il risultato finale dell ’ azione coordinata di queste proteine è la formazione di pseudopodi e increspature a livello della membrana della cellula ospite (membrane ruffling) che portano all ’ internalizzazione dei batteri, e quindi alla biogenesi degli SCV.
  20. 20. Sistemi di Secrezione di Tipo II T3SS-2 Successivamente all’invasione, attraverso T3SS- 2 viene rilasciato un secondo gruppo di effettori che cooperando con il primo gruppo, consentendo ai batteri di sopravvivere e replicare all’interno degli SCV e ne impediscono la fusione con i lisosomi. La posizione degli SCV, e la successiva fusione fagosoma-lisosoma è strettamente correlata ai microtubuli e alla loro polarità (le loro estremità negative e positive sono orientate rispettivamente dal centro verso la periferia della cellula). Gli organelli si muovono lungo i microtubuli grazie all ’ azione di proteine motrici tra le quali ricordiamo la dineina e la chinesina che fanno muovere gli organelli in senso centripeto oLa dineina è coinvolta nel trasporto retrogrado negli assoni rispettivamente. elementi del reticolo centrifugo e convoglia gliendoplasmatico, gli endosomi tardivi e i lisosomi fino al centro della cellula.La chinesina è associata al trasporto anti-retrogrado e convoglia i mitocondri, i lisosomi e un assortimentodi vescicole di membrana verso l’ER o verso la periferia della cellula.
  21. 21. Sistemi di Secrezione di Tipo II T3SS-2 La Figura mostra il secretion system apparatus (ssa, apparato di secrezione), il secretion system effectors (sse, effettori del sistema di secrezione) e lo chaperone ssc, e i due componenti A e B del secretion system regulator (ssr, regolatori del sistema di secrezione). Il sistema T3SS-2 è costituito da 31 geni organizzati in 4 operoni distinti. Il meccanismo di base utilizzato da S. Typhimurium per stabilire la propria nicchia replicativa intracellulare è la carica elettrostatica della superficie di membrana degli SCV. Tra i diversi effettori (oltre 10) liberati nel citoplasma dal T3SS-2 vi è la proteina SopB (già traslocata nella cellula ospite dal T3SS-1), che riducendo i livelli di PI(4,5)P2 e PS (fosfatidil-serina, un altro fosfolipide carico negativamente) degli SCV nascenti, ne diminuisce la carica negativa superficiale di membrana. Una delle conseguenze dell’azione di SopB è che alcune proteine della cellula ospite, il cui legame alla membrana dipende dalle interazioni elettrostatiche con essa, non sono più in grado di interagire con gliLa mancata interazione delle Rabs con la membrana degli SCV fa si che questi non possano essere SCV.trasportati verso i lisosomi inibendo la fusione fagosoma-lisosoma (minore del le Rabs, coinvolteceppo Tra queste proteine vi sono 25% rispetto al nelcontrollo). reclutamento della dineina.
  22. 22. Sistemi di Secrezione di Tipo II T3SS-24 - 6 ore dall ’ inizio dell ’ infezione delle cellule epiteliali, la proteinaeffettrice SseG induce l’accumulo di SCV intorno alle vescicole del Golgi.Questo permette, attraverso un continuo scambio di vescicole, nutrienti emembrane, la moltiplicazione dei batteri contenuti nel SCV.La moltiplicazione batterica porta alla formazione di strutture tubulo-vescicolari chiamate Filamenti Indotti da Salmonella (SIF).Questi filamenti si originano dagli SCV e si estendono attraverso l’interacellula 22
  23. 23. Funzione di PhoQ/PhoP La sopravvivenza di Salmonella all’interno dei macrofagi avviene grazie a un sistema a due componenti: •il regolatore trascrizionale PhoP e •il sensore PhoQ, entrambi in grado di regolare i sistemi SPI-1 T3SS e SPI-2 T3SS. PhoQ è una histidine kinase di membrana (membrana interna del batterio), con un dominio periplasmico che funge da sensore a diversi stimoli ambientali, e un dominio chinasico citoplasmatico.In vitro, l’attività del sensore chinasico PhoQ è repressa dagli ioni Mg2+, Ca2+ o Mn2+ che si legano allasua regione periplasmica
  24. 24. Funzione di PhoQ/PhoP In vivo, la presenza di questi cationi bivalenti, in particolare quella del Mg2+, all’interno degli SCV non è sufficiente per reprimere PhoQ che viene attivato da altri fattori come il pH acido (circa 5 - 6.5), peptidi antimicrobici cationici (CAMP) e radicali dell’ossigeno Gli ioni Mg2+ o Ca2+ mantengono il dominio periplasmico di PhoQ ripiegato sulla membrana (stato represso), all’interno degli SCV, gli CAMP inducono un cambiamento conformazionale di tale dominio attivandolo. Così come i cationi bivalenti, anche gli CAMP sono carichi positivamente e competono per gli stessi residui del dominio periplasmico di PhoQ, ma con maggiore affinità rispetto a Mg2+ o Ca2+, ed essendo strutturalmente più ingombranti di questi ultimi, allontanano tale dominio dalla membrana, attivando PhoQ. Il pH acido degli SCV provoca una perdita della rigidità del dominioQuindi, verosimilmente, all’interno degli SCV, questi periplasmico di PhoQ, facilitandone il cambiamento conformazionale due fattori attivano PhoQ additivamente. da parte degli CAMP.L’attivazione di PhoQ permette la trans-autofosforilazione della sua regione citoplasmatica e il conseguente trasferimentodi un Pi a PhoP.È proprio questa fosforilazione che attiva la capacità di PhoP di legare il promotore dei geni pho-regolati.È stato dimostrato con esperimenti di microarray che PhoP controlla la trascrizione di più di 100 geni, attivandoli (geni pag,PhoP-activated genes) o reprimendoli (geni prg, PhoP-repressed genes).Il sistema PhoPQ regola in modo opposto le due caratteristiche principali di Salmonella:l’induzione dell’endocitosi da parte delle cellule epiteliali e la sopravvivenza nei macrofagi.I geni del sistema SPI-1 T3SS, così come pure i geni coinvolti nella sintesi dei flagelli, sono PhoP-repressi, mentre i genidel sistema SPI-2 T3SS, sono PhoP-attivati.
  25. 25. Funzione di PhoQ/PhoP Regolazione negativa del sistema SPI-1 T3SS La regolazione negativa, da parte di PhoP, del sistema SPI-1 T3SS SsrA avviene tramite il controllo della trascrizione dei geni del locus hil (hyper-invasion locus) codificanti le proteine regolatrici HilA, HilC e HilD, che a loro volta regolano l’espressione dei geni dei sistemi SPI- 1 e SPI-5. Regolazione positiva del sistema SPI-2 T3SS L’espressione di diversi operoni del sistema SPI-2 T3SS è controllata positivamente dal sistema a due componenti SsrAB, costituito dal sensore SsrA (histidine kinase) e dalla proteina SsrB (response regulator). Quando PhoP è fosforilato si lega al promotore di SsrB, inducendone la trascrizione, e influenza, a livello post-trascrizionale, le concentrazione di SsrA.A differenza del sistema PhoP/PhoQ, che risulta altamente conservato tra specie affini, il sistema SsrAB è caratteristico diS. enterica (esempio di trasferimento genico orizzontale).
  26. 26. Variazione antigenica S. enterica possiede due flagelli antigenicamente diversi codificati dai geni fliC e fljB. Sia la porzione N-terminale che quella C-terminale delle proteine flagellari FljB e FliC sono altamente conservate (i primi 71 e gli ultimi 46 aminoacidi sono identici), mentre la parte esposta al riconoscimento da parte degli anticorpi differisce notevolmente (diversità antigenica). Le singole cellule batteriche esprimono alternativamente i due flagelli ogni 103 - 105 divisioni cellulari. Questo fenomeno è conosciuto come variazione di fase: le cellule esprimenti fliC sono definite cellule di fase 1, mentre le cellule esprimenti fljB sono di fase 2.Il gene fljB è parte di un operone contenente anche il gene fljA,codificante un repressore post-trascrizionale del gene fliC.
  27. 27. Variazione antigenica La variazione di fase avviene attraverso una inversione reversibile di un segmento di DNA chiamato segmento H, contenente il promotore per i geni fljB-fljA. Il segmento H è fiancheggiato da sequenze ripetute e invertite hixL e hixR (sequenze di inversione), all ’ interno delle quali avviene una ricombinazione sito-specifica che permette l’inversione del segmento H. L’enzima ricombinasi che effettua tale inversione è codificata dal gene hin, localizzato all’interno del segmento H stesso.Quando il segmento H si trova nell’orientamento ON, i geni fljB e fljA sono co-trascritti, portando allagenerazione di cellule in fase 2, mentre quando il segmento H si trova nell’orientamento OFF non vieneprodotta né la flagellina FljB né il repressore FljA, ma solo la flagellina FliC generando cellule in fase 1.Anche nelle cellule in fase 2 il gene fliC viene trascritto, ma il messaggero risultante viene degradatovelocemente a causa della presenza di FljA. Questo fattore è una ribonucleoproteina che si lega al 5‘-UTR(intorno alla sequenza Shine-Dalgarno) dell ’ mRNA di fliC impedendone il legame ai ribosomi ecausandone quindi la rapida degradazione.
  28. 28. ShigellaIl nome Shigella deriva dal nome del batteriologo giapponese Kiyoshi Shiga che per primo nel 1898 isolò e identificò un batterio appartenente a tale genere. L’habitat naturale delle shigelle è l’intestino dei primati superiori, soprattutto dell’uomo. Questi patogeni intestinali sono gli agenti eziologici della dissenteria bacillare. Il contagio avviene per via oro-fecale attraverso la contaminazione fecale soprattutto di alimenti (le mosche possono fungere da vettori meccanici). Raramente i bacilli vengono isolati da acque superficiali e potabili o da scarichi o acque contaminate da feci. Non solo Shigella è sopraffatto dall’ antagonismo di altri microrganismi eventualmente presenti nelle acque (per esempio, Escherichia) ma soprattutto è particolarmente sensibile ai trattamenti di disinfezione. Le epidemie di shighellosi avvengono, in genere, in zone ad alta densità demografica e in cui non vengono rispettate le normali con condizioni igienico-sanitarie. In genere, l’eliminazione dei bacilli da parte dei soggetti infetti avviene nell ’ arco di qualche settimana, ma alcuni soggetti, soprattutto i bambini, rimangono portatori sani per mesi e raramente anche per anni.
  29. 29. Shigella Struttura antigenica - Classificazione - Patogenesi Struttura antigenica Il genere Shigella appartiene alla famiglia delle Enterobacteriaceae. La Shigella è un bacillo Gram- di 0.4 - 0.75 x 1 - 2 μ, aerobio e anaerobio facoltativo, non mobile (e quindi privo dell’antigene flagellare H) e asporigeno. Possiede •antigeni somatici (O) termostabili, e talvolta •l’antigene K termolabile che può inibire lagglutinazione degli antigeni somatici con gli antisieri corrispondenti. Classificazione In base alle caratteristiche biochimiche (capacità di fermentare il D-mannitolo) e antigeniche il genere Shigella viene suddiviso in 4 sottogruppi principali, indicati come A, B, C e D, e 44 sierotipi. I sottogruppi sono sempre stati trattati come specie:Patogenesi La patogenicità di questo microrganismo è associata anche alla sua dose minimainfettante che è molto bassa (10-100 cellule). Questa elevata capacità infettiva di Shigella è in partedovuta alla presenza di sistemi di acido resistenza che gli permettono di sopravvivere nell’ambienteacido dello stomaco, e alla capacità del batterio di reprimere l’espressione di peptidi antimicrobici chevengono normalmente rilasciati dalla superficie della mucosa intestinale. Dopo il passaggio attraverso
  30. 30. Shigella PatogenesiShigella nella fase iniziale dellinfezione non invade le cellule epiteliali intestinali dalla parte apicale,ma innesca invece il suo assorbimento nelle cellule M ((membranose) sono una sottopopolazione delMALT (Tessuto Linfoide Associato alle Mucose). La loro funzione che è quella di discriminare ciò cheè Self dal Non Self,), che permettono l’attraversamento dello strato epiteliale, al di sotto del qualeentra a contatto con i macrofagi che rapidamente vanno incontro ad apoptosi.La distruzione dei macrofagi è accompagnata dal rilascio di citochine proinfiammatorie cherichiamano cellule polimorfonucleate, le quali distruggendo il rivestimento epiteliale consentono adaltri batteri di raggiungere lo strato al di sotto della mucosa (senza l’aiuto delle cellule M).L ’ induzione dell ’ apoptosi dei macrofagi da parte di Shigella è uno stadio fondamentaledell’infezione perché consente al batterio di invadere le cellule epiteliali dalla base, all’interno dellequali riesce a evadere dal fagosoma e replicare all’interno del citoplasma. I sintomi della malattia (diarrea, nausea e vomito) si manifestano dopo un periodo di incubazione di circa 12 - 96 ore, con una durata di circa 4 -7 giorni nei casi lievi, e di 3 - 6 settimane nei casi gravi.
  31. 31. Isole di patogenicitàIl numero e la localizzazione genomica delle isole di patogenicità di Shigella (SHI) cambiano tra idiversi ceppi, riflettendone la diversa virulenza. Esse sono localizzate sia sul cromosoma battericoche su un grosso plasmide (pINV, plasmide della virulenza) di circa 200 kb, contenente uncentinaio di geni. La regione principale di questo plasmide è la cosiddetta entry region (regionedingresso) di circa 31 kb, altamente conservata, la cui presenza è necessaria e sufficiente perlinvasione delle cellule intestinali, e la distruzione dei macrofagi.Essa è costituita da 34 geni organizzati in due unità, la cui trascrizione avviene in direzioniIl primo gruppo èalle loro funzioni, questi geni possono essere divisi(Sistema di Secrezione di Tipoopposte. In base costituito da proteine effettrici secrete dal T3SS in quattro gruppi diversi.III), che interferendo con diversi processi della cellula ospite, permettono l ’ invasione e lasopravvivenza del microrganismo all’interno di essa. Tra queste proteine vi​sono gli antigeniplasmidici di invasione IpaA, B, C D (invasion plasmid antigens) che oltre ad avere funzionieffettrici, controllano anche la secrezione e la traslocazione di altri effettori nella cellula ospite.Ilsecondo gruppo comprende più della metà dei geni della entry region ed è necessario per lasecrezione di proteine effettrici tra cui le Ipa. Questi geni sono stati chiamati membrane expressionof ipa (mxi) e surface presentation of ipa antigens (spa). Il locus mxi-spa codifica i componentinecessari per l’assemblaggio e la funzionalità del T3SS, che insieme a IpaB, C e D, permette iltrasferimento di circa 25 proteine effettrici nel citoplasma della cellula ospite.Il terzo gruppo comprende 2 attivatori trascrizionali: VirB e MxiE, che regolano i geni del sistemaT3SS.IlL’espressione dei geni del plasmide della virulenza avviene in seguito ai cambiamenti ambientali quarto gruppo codifica per gli chaperoni (IpgA, IpgC, IpgE e Spa15). (temperatura, pH, osmolarità e concentrazione di ferro) a cui viene sottoposto il batterio una volta penetrato nell’ospite. Tra questi, il passaggio a una temperatura di 37° C è il segnale principale per l’attivazione dell’espressione dei geni della entry region. 31
  32. 32. Sistema di Secrezione di Tipo III. Shigella, così come altri batteri Gram-, riesce a invadere e sopravvivere all’interno di una cellula eucariotica grazie all’azione di proteine effettrici che il batterio inietta direttamente all’interno della cellula ospite attraverso un Sistema di Secrezione di Tipo III. T3SS di Shigella che come quello di altri batteri è un apparato multiproteico (needle complex) costituito da una base a più anelli e un sottile ago che attraversano la parete batterica fino ad arrivare alla membrana della cellula ospite. Il costituente maggiore dell’anello associato alla membrana esterna del batterio (outer ring, anello esterno) è la proteina MixD (secretina), mentre gli anelli localizzati nella membrana interna (inner ring, anello interno) e nello spazio periplasmico sono costituiti dalla proteina di membrana MxiG e dalla lipoproteina MxiJ.
  33. 33. Sistema di Secrezione di Tipo III. La struttura dell’ago è costituita principalmente dalla proteina MxiH, e in minor misura da MxiI. L ’ assemblaggio dell ’ ago è controllato dal cosiddetto anello C, costituito da proteine citoplasmatiche associate all’inner ring. La proteina Spa33 interagisce con altri componenti del T3SS per estroflettere l ’ ago mentre la Spa32 ne determina la lunghezza. In condizioni di anaerobiosi (caratteristica del lume intestinale) il fattore di trascrizione Fnr reprime la trascrizione di Spa32 e di Spa33, fino a quando, in prossimità della superficie epiteliale dove vi è un ’ ossigenazione relativamente superiore, Fnr viene silenziato permettendo la trascrizione di Spa32 e Spa33 e il contatto con le cellule ospiti. L ’ energia necessaria per l ’ assemblaggio e il funzionamento del T3SS derivano dallattività La lunghezza dell’ago è evolutivamente correlata ATPasica di Spa47, anch ’ essa associata alla lunghezza degli antigeni O degli LPS, dai all’anello C. quali esso è circondato. Durante l ’ interazione con la cellula ospite, Shigella modifica la conformazione degli LPS attraverso una glucosilazione che li rende più compatti e corti, facilitando il contatto dell’ago con la membrana cellulare delle cellule ospiti.
  34. 34. Sistema di Secrezione di Tipo III. All’estremità dell’ago si associano le proteine IpaB, C e D. In assenza di cellule ospiti, la proteina idrofilica IpaD interagisce con la proteina idrofobica IpaB bloccandola all ’ interno del canale dell ’ ago, impedendo così la secrezione delle proteine effettrici. Quindi, durante la crescita dei batteri in un terreno liquido a 37° C, il T3SS è assemblato, ma non attivo. È solo il contatto con la cellula ospite che determina un cambiamento conformazionale di IpaD, che a sua volta permette la localizzazione di IpaB nella membrana plasmatica della cellula eucariotica, dove insieme all ’ altra proteina idrofobica IpaC forma un poro multimerico di traslocazione. In particolare, IpaB (così come il suo omologo SipB di Salmonella), IpaC e IpaD interagiscono direttamente con i microdomini di membrana, ricchi in colesterolo, delle cellule eucariotiche. Nel momento in cui l’ago è nella conformazione “aperta” altre proteine Ipa e altri effettori proteici possono raggiungere direttamente i loro bersagli nella cellula ospite.
  35. 35. Patogenesi. Le proteine effettrici che sono traslocate cooperano per riorganizzare il citoscheletro della cellula ospite, e formare pseudopodi e increspature (membrane ruffling) che inglobano il batterio. A differenza di Salmonella che rimane nell’SCV, Shigella 15 minuti dopo l’internalizzazione lisa il fagosoma in cui è stata inglobata. IpaB, IpaD e soprattutto IpaC sono i fattori decisivi per la lisi della membrana del fagosoma. In seguito all’invasione della cellula ospite Shigella sintetizza due proteine regolatrici codificate dal plasmide di virulenza pINV: VirF e VirB. VirF è una proteina attivatrice AraC-like, che porta all’attivazione della cascata regolatrice che attiva i geni virB e icsA. VirB è una proteina che attiva diversi operoni codificanti fattori necessari per l’invasione e la colonizzazione della mucosa intestinale.
  36. 36. Patogenesi.La proteina IcsA (intracellular spread, disseminazione intracellulare) è una outer membrane proteinnota anche come VirG che si localizza a uno dei poli della cellula batterica, richiamando e attivandoproteine della cellula ospite che nel complesso catalizzano l’allungamento dei filamenti di actina.Contemporaneamente, la proteina VirA secreta dal T3SS, degrada l’α-tubulina creando dei tunnelattraverso i quali i batteri si muovono più facilmente all’interno del fitto citoscheletro in cui si vengonoa trovare.Questa polimerizzazione direzionale dell’actina conferisce una spinta propulsiva che permette albatterio di spingere sulla membrana plasmatica a livello delle tight junctions di cellule adiacenti.La sporgenza derivante può essere internalizzata dalle cellule vicine. Grazie all’azione di IpaB, C e Dla doppia membrana plasmatica viene lisata e Shigella viene liberata nel citoplasma dove può iniziareun nuovo ciclo di replicazione e diffusione cellula-cellula.Quindi, pur essendo prive di flagelli le Shigelle liberate nel citoplasma della cellula ospite si muovonograzie alla polimerizzazione dell’actina in corrispondenza di uno dei due poli del batterio.
  37. 37. Patogenesi di Shigella In seguito all’invasione della cellula ospite Shigella sintetizza due proteine regolatrici codificate dal plasmide di virulenza pINV: VirF e VirBVirF è una proteina attivatrice AraC-like, che porta all’attivazione della cascata regolatrice che attivai geni virB e icsA.VirB è una proteina che attiva diversi operoni codificanti fattori necessari per l’invasione e la La proteina IcsA (intracellular spread, disseminazione intracellulare) è una outer membrane proteincolonizzazione della mucosa intestinale. nota anche come VirG che si localizza a uno dei poli della cellula batterica, richiamando e attivando proteine della cellula ospite che nel complesso catalizzano l’allungamento dei filamenti di actina. Contemporaneamente, la proteina VirA secreta dal T3SS, degrada l’α-tubulina creando dei tunnel attraverso i quali i batteri si muovono più facilmente all’interno del fitto citoscheletro in cui si vengono a trovare. Questa depolimerizzazione direzionale dell’actina conferisce una spinta propulsiva che permette al batterio di spingere sulla membrana plasmatica a livello delle tight junctions di cellule adiacenti. La sporgenza derivante può essere internalizzata dalle cellule vicine. Grazie all’azione di IpaB, C e D la doppia membrana plasmatica viene lisata e Shigella viene liberata nel citoplasma dove può iniziare un nuovo ciclo di replicazione e diffusione cellula-cellula. Quindi, pur essendo prive di flagelli le Shigelle liberate nel citoplasma della cellula ospite si muovono grazie alla polimerizzazione dell’actina in corrispondenza di uno dei due poli del batterio. 37
  38. 38. Patogenesi di ShigellaLa regolazione della trascrizione del gene icsA dipende anche dalla proteina nucleoide H-NS, che abasse temperature (30ºC, ma non a 37ºC) interagisce con il promotore di icsA reprimendone latrascrizione.La proteina H-NS, a basse temperature, reprime la trascrizione anche di virF e virB, svolgendo unruolo diretto nel silenziamento del regulone della virulenza di Shigella al di fuori dell’ospite.Il filamento complementare al gene icsA contiene un gene che codifica un RNA antisenso di 450nucleotidi chiamato RnaG che non viene tradotto, ma che blocca la trascrizione del nascentemessaggero di icsA (80 dei 450 nucleotidi di RnaG formano il cosiddetto kissing complex conl’mRNA icsA bloccandone prematuramente la trascrizione). 38
  39. 39. La curvatura del promotore di virF determina l’attivazione trascrizionale da parte di H-NS Tra gli eventi primari che avvengono in Shigella quando penetra nell’uomo vi è la sintesi della proteina VirF che attiva a cascata diversi operoni con funzioni diverse. È stato fatto che H-NS interagisse con il promotore di virFtemperature al ditemperature32°C, Il dimostrato che tale attivazione avviene solo a solo a particolari sopra dei fece ipotizzare che ciò fosse dovuto a una modifica strutturale (supercoiling) del DNA mentre a temperature inferiori H-NS reprime l’espressione di virF interagendo con il promotore di virF in due siti specifici. target. La proteina H-NS, a basse temperature, reprime la trascrizione di virF e virB, svolgendo un ruolo diretto nel silenziamento del regulone della virulenza di Shigella al di fuori dell’ospite.A basse temperature (< 32°C) i due siti di riconoscimento di H-NS del promotore di virF sonooccupati dalla proteina H-NS che ripiegando il DNA forma una struttura stabile impedendo l’accessoall’RNA polimerasi e quindi la trascrizione.A 37°C questo frammento di DNA viene rilassato impedendo che si formi il legame stabile tra H-NS eil promotore e quindi l’RNA polimerasi può legarsi al promotore e attivare la trascrizione del gene virF.Quindi il bending (ripiegamento) di questo tratto di DNA è dipendente da una particolare sequenza diIl rilassamentofunziona da termosensore etrascrizione dal promotore virFlegame con H-NS e regola lanucleotidi che del DNA che permette la altera in maniera reversibile il è stato anche ottenuto conmutazioni indel gene virF. di promotore che mimano lo stesso fenomeno di quando la temperatura ètrascrizione questa regionedi 37°C.L’induzione di 1/2 giro di elica, tramite l’inserimento di 4-6 bp, cambia l’orientamento dei siti I e II sulpromotore (e la relativa posizione di H-NS) così da permettere la trascrizione.
  40. 40. Shiga toxinsLe Shiga toxins (Stxs) sono enterotossine espresse da Shigella dysenteriae sierotipo 1 e alcuni ceppidi E. coli denominati Stx-producing E.coli (STEC).Tutte le Stxs presentano una struttura A-5B:la subunità A (A, da active) è costituita da due frammenti A1 e A2 legati da un ponte disolfuro;le 5 subunità B (B, da binding) formano un anello (pentamero) nel cui poro centrale è associata(legame non covalente) l’estremità carbossi-terminale del frammento A2. 40
  41. 41. Shiga toxinsLe subunità B si legano a un glicolipide di membrana delle cellule eucariotiche, ilglobotriaosilceramide (Gb3).Ogni pentamero B possiede 10-15 siti di legame Gb3, che sono alla base dell’alta affinità di legamedella tossina al recettore.Tale legame porta all’endocitosi della tossina nella cellula ospite.Gli endosomi contenenti Stxs sono indirizzati al Golgi attraverso il quale raggiungono il reticoloendoplasmatico (trasporto retrogado).All’interno del ER la subunità A subisce una proteolisi che porta alla scissione di A1 e A2.Al frammento A1 è associata l’attività tossica delle Stxs, infatti essendo tale frammento una N-glicosidasi, rimuove uno specifico residuo di adenina dalla subunità 28S dei ribosomi eucariotici (60S),determinando linibizione della sintesi proteica, e morte cellulare. Oltre al blocco della sintesi proteica,le Stxs inducono apoptosi in molte linee cellulari. 41
  42. 42. Figura 7.12
  43. 43. Figura 7.13
  44. 44. Tabelle
  45. 45. Tabella 7.3
  46. 46. Tabella 7.5
  47. 47. Tabella 7.4

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