La Laguna di Venezia rappresenta un ecosistema molto complesso che a causa di forti pressioni antropiche, ha subito nel corso dei secoli significative modificazioni. In particolare, in seguito alla creazione del polo industriale di Porto Marghera e allo sviluppo dei centri urbani di Venezia e Chioggia, la laguna è stata protagonista di un drammatico sfruttamento delle risorse disponibili e dell’immissione di elevati livelli di inquinanti. La Laguna di Venezia necessita pertanto di una continua valutazione dello stato di salute dell’ecosistema e del rischio ambientale. Considerata inoltre l’importanza commerciale degli allevamenti e della raccolta di Molluschi Bivalvi nell’area lagunare, le autorità regionali devono pianificare un monitoraggio costante per garantire la sicurezza dei prodotti destinati al consumo umano. La vongola verace filippina Ruditapes philippinarum, attualmente rappresenta la specie commerciale più importante all’interno della Laguna di Venezia, e grazie alle sue caratteristiche e alla sua ampia distribuzione nella laguna, è stata recentemente considerata come specie sentinella per indagini ecotossicologiche. L’obiettivo principale di questa tesi è stato quello di ottenere indicazioni riguardo lo stato ecologico di quattro aree della Laguna di Venezia (Porto Marghera, Chioggia, Colmata e Laguna Nord) attraverso l’analisi dei profili di espressione genica di vongole filippine prelevate in aree soggette a diverso impatto antropico. Nel presente studio si sono quindi valutate le variazioni dei livelli di RNA messaggeri potenzialmente associate alla presenza di inquinanti ambientali in vongole filippine provenienti da diverse aree della Laguna di Venezia. Nonostante le analisi chimiche effettuate sul corpo molle degli animali permetteranno di interpretare in modo più definitivo i risultati ottenuti, lo studio ha permesso di testare l’impiego della genomica nella valutazione del rischio ambientale e sito-specifica dei corpi idrici.

1. UTILIZZO DELLA TRASCRITTOMICA PER
LA CLASSIFICAZIONE DI AREE DELLA
LAGUNA DI VENEZIA SOGGETTE A
DIVERSO IMPATTO ANTROPICO
Relatore: Prof. Luca Bargelloni
Correlatore: Dott. Massimo Milan
Laureando: Nicola Rizzardo
Biotecnologie per l’Alimentazione
ANNO ACCADEMICO 2013-2014

2. INTRODUZIONE 1
Chioggia
Porto Marghera
Venezia
La Laguna di Venezia rappresenta un ecosistema
complesso che ha subito significative modificazioni a
causa delle forti pressioni antropiche.
- Creazione polo industriale di Porto Marghera
- sviluppo centri urbani di Venezia e Chioggia
è Elevato sfruttamento delle risorse disponibili
è Immissione di elevati livelli di inquinanti.
La Laguna di Venezia necessita pertanto di una continua
valutazione
- stato di salute dell’ecosistema
- del rischio ambientale.

3. La vongola filippina Ruditapes philippinarum,
attualmente rappresenta la specie
commerciale più importante all’interno della
Laguna di Venezia.
Diversi studi hanno dimostrato la tendenza ad
accumulare contaminanti ambientali nei tessuti.
SPECIE SENTINELLA per indagini
ecotossicologiche all’interno della laguna.
INTRODUZIONE 2

4. OBIETTIVI
Analisi dei profili di espressione genica di R. philippinarum.!
Analisi di set di trascritti la cui espressione è correlata a variabili ambientali!
" Classificazione delle aree soggette a diverso impatto antropico.
Testare il potenziale impiego della trascrittomica come strumento
integrativo nella valutazione dello stato ambientale e di qualità del
prodotto.
1
OBIETTIVI

5. MATERIALI & METODI 1
n° 160
luglio - ottobre
2013 in 4 aree
Laguna di
Venezia
- Per area/
periodo sono
stati composti
dei POOL =
ghiandole
digestive di 5
animali
- Estrazione
RNA
Analisi profili di
espressione
genica
mediante
l’utilizzo di una
piattaforma
DNA
microarray
n° 100
per area e
stagione:
laboratorio del
Magistrato alle
Acque di
Venezia
Colmata
Laguna Nord
Chioggia
1
2
2
1
2
2
Porto Marghera
1
1
1
2
DISEGNO SPERIMENTALE
- “ ” sussiste il divieto assoluto di pesca
- “ ” è permessa la sola raccolta controllata di
seme in determinati periodi dell’anno.
rilevare le concentrazioni nel corpo
molle delle vongole
DNA 8X15K Agilent
14.156 sonde

6. X axis : 19 %
Y axis : 6 %
Luglio 2013
Ottobre 2013
Porto Marghera
Chioggia
Colmata
Laguna nord
ANALISI ESPLORATIVA sui PROFILI DI ESPRESSIONE GENICA di R.PHILIPPINARUM
RISULTATI
luglio ottobre
1
è Analisi dei Componenti Principali (PCA)
è dataset composto tutte le sonde presenti nel microarray

7. INFLUENZA DELLA STAGIONALITÀ
1.788
trascritti
D.E.
RISULTATI
41
BP
15
CC
21
MF
2
KP
33
BP
3
CC
12
MF
2
KP
1.089 é
luglio
699 #!
ottobre
Analisi di arricchimento
mediante software DAVID
2
Electron transport chain
ATP synthesis coupled & energy
Oxidative phosphorylation
…
Lysosome
regulation of growth,
…
regulation cell size & proteolysis
METABOLISMO ENERGETICO:
RIARRANGIAMENTO TESSUTI:
software DAVID
richiesta energia per produzione
di gameti
gonadi regrediscono
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated
Discovery) che permette di identificare i processi biologici (BP), le
componenti cellulari (CC), le funzioni molecolari (MF) e le KEGG
pathway sovra-rappresentate nei differenzialmente espressi.
Confronto tra le 2 stagioni di campionamento: luglio Vs ottobre
SAM (Statistical Analyses of
Microarray)
dividendo i campioni in 2
gruppi in base al periodo
indip. dall’area

8. CLASSIFICAZIONE DELLE AREE in base ai profili di espressione genica
(verificare modificazioni trascrittomiche dovute ad un cattivo stato ambientale)
141# 270#
307 DEGs (Milan et al., in press.)
gennaio 2011
178 DEGs (Milan et al., 2013)
4 stagioni 2009
RISULTATI 3
Considerati 37 trascritti la cui espressione è risultata correlata alla conc. di diversi
inquinanti ambientali in 2 precedenti lavori.
Geni coinvolti in processi di detossificazione, apoptosi, risposta immunitaria
37

9. RISULTATI 4
… analisi è stata strutturata separando
luglio
ottobre
4 pool
Porto Marghera
4 pool
Chioggia
rappresentativa di un “cattivo” stato ecologico utilizzate come
riferimento nella
CLASSIFICAZIONE
di CO e LN.rappresentativa di un “buono” stato ecologico
PAM (Prediction Analyses of Microarrays): permette di calcolare una funzione discriminante
tra classi di campioni, sulla base di CAMPIONI NOTI per CLASSIFICARE CAMPIONI IGNOTI.
CAMPIONI NOTI:
CLASSIFICAZIONE DELLE AREE
37
Al fine di classificare i campioni sulla base dei profili di espressione del set di trascritti

10. Cross-validazione dei pool di CH e PM campionati in luglio verificando:
- omogeneità
- assegnazione al sito d’origine.
I pool CH e PM sono stati assegnati correttamente all’area di provenienza
(100%).
RISULTATICLASSIFICAZIONE DELLE AREE - luglio
CH_JU13_P1
CH_JU13_P2
CH_JU13_P3
CH_JU13_P4
PM_JU13_P1
PM_JU13_P2
PM_JU13_P3
PM_JU13_P4
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 1 2 3 4 5 6 7 8
CVPROBABILITIES
POOLCHIOGGIA LUGLIO PORTO MARGHERA LUGLIO
5
luglio
PM
CH

11. PM e CH considerate come riferimento per la classificazione di CO e LN.
Il Test di assegnazione (Predicted test probabilities) ha attribuito
CO
LN
RISULTATICLASSIFICAZIONE DELLE AREE - luglio
CO_JU13_P2
CO_JU13_P3
CO_JU13_P4
CO_JU13_P5
LN_JU13_P1
LN_JU13_P2
LN_JU13_P3
LN_JU13_P4
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 1 2 3 4 5 6 7 8
PREDICTEDTESTPROBABILITIES
POOLCHIOGGIA PORTO MARGHERA
6
PM
luglio
LN
CO
presenza nelle 2 aree di effetti
dovuti agli inquinanti.

12. RISULTATICLASSIFICAZIONE DELLE AREE - ottobre
CH_OCT13_P1
CH_OCT13_P3
CH_OCT13_P4
CH_OCT3_P2
PM_OCT13_P1
PM_OCT13_P3
PM_OCT13_P4
PM_OCT3_P2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 1 2 3 4 5 6 7 8
CVPROBABILITIES
POOLCHIOGGIA PORTO MARGHERA
Cross-validazione ha assegnato correttamente i pool delle aree di
CH e PM all’area di provenienza (100%).
7
ottobre
PM
CH

13. RISULTATICLASSIFICAZIONE DELLE AREE - ottobre
Il Test di assegnazione ha attribuito
CO
LN
CO_OCT13_P1
CO_OCT13_P2
CO_OCT13_P4
LN_OCT13_P1
LN_OCT13_P3
LN_OCT13_P4
LN_OCT13_P5
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 1 2 3 4 5 6 7
PREDICTEDTESTPROBABILITIES
POOLCHIOGGIA PORTO MARGHERA
8
PM
CH
ottobre
LN
CO
a differenza del mese di luglio, LN è
stata classificata come “area pulita”
CO si è confermata assegnata a PM

14. 1
L’analisi dei profili di espressione genica di R. philippinarum ha
permesso di valutare:
è stagionalità
(espressione di geni: metabolismo energetico
e riarrangiamento dei tessuti)
CONCLUSIONI
RIASSUMENDO …
è a livello trascrittomico gli effetti dovuti all’esposizione di
inquinanti in vongole provenienti da diverse aree della
Laguna di Venezia.
PM ( luglio - ottobre )
CO
LN
CH ( ottobre )
luglio
ottobre

15. fornire indicazioni sugli effetti biologici sull’ecosistema
legati ad un cattivo stato ambientale.
La TRASCRITTOMICA potrebbe fornire una
panoramica ancora + ampia sullo stato
ecologico di una determinata area.
+ parametri chimici .
+ parametri chimico - fisici
+ parametri idromorfologici
Capacità di discriminare
vongole provenienti da
diverse aree
tracciabilità alimentare.
Continue violazioni all’interno della Laguna
Venezia nella raccolta di molluschi in aree
vietate
strumento pratico e poco costoso per
individuare vongole potenzialmente
dannose per la salute umana.
CONCLUSIONI 2
TRASCRITTOMICA
20/60/CE
(WFD)
2008/56/CE
(MSFD)
richiede la valutazione degli inquinanti a livello
biologico nell’ecosistema mediante

16. GRAZIE PER
L’ATTENZIONE
Nicola Rizzardo
Biotecnologie per l’Alimentazione
A. A.: 2013-2014

17. INFLUENZA DEI CONTAMINANTI
RISULTATI
593
trascritti
D.E.
247 ê
PM
8
BP
4
CC
10
MF
1
KP
14
BP
6
MF
1
KP
366 é
PM
4
CITOSCHELETRO e
CONNESSIONE INTERCELLULARE
microtubule-based process
Gap junction
neuron differentiation (AChE)
ECM-receptor interaction
Detossificazione, risposta immunitaria:
- sulfotransferase é
- heat shock protein (HSP) é
SVILUPPO e
DIFFERENZIAZIONE NEURONALE
luglio
T-test
…
…
software DAVID
(200 permutazioni;
p-value= 0.01;
FC > 1.5)
PM - CH
Confronto tra Porto Marghera (PM) e Chioggia (CH) nel mese di luglio
é ê
software DAVID

18. RISULTATI
390
trascritti
D.E.
8
BP
1
KP
1
BP
6
CC
1
MF
1
KP
190 ê
PM
200 é
PM
5
cellular protein complex assembly
AGGREGAZIONE ED
ARRANGIAMENTO DI COMPONENTI
CELLULARI
Focal ahesion
metal ion transport
attività anti-apoptotica e risposta immunitaria:
- baculoviral IAP repeat-containing 2 é
- lectins é
ottobre
TRASPORTO IONICO DI METALLI
software DAVID
T-test
(200 permutazioni;
p-value= 0.01;
FC > 1.5)
PM - CH
Confronto tra Porto Marghera (PM) e Chioggia (CH) nel mese di ottobre
INFLUENZA DEI CONTAMINANTI
software DAVID