1. เทคนิค Polymerase chain reaction
หรือ พีซีอาร์ (PCR)
การเพิ่มจานวนสารพันธุกรรมด้วยเทคนิค
Polymerasem chain reaction (PCR)
การทา PCR เป็นเทคนิคที่ใช ้กันแพร่หลายมากที่สุดใน
การศึกษาทางอณูพันธุศาสตร์ของสิ่งมีชีวิตต่าง ๆ
หลักการของเทคนิค PCR เป็นเทคนิคที่ใช ้ในการเพิ่ม
จานวน (amplification) ดีเอ็นเอที่ต ้องการศึกษาอย่าง
จาเพาะในหลอดทดลองให ้มีจานวนมากเป็นล ้านเท่าใน
ระยะเวลาอันสั้น โดยอาศัยหลักการแบบเดียวกันกับการ
3. องค์ประกอบหลักของปฏิกิริยา PCR
ปฏิกิริยา PCR มีส่วนประกอบที่สาคัญ ดังนี้
1. ดีเอ็นเอต้นแบบ (DNA template)
คือดีเอ็นเอตัวอย่าง ซึ่งอาจเป็ นของผู้ป่ วยหรือ
สิ่งมีชีวิตอื่น ๆ ที่ต ้องการศึกษา ในดีเอ็นเอต ้นแบบ
จะต ้องมีส่วนของสายดีเอ็นเอหรือยีนที่ต ้องการศึกษา
อยู่ ซึ่งทราบลาดับนิวคลีโอไทด์แล ้วเพื่อใช ้ออกแบบ
ไพรเมอร์ได ้ โดยทั่วไปควรทดสอบปริมาณ DNA
ต ้นแบบที่เหมาะสมเพื่อให ้ได ้ปริมาณ DNA ที่ต ้องการ
เพียงพอและมีความไวที่เหมาะสมสาหรับปฏิกิริยา
4. 2. ไพรเมอร์ (Primers)
คือนิวคลีโอไทด์สายเดี่ยวขนาดสั้นๆ (Single-
stranded oligonucleotides) ที่มีลาดับเบสเป็นคู่สม
(complementary) กับดีเอ็นเอต ้นแบบ โดยไพรเมอร์
ทาหน้าที่เป็นจุดเริ่มต ้นในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสาย
ใหม่ ในการทา PCR จาเป็นต ้องมีไพรเมอร์อย่างน้อย
1 คู่ (forward primer และ reverse primer ซึ่งจะมี
ทิศทางสวนทางกัน) ซึ่งคู่ของไพรเมอร์นี้เมื่อเข ้าไป
จับกับสายดีเอ็นเอตัวอย่างแล ้ว จะคร่อมส่วนของดี
เอ็นเอที่ต ้องการศึกษา
5. o ไพรเมอร์ที่ออกแบบจากบริเวณปลาย 5' เรียกว่า
“Forward primer” ในการทา PCR นั้น forward
primer จะจับกับดีเอ็นเอต ้นแบบที่เป็น anti-sense
strand (3’-> 5”)
o ไพร์เมอร์ที่ออกแบบจากบริเวณปลาย 3' เรียกว่า
“Reverse primer” ในการทา PCR นั้น reverse
primer จะจับกับดีเอ็นเอต ้นแบบที่เป็น sense strand
(5’-> 3”) สาหรับการสั่งสังเคราะห์ไพรเมอร์เส ้น
reverse primer ทั่วไปมักเขียนในทิศทาง 5' -->3'
เช่นเดียวกันกับ Forward primer (รูปที่ 1)
7. 3. Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs)
ได ้แก่ dATP, dTTP, dGTP, dCTP นิวคลีโอไทด์ทั้งสี่
ชนิดนี้จะใช ้เป็นวัตถุดิบ (substrate) ในการสร ้างสายดี
เอ็นเอสายใหม่
4. DNA polymerase
เป็นเอนไซม์ที่มีหน้าที่ในการสร ้างสายดีเอ็นเอ โดย
เอนไซม์ที่ใช ้ในปฏิกิริยา PCR จะต ้องเป็นชนิดที่สามารถทน
ความร ้อนได ้สูงอย่างน้อย 94-95ºC โดยไม่เสียสภาพ ปัจจุบัน
เอนไซม์ที่นิยมใช ้กันมากในปฏิกิริยา PCR คือ Taq DNA
polymerase เป็นเอนไซม์ที่สกัดมาจากแบคทีเรียที่มีชื่อว่า
Thermus aquaticus (Taq) ซึ่งอาศัยอยู่บริเวณน้าพุร ้อนได ้
ความเข ้มข ้นของ DNA polymerase ที่ใช ้ขึ้นกับปริมาณ
และลักษณะของดีเอ็นเอต ้นแบบ, ไพร์เมอร์ รวมทั้ง
สารประกอบอื่น ๆ ด ้วย การใช ้เอนไซม์ที่มากเกินไปจะทาให ้
8. 5. PCR buffer
เป็นสารละลายที่ควบคุมสภาวะของการทาปฏิกิริยาให ้เหมาะสม
เช่น pH และเกลือต่าง ๆ
6. Magnesium ion (Mg2+)
เป็น co-factor เพื่อช่วยส่งเสริมการทางานของเอนไซม์ DNA
polymerase ให ้ปฏิกิริยาการสร ้างสายดีเอ็นเอดาเนินต่อไปได ้
ความเข ้มข ้นของ magnesium ion ที่มากเกินไป ทาให ้เกิด PCR
product ที่ไม่จาเพาะ แต่ถ ้าใช ้ความเข ้มข ้นน้อยเกินไปก็จะทาให ้ได ้
PCR product น้อย
7. เครื่อง Thermal cycler
สาหรับปรับเปลี่ยนอุณหภูมิให ้เหมาะสมตามโปรแกรมที่จัดตั้งไว ้
10. ขั้นตอนการทาปฏิกิริยา PCR
การเกิดปฏิกิริยา PCR จาเป็นต ้องมีการควบคุมอุณหภูมิ เพื่อทาให ้
ปฏิกิริยาเกิดขึ้นได ้อย่างเหมาะสม ซึ่งแบ่งออกเป็น 3 ขั้นตอน ได ้แก่
1. การแยกสายดีเอ็นเอเกลียวคู่ออกจากกัน (Denaturation) เป็น
ขั้นตอนที่เพิ่มอุณหภูมิสูงขึ้น เพื่อแยกสายดีเอ็นเอต ้นแบบจากสายคู่
(double strand DNA; dsDNA) เป็นสายเดี่ยว (single strand DNA;
ssDNA) โดยทั่วไปขั้นตอนนี้จะใช ้อุณหภูมิประมาณ 90-95ºC
ประมาณ 30-60 วินาที
ขั้นตอน denaturation การใช ้เวลานานและอุณหภูมิที่สูงเกินไป จะ
ทาให ้เอนไซม์และนิวคลีโอไทด์สูญเสียคุณสมบัติได ้แต่ถ ้าใช ้เวลา
น้อยและอุณหภูมิต่าเกินไป จะทาให ้สายดีเอ็นเอแยกออกจากกันได ้
ไม่ดี ทาให ้PCR product ลดลง กรณีที่ DNA ต ้นแบบมีปริมาณ GC
content ที่สูงมาก ต ้องเพิ่มอุณหภูมิให ้สูงขึ้นด ้วย
11. 2. การจับของไพร์เมอร์กับดีเอ็นเอแม่แบบ (Annealing)
เป็นขั้นตอนที่ลดอุณหภูมิลงให ้อยู่ประมาณ 50-66๐C
ประมาณ 30 วินาทีเพื่อให ้ไพรเมอร์เข ้าจับกับสายดีเอ็นเอ
ตัวอย่างที่ต ้องการศึกษา ในบริเวณที่เป็นนิวคลีโอไทด์ที่
เป็นคู่สมทั้งสองสายอย่างจาเพาะ
อุณหภูมิในขั้นตอน annealing จะขึ้นกับค่าตาแหน่งของ
สายดีเอ็นเอและ Melting temperature (Tm) ของ primers
ที่ใช ้ในปฏิกิริยา การใช ้อุณหภูมิที่สูงในขั้นตอนนี้จะช่วยใน
การเพิ่มความจาเพาะในการจับของไพรเมอร์กับดีเอ็นเอ
ต ้นแบบ อุณหภูมิสาหรับขั้นตอน annealing สามารถ
คานวณคร่าวๆ ได ้จากสูตร
12. 3. การสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ต่อจากไพรเมอร์
(Extension) เป็นขั้นตอนการสร ้างดีเอ็นเอสายใหม่ในทิศทาง
จาก 5' ไป 3' ที่มีลาดับนิวคลีโอไทด์ complementary กับดี
เอ็นเอต ้นแบบ โดยเป็ นการสร ้างต่อจากไพรเมอร์ที่เกาะอยู่
กับดีเอ็นเอต ้นแบบ โดยใช ้นิวคลีโอไทด์ (dNTPs)ทั้งสี่ชนิดที่
ใส่ลงไปในปฏิกิริยาเป็ นวัตถุดิบในการสร ้าง โดยทั่วไป
Taq DNA polymerase จะมีอุณหภูมิเหมาะสมในขั้นตอนนี้อยู่
ที่ 72 C ระยะเวลาในขั้นตอนนี้ประมาณ 30-180 วินาที
อุณหภูมิขั้นตอน extension โดยทั่วไปจะใช ้อุณหภูมิ
ในช่วง 68-72 C (ขึ้นกับชนิดของ DNA polymerase แต่ละ
ชนิดที่ใช ้ในปฏิกิริยา) ระยะเวลาในขั้นตอนนี้ประมาณ 30-180
วินาที เวลาที่ใช ้จะขึ้นกับความยาวของ PCR product ซึ่งจะ
13. ปฏิกิริยา PCR จะดาเนินไปในแต่ละรอบซึ่ง
ประกอบด ้วย denaturation, annealing และ
extension หลังการทาปฏิกิริยาจานวนทั้งสิ้น
ประมาณ 30-40 รอบ จะมีการเพิ่มดีเอ็นเอบริเวณที่
ศึกษาขึ้นแบบทวีคูณในปริมาณ 2n (n = จานวน
รอบที่ใช ้ในปฏิกิริยา PCR) ชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่
เพิ่มขึ้นจากการทา PCR สามารถนามาศึกษาต่อได ้
เช่น การนามาทา gel electrophoresis เพื่อศึกษา
ขนาดของดีเอ็นเอบริเวณที่เราสนใจ, การทา
hybridization หรือนาไปตรวจสอบลาดับนิวคลีโอ
ไทด์ (DNA sequencing)
14. ประโยชน์ของ PCR ในการตรวจวินิจฉัยโรค
PCR เป็นเทคนิคสาคัญมากในงานอณูชีวโมเลกุล ทั้งใน
ส่วนที่เป็นงานพื้นฐานในห ้องปฏิบัติการ ตลอดจนการ
ประยุกต์ใช ้ทางการแพทย์ และการเกษตรสามารถใช ้ในการ
วินิจฉัยโรคต่าง ๆ ทั้งโรคติดเชื้อและโรคจากพันธุกรรม ศึกษา
ความผันแปรทางพันธุกรรม ศึกษากลายพันธุ์ของยีน ทาแผนที่
ยีน และศึกษาลาดับเบสของยีนของสิ่งมีชีวิตได ้ทุกชนิด โดย
สามารถสรุปได ้ตามหัวข ้อต่าง ๆ ดังต่อไปนี้
ด้านการแพทย์ ได ้แก่ การตรวจหาเชื้อไวรัสหรือแบคทีเรีย
ที่เป็นสาเหตุของโรค (เช่น โรคเอดส์ วัณโรค มาเลเรีย) การ
ตรวจหายีนก่อมะเร็ง (เช่น มะเร็งเต ้านม มะเร็งลาไส ้ใหญ่) ทา
15. ด้านการเกษตร PCR มีบทบาทมากในงานด ้านการ
ปรับปรุงพันธุ์พืช การตรวจสอบสายพันธุ์พืช การตรวจ
วินิจฉัยโรค สายพันธุ์พืชต ้านทานโรค การศึกษา
ความสัมพันธ์ระหว่างพืชกับเชื้อโรครวมทั้งศึกษายีนกับตัว
อื่น ๆ ของพืชและเชื้อโรค และการแสดงออกของยีน
เหล่านั้น ตลอดจนการนาไปใช ้ในการป้องกันกาจัดโรคพืช
ที่เกิดจากเชื้อรา แบคทีเรีย และไวรัส หรือเชื้อสาเหตุโรค
อื่น ๆ
16. อุตสาหกรรมเพาะเลี้ยงกุ้ง ซึ่งเป็น
อุตสาหกรรมส่งออกที่ทารายได ้ให ้กับประเทศไทย
เป็นจานวนหลายหมื่นล ้านบาท แต่ในปัจจุบันนี้
เกษตรกรเริ่มประสบปัญหาจากโรคระบาดในบ่อ
เลี้ยงกุ้ง ทาให ้ประเทศไทยสูญเสียรายได ้เป็น
จานวนมาก สาเหตุของโรคระบาดในกุ้ง ส่วนใหญ่
เกิดจากเชื้อไวรัส ซึ่งสามารถตรวจสอบได ้โดยใช ้
เทคนิค PCR ทาให ้สามารถป้องกันการแพร่ระบาด
ของโรคได ้ทันท่วงที นอกจากนี้สามารถใช ้ในการ
คัดเลือกสายพันธุ์กุ้งที่ดี เพื่อใช ้ในการผสมพันธุ์
17. นิติวิทยาศาสตร์ปัจจุบันการตรวจวิเคราะห์
หลักฐานจากที่เกิดเหตุ เช่น เลือด ผิวหนัง เส ้นผม
ได ้ถูกนามาเป็นหลักฐานสาคัญในการสอบสวน
และการเอาผิดกับผู้ต ้องหาในหลายคดี ซึ่งจาก
ตัวอย่างที่ได ้จากที่เกิดเหตุเหล่านี้ สามารถนามา
เพิ่มปริมาณ ดีเอ็นเอของผู้ต ้องสงสัยได ้ด ้วย
เทคนิคพีซีอาร์ และจากการศึกษาด ้านลายพิมพ์ดี
เอ็นเอ ได ้ถูกนามาใช ้ในการระบุชี้ตัวบุคคล จึงทา
ให ้สามารถบ่งชี้บุคคลที่อยู่ในที่เกิดเหตุได ้
นอกจากนี้ยังสามารถใช ้ในการตรวจหาผู้กระทา
ผิดคดีข่มขืนเด็กและหญิงสาว และการตรวจสอบ
18. เทคนิคอิเล็กโตรโฟรีซิส
อิเล็กโตรโฟรีซิส (Electrophoresis)เป็ นเทคนิคที่ใช ้แยกสาร
วิเคราะห์ และเตรียมสารที่มีประจุไฟฟ้า เช่น กรดอะมิโน โปรตีน
และ กรดนิวคลีอิก ให ้บริสุทธิ์ โดยอาศัยหลักการที่ว่า เมื่อให ้
สนามไฟฟ้า สารที่มีประจุไฟฟ้าจะเคลื่อนที่ไปยังขั้วที่ตรงข ้ามกัน
ด ้วย อัตราเร็วในการเคลื่อนที่ ซึ่งขึ้นกับปริมาณประจุสุทธิบน
โมเลกุลของสาร รูปร่างและขนาดของโมเลกุลของสารนั้น และ
กระแสไฟฟ้า
19. อัตราเร็วในการเคลื่อนที่ของสารแสดงด ้วยสมการดังนี้ V = E.q/f
เมื่อ
v = ความเร็วในการเคลื่อนที่ของโมเลกุล
E = ความเข ้มของสนามไฟฟ้า
q = ประจุสุทธิบนโมเลกุล
f = frictional coefficient ขึ้นอยู่กับน้าหนักและรูปร่างโมเลกุล
การเคลื่อนที่ของโมเลกุลที่มีประจุในสนามไฟฟ้าแสดงโดยเทอม
ของ การเคลื่อนที่ในสนามไฟฟ้า,u ซึ่งหมายถึงความเร็วต่อหน่วย
ของความเข ้มของสนามไฟฟ้า ซึ่งขึ้นตรงกับ อัตราส่วนประจุ/มวล
u = v/E = E . q/f . E เมื่อ v = E.q/f u = q/f
f จะแปรตามขนาดไม่ได ้แปรตามรูปร่าง
ทฤษฎี
20. SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS-PAGE) เป็นเทคนิคที่ใช ้วิเคราะห์หาน้าหนักโมเลกุลของพอลิ
เพปไทด์สายเดี่ยวและดูความบริสุทธิ์ของโปรตีน โดยอาศัยการ
เชื่อมต่อของ acrylamide monomer จนเป็ นสายโซ่ยาวประกอบกัน
เป็ นแผ่นเจล โดยมี TEMED เป็ น catalyst และมี ammonium
persulfate เป็น initiator
โปรตีนอยู่ในบัฟเฟอร์ที่เป็ นด่างและประกอบด ้วย sodium dodecyl
sulfate (SDS) ซึ่งเป็ น anionic detergentโดย SDSจะจับพอลิเพป
ไ ท ด์ด ้ว ย อั ต ร า ส่ว น 1 . 4 ก รั ม SDS/ก รั ม โ ป ร ตีน โ ด ย มี -
mercaptoethanol หรือ dithiotreithol เป็น reducing agent เพื่อใช ้
ทาลายพันธะ disulfide โปรตีนที่จับกับ SDS จะมีประจุลบ เมื่อให ้
กระแสไฟฟ้า โมเลกุลที่มีประจุลบจะเคลื่อนที่เข ้าหาขั้วบวก ซึ่งอัตรา
การเคลื่อนที่ของโปรตีนจะเร็วหรือช ้าขึ้นกับขนาดน้าหนักโมเลกุล
24. 2. กระจก
นากระจก (glass plate) ขนาด 8x10 เซนติเมตร และ notched
alumina plates มาเช็ดทาความสะอาด จากนั้นนากระจกและ
notched alumina plates มาประกบกันโดยมี spacer คั่นไว ้ตรง
กลาง จากนั้นนามาประกอบเข ้ากับ dual gel caster (ดังภาพ)
25. 3. เตรียม Separating gel
โดย ผสมสารเคมีตามเปอร์เซ็นต์เจลที่ต ้องการใช ้
สารเคมี 12% gel
15% gel
30% acrylamide 2 ml
2.5 ml
1.5 M Tris-HCl pH 8.8 1.25 ml
1.25 ml
10% Ammonium persulfate 25 µl
25 µl
10% SDS 200 µl 200
µl
TEMED 5 µl 5 µl
Tips: การเตรียม separating gel ให ้ใส่ TEMED ไว ้ลาดับสุดท ้ายก่อนที่จะเติมลงใน gel
sandwich เพราะ TEMED จะเป็นตัว induce ทาให ้เกิดการ polymelization เจลจะแข็ง
ตัวอย่างรวดเร็ว และ ammonium persulfate (APS) ควรเตรียมใหม่ทุกครั้งเนื่องจาก
APS เป็นตัวทาให ้เกิด free radical ซึ่งมีผลต่อการเกิด polymerization
26. 4. เติม Separating gel ลงใน gel sandwich
ค่อยๆเติมสารละลายที่ได ้จากข ้อ 3 ลงใน gel
sandwich โดยใช ้pipette ค่อยๆ เติมสารละลายลงอย่างช ้าๆ
เพื่อลดโอกาสในการเกิดฟองอากาศ เมื่อเติมสารละลาย ได ้
ประมาณ 3/4 ส่วนของกระจก ให ้เททับ (overlay) ผิวหน้าเจล
ด ้วยน้า (distilled water) หรือ butanol (water-saturated
butanol) จากนั้นรอจนกระทั่งเจลแข็ง (polymerization)
ประมาณ 30-45 นาที เมื่อเจลแข็งให ้เทน้า หรือ butanol ออก
ซับให ้แห ้ง
Tips 1: การเททับผิวหน้าด ้วยน้า หรือ water-saturated butanol จะทาให ้ผิวหน้าเจลเรียบ
ไม่มีฟองอากาศ แต่การใช ้water-saturated butanol จะประสิทธิภาพดีกว่าการใช ้น้า
เนื่องจากน้าสามารถไปละลาย acrylamide ทาให ้สัดส่วนในสารละลายเปลี่ยนไป
(acrylamide จะเจือจางลง) (http://www.ruf.rice.edu/)
Tips 2: การทดสอบว่าเจลแข็ง (polymerized) ให ้สังเกตจากสารละลายในภาชนะที่ใช ้ใน
การผสม ถ ้าเจลในภาชนะแข็งใน gel sandwich ก็แข็งเช่นเดียวกัน หรือเอียง dual gel
28. 5. เตรียม stacking gel
โดย ผสมสารเคมีตามสัดส่วนที่ต ้องการ โดยใส่ TEMED
เป็นลาดับสุดท ้ายเช่นเดียวกัน
สารเคมี ปริมาณที่ใช ้(5% gel)
30% acrylamide 335 µl
0.5 M Tris-HCl pH 6.8 500 µl
10% Ammonium persulfate 15 µl
10% SDS 80 µl
TEMED 5 µl
Distilled water 1070 µl
29. 6. โหลด stacking gel ลงใน gel sandwich
หลังจากเทน้าหรือ butanol ออก พร ้อมซับน้าให ้แห ้ง
จากนั้นนา comb มาใส่ระหว่างช่องว่างของกระจกและ
notched alumina plates จากนั้นค่อยๆ โหลด stacking
gel ที่ผสมเรียบร ้อยแล ้วลงไปให ้ท่วมกระจก รอจน
Stacking gel แข็งตัว ประมาณ 20 นาที
Tips1: ตอนใส่ comb ควรจัดให ้comb อยู่
ตรงกลาง ไม่เอียง เพื่อให ้การทดสอบมี
ประสิทธิภาพ
Tips2: ขณะโหลด stacking gel ควรสังเกต
ฟองอากาศบริเวณ comb ต ้องไล่
ฟองอากาศออกให ้หมด เพราะจะทาให ้
ผิวหน้าเจลไม่เรียบ
30. 7. นา gel sandwich ไปประกอบกับ chamber
เมื่อ stacking gel แข็งตัวให ้ถอดออกจาก dual gel
caster แล ้วนาไปประกอบเข ้ากับ gasket ใน
chamber โดยหนีบด ้วย spring clamp (ดังภาพ)
31. 8. เตรียม gel sandwich สาหรับทดสอบโปรตีน
เมื่อประกบ gel sandwich กับ gasket เรียบร ้อยแล ้ว
เท Running buffer ให ้ท่วมเจล และเติมในถาด
chamber จากนั้นค่อยๆ ดึง comb ออกจาก
stacking gel (ดังภาพ)
32. 9. เตรียมตัวอย่างโปรตีนทดสอบ
โปรตีนที่นามาทดสอบควรนาไปคานวนปริมาณโปรตีนก่อนทาการโหลดให ้
ได ้20 mg/well (20mg ใน 20ul) โดยวิธี Bradford assay เพื่อให ้ปริมาณ
โปรตีนไม่เยอะจนเกินไปจากนั้นนาโปรตีนมาเติม DTT และ loading dye
แล ้วนาไปต ้มในน้าเดือด 5 นาที ก่อนนาไปโหลดลงใน well (อย่าให ้
ตัวอย่างล ้นออกมานอก well)
Tips: ในการรันโปรตีนที่สนใจควรทดสอบ
ควบคู่กับโปรตีนมาตรฐาน (protein
marker) เพื่อให ้รู้น้าหนักโมเลกุล
(molecular weight) ของโปรตีนที่สนใจ
และ protein marker ที่เลือกใช ้ควรมี
น้าหนักโมเลกุลที่ครอบคลุมกับน้าหนัก
โมเลกุลของโปรตีนที่สนใจ
33. 10. การรันทดสอบโปรตีนที่สนใจ
หลังจากโหลดตัวอย่างโปรตีนเรียบร ้อยแล ้วให ้ปิดฝา (safety lid)
ให ้แน่น จากนั้นต่อขั้วไฟฟ้าเข ้ากับ power supply ให ้ถูกต ้อง ตั้งค่า
ความต่างศักย์ (voltage) และเวลา เริ่มทดสอบ (ดังภาพ)
Tips1: ความต่างศักย์ไฟฟ้า (voltage) ที่ใช ้คือ 100 –
150 โวลต์ ในกรณีที่ใช ้ความต่างศักย์สูงเกินไปจะทา
ให ้ผลการทดลองที่ได ้ไม่สวยงาม เพราะโปรตีน
เคลื่อนที่เร็วอาจทาให ้แถบโปรตีนโค ้ง ถ ้าโวลต์ที่ใช ้ต่า
เกินไป จะทาให ้เสียเวลาในการรอผลการทดลอง
Tips2: เวลาที่ใช ้รันขึ้นกับ ความต่างศักย์ไฟฟ้า
(voltage) และเปอร์เซ็นต์ของเจล สาหรับผู้ที่เริ่มทา
SDS-PAGE ให ้คอยจับเวลาและสังเกตการเคลื่อนที่
34. 11. ระหว่างการทดสอบ
ให ้สังเกตการเคลื่อนที่ของสี (dye) หรือ การ
เคลื่อนที่ของ Protein marker เพื่อไม่ให ้โปรตีนที่
สนใจเคลื่อนที่จนหลุดออกจากเจล
Tips1: กรณีที่ใช ้unstained protein marker จะต ้องสังเกตจากสีที่ผสมกับโปรตีน
ระยะห่างระหว่างการเคลื่อนที่ของโปรตีนกับสีที่ผสมขึ้นกับเปอร์เซ็นต์เจลที่เตรียม
ขึ้นด ้วย
Tips2: กรณีที่ใช ้prestained protein marker ให ้ติดตามการเคลื่อนที่ของโปรตีนที่
สนใจตามการเคลื่อนที่ของ protein marker ที่มีน้าหนักโมเลกุลที่ใกล ้เคียงกับ
โปรตีนที่สนใจ
35. 12. การนาเจลออกจากกระจก
จับ spacer ที่กั้นระหว่างกระจกกับ notched alumina plates
และใช ้spacer เป็นตัวดันกระจกออก ตัดส่วน stacking gel
ออก จากนั้นนาเจลออกจาก Notched alumina plates ด ้วย
spacer เช่นกัน
36. 13. การย ้อมสีโปรตีนที่ติดอยู่ในเจล
นาเจลที่ได ้ใส่ลงในกล่องพลาสติก จากนั้นเทสีย ้อมให ้ท่วมเจลทิ้งไว ้
ข ้ามคืน (overnight)
Tips: ขั้นตอนการย ้อมสีโปรตีนสามารถทาการย ้อม
อย่างรวดเร็ว (rapid staining) โดยการเอากล่องใส่เจล
ไปแช่ในอ่างน้าอุ่นประมาณ 1 ชั่วโมงและจึงค่อยล ้างสี
ที่มากเกินพอออกไป (destaining)
37. 14. นาเจลไปล ้างสีย ้อม (destaining)
เทสีย ้อมที่มากเกินพอออก พร ้อมกับล ้างน้าเพื่อให ้สีส่วนเกินออก จากนั้นเท
destaining solution ลงไปแช่ให ้ท่วมเจล สามารถทา rapid destaining ได ้
เช่นเดียวกัน ทาซ้า จนเห็นแบนด์โปรตีนติดสีขึ้นมา และพื้นหลัง ติดสีย ้อมน้อย
ที่สุด
ก่อนย ้อมด ้วย Coomassie blue หลังย ้อมด ้วย Coomassie blue
38. 15. การอ่านผลการทดสอบ
จากรูปสามารถทราบน้าหนักโมเลกุลของโปรตีนที่สนใจ
ได ้2 วิธี คือ
15.1 ดูจาก protein marker แล ้วประมาณค่าของน้าหนัก
โมเลกุล เมื่อนาเอา protein marker และโปรตีนที่ต ้องการทราบน้าหนัก
โมเลกุลไปทดสอบด ้วยวิธีการทา Electrophoresis แบบ SDS-PAGE
ดังรูป
เลน 2 พบว่าโปรตีนที่สนใจเคลื่อนที่ไปตรงกับตาแหน่งแบนที่ 5
ของ protein marker (นับจากล่างขึ้นบน) ทาให ้ทราบว่าโปรตีนนั้นมี
น้าหนักโมเลกุลเท่ากับ protein marker ในตาแหน่งที่ 5 คือ 52 กิโล
ดาลตัน (kDa)
เลน 3 พบว่าโปรตีนที่สนใจเคลื่อนที่ไประหว่างแบนที่ 4 และ 5
ของ Protein marker (นับจากล่างขึ้นบน) แต่อยู่ใกล ้กับ 40 kDa แสดง
39. 15.2 นา protein marker ไปทา standard curve เพื่อ
ให ้ได ้ค่าที่แม่นยาขึ้นอาศัยการเปรียบเทียบระยะทาง
การเคลื่อนที่ของโปรตีนที่ทราบน้าหนักโมเลกุลกับ
โปรตีนที่ต ้องการศึกษา โดยการสร ้างกราฟมาตรฐาน
ความสัมพันธ์ระหว่างค่าลอการิทึมของน้าหนักโมเลกุล
(log MW) กับค่า relative migration distance (Rf) )
เพื่อคานวณหาน้าหนักโมเลกุลของโปรตีนจากสมการ
เส ้นตรง y = mx + b ดังนั้นเมื่อทราบระยะทาง
การเคลื่อนที่ของโปรตีนที่ต ้องการศึกษาจากการ
ทาอิเล็กโตโฟเรซิส (Electrophoresis) แบบ SDS-PAGE
ก็สามารถคานวนหาน้าหนักโมเลกุลได ้เมื่อนามาเปรียบเทียบกับกราฟ
มาตรฐาน
40. เทคนิคในการโคลนยีน
การโคลนยีน (Gene Cloning)
เมื่อนักวิทยาศาสตร์ได ้DNA ลูกผสม (Recombinant DNA) ตาม
ต ้องการแล ้ว ขั้นตอนต่อไปก็จะต ้องมีการเพิ่มจานวนของยีนที่ได ้ เรียก
การเพิ่มจานวนของ DNA ที่มีลักษณะคล ้ายๆกันนี้ว่า การโคลนยีน (Gene
Cloning) หรือการโคลนDNA (DNA Cloning) ซึ่งโดยทั่วไป
นักวิทยาศาสตร์สามารถออกได ้2 แบบ คือ การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิ
ดของแบคทีเรียหรือการโคลนยีนโดยใช ้เทคนิค PCR
41. การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย
โดยทั่วไปการทาพันธุวิศวกรรมมักจะใช ้การนา DNA ที่สนใจมาตัด
ต่อใส่ในส่วนของพลาสมิด (Plasmid) จากเซลล์แบคทีเรีย จากนั้นเมื่อ
ได ้DNA ลูกผสมแล ้วก็จะต ้องมีการนากลับเข ้าไปใส่ในเซลล์
แบคทีเรียใหม่อีกครั้งเรียนการนา DNAลูกผสมเข ้าเซลล์แบคทีเรียนี้
ว่า การ Transformation จะมีโอกาสสาเร็จน้อย นักวิทยาศาสตร์
จาเป็นต ้องมีเทคนิคในการคัดเลือกแบคทีเรียโคโลนีใดบ ้างที่ได ้รับพ
ลาสมิดที่มีDNAลูกผสมที่เข ้าไปภายใน ซึ่งโดยทั่วไปพลาสมิดของ
แบคทีเรียจะมียีนที่ต ้านทานยาปฏิชีวนะ (antibiotic resistance) อยู่
ภายใน ดังนั้น ถ ้าเซลล์แบคทีเรียได ้รับพลาสมิดเข ้าไปภายในเซลล์
เมื่อนาไปเลี้ยงอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใส่ยาปฏิชีวนะจะต ้องสามารถเกิดการ
เจริญเติบโตและสร ้างโคโลนีได ้(เนื่องจากยีนที่ต ้านยาปฏิชีวนะบนพ
ลาสมิดสามารถทางานได ้ แสดงว่าเซลล์แบคทีเรียเซลล์นั้นได ้รับพ
ลาสมิดเข ้าไปภายในเซลล์แล ้ว)
42. การโคลนยีนโดยอาศัยเทคนิค PCR(Polymerase Chain
Reaction)
เทคนิค PCR(Polymerase Chain Reaction) –การเลียนแบบ
กระบวนการ DNA replication ในเซลล์สิ่งมีชีวิต
- เทคนิคที่ใช ้ในการเพิ่มปริมาณDNAในหลอด
ทดลอง สามารถใช ้ในการเพิ่มจานวนของDNA ที่ได ้มาจาก
บริเวณที่เกิดการฆาตกรรมที่มีDNAอยู่เพียงเล็กน้อยเท่านั้นได ้
(เช่น DNA จากคราบอสุจิหรือคราบเลือด)
- เทคนิคนี้ไม่จาเป็นต ้องอาศัยเซลล์ในการเพิ่ม
จานวน แต่ใช ้เครื่องที่เรียกว่า thermocycler ที่สามารถตั้งเวลา
การปรับอุณหภูมิภายในได ้เองโดยอัตโนมัติ
43. หลักการเบื้องต ้นของการโคลนนิ่ง
วิธีโคลนนิ่งทางวิทยาศาสตร์สามารถทาได ้2 วิธี คือ
1. การแยกเซลล์หรือตัดแบ่งตัวอ่อนในระยะก่อนการฝังตัว
(blastomere separation or embryo bisection )
1.1 การแยกเซลล์ (blastomere separation) หลังปฏิสนธิตัวอ่อน
ระยะ1 เซลล์จะมี การแบ่งตัวเป็นทวีคูณ จากหนึ่งเป็นสอง สอง
เป็นสี่ สี่เป็นแปด เรื่อยๆไป หากต ้องการทาแฝดเราสามารถทา
โดยการแยกเซลล์เดี่ยวๆ ออกมา เช่น หากเป็น 2 เซลล์ ก็นามา
แยกเป็น 1:1 หรือหากเป็น4 ก็แยกเป็น4 ส่วน 1:1:1:1 เป็นต ้น
อย่างไรก็ตามพบว่าการเจริญเป็นตัวอ่อนปกติหรือตัวเต็มวัยตัว
อ่อนหลังแบ่งต ้อง ประกอบด ้วยเซลล์จานวนหนึ่งที่เพียงพอ หาก
แบ่งแล ้วไม่พอเพียงก็ไม่สามารถเจริญเป็นตัวอ่อนที่ปกติหรือตัว
เต็มวัยได ้จึงเป็น ข ้อจากัดที่สาคัญอย่างหนึ่ง
44. 1.2 การตัดแบ่งตัวอ่อน ( embryo bisection ) ตัวอ่อน ระยะมอรูล่า หรือ
ระยะบลาสโตซีสสามารถแบ่งเป็น 2ส่วนเท่าๆ กัน โดยใช ้ใบมีดขนาดเล็ก
(microblade) ติดกับเครื่องมือพิเศษที่เรียกว่า “micromanipulator” ข ้อ
แตกต่างของการตัดแบ่งระยะ มอรูล่าและระยะบลาสโตซีส คือ แนวการแบ่ง
หากเป็นตัวอ่อนระยะมอรูล่าสามารถแบ่งในแนวใดก็ได ้ให ้สมดุลย์
(symmetry) แต่หาก เป็นตัวอ่อนระยะบลาสโตซีสต ้องตัดแบ่งในแนวที่ผ่าน
เซลล์ภายในที่เรียกว่า อินเนอร์เซลล์แมส (inner cell mass, ICM) ทั้งนี้
เพราะ ตัวอ่อนระยะนี้เซลล์ได ้มีการเปลี่ยนแปลงไปแล ้ว
(differentiation)แม ้ว่าการโคลนสัตว์แบบการแยกเซลล์หรือการตัดแบ่งตัว
อ่อน นี้มีข ้อดีคือสามารถทาได ้เร็ว ไม่ต ้องมีขั้นตอนมากมาย แต่ก็มีข ้อจากัด
คือไม่สามารถแบ่งตัวอ่อนได ้มากตามจานวนเซลล์
45. 2. การย ้ายฝากนิวเคลียส (nuclear transfer or nuclear transplantation)9-
10
การย ้ายฝากนิวเคลียสเป็นวิธีการที่ค่อนข ้างจะซับซ ้อน โดยมีรายละเอียด
ขั้นตอนโดยย่อคือ
ก. เตรียมโอโอไซต์ตัวรับ (oocyte recipient preparation)
ข. เตรียมนิวเคลียสจากตัวอ่อน ต ้นแบบ (nuclear donor preparation)
ค. ดูดเอานิวเคลียสตัวอ่อนให ้ใส่ไปยัง ไซโตพลาสซึ่มของโอโอไซต์
(nuclear transfer)
ง. เชื่อม นิวเคลียสให ้ติดกับไซโตพลาสซึ่มของโอโอไซต์ (oocyte-
nuclear fusion)
จ. การเลี้ยงนาตัวอ่อน (embryo culture)
ฉ. การย ้ายฝากตัวอ่อน (embryo transfer)
47. ประโยชน์ หรือ ข ้อดี ของการโคลนนิ่ง (Advantages of Cloning)
- การโคลนนิ่ง(cloning) ช่วยในการเพิ่มจานวนพันธุ์สัตว์และพันธุ์พืชหายาก
หรือเพิ่มจานวนพันธุ์สัตว์และพันธุ์พืชที่ใกล ้ที่จะสูญพันธุ์ ได ้เร็วกว่าการผสม
พันธุ์กันแบบปกติตามธรรมชาติ
- การโคลนนิ่ง(cloning) ช่วยในการเพิ่มจานวนสัตว์ที่มีลักษณะทาง
พันธุกรรมที่ดี เช่น หมูที่ให ้เนื้อในปริมาณมากหรือโคที่ให ้น้านมในปริมาณ
มากที่มีความต ้านทานโรคสูง เป็นต ้น
-การโคลนนิ่ง(cloning) ช่วยในการเพิ่มจานวนสัตว์ที่ได ้มีการปรับปรุง
ลักษณะทางพันธุกรรม ทั้งสัตว์ที่ผสมพันธุ์กันด ้วยวิธีทางธรรมชาติหรือผสม
เทียมหรือสัตว์ที่เป็นจีเอ็มโอ(GMOs) โดยสัตว์เหล่านี้อาจปรับปรุงพันธุ์มา
เพื่อผลิตยารักษาโรคได ้
- การโคลนนิ่ง(cloning) ช่วยในการทดลองทางวิทยาศาสตร์ที่ต ้องใช ้
48. - การโคลนนิ่ง(cloning) เพื่อช่วยในการผลิตอวัยวะของสัตว์ที่มีลักษณะ
เหมือนกันเพื่อที่จะใช ้ในการย ้ายฝาก
- การโคลนนิ่ง(cloning) ช่วยในการปลูกถ่ายทดแทนอวัยวะของมนุษย์
ซึ่งอาจได ้อวัยวะที่เข ้ากันได ้โดยภูมิคุ้มกันตัวเองไม่ต่อต ้านอวัยวะใหม่ที่
รับเข ้าไปซึ่งช่วยทาให ้ลดความเสี่ยงในการใช ้ยากดภูมิคุ้มกัน
- การโคลนนิ่ง(cloning) ช่วยให ้นักวิทยาศาสตร์เข ้าใจกลไกการทางาน
ของยีน(gene)มากขึ้น อย่างเช่นในกรณี ผู้ป่ วยที่สมองตายจากการเป็น
อัมพาตโดยที่อาจสามารถทาการกระตุ้นให ้เซลล์สมองเกิดการแบ่งตัว
ทดแทนเซลล์เดิมที่ตายไปได ้หรือในกรณีของผู้ป่ วยที่ไตวาย อาจ
สามารถทาการกระตุ้นการทางานของไตและทาการกระตุ้นให ้เซลล์ไตที่
เหลืออยู่เกิดการแบ่งตัวแล ้วทาหน้าที่แทนกันได ้
49. จะเห็นได ้ว่าการโคลนนิ่ง(cloning)นั้นมีข ้อดีหรือประโยชน์ทั้ง ด ้านทาง
การแพทย์ การทดลองทางวิทยาศาสตร์ การรักษาพันธุ์ ด ้านการ
เกษตรกรรม แต่การโคลนนิ่ง(cloning)ยังมีปัญหาทางด ้านจริยธรรม
จากการปลูกถ่ายทดแทนอวัยวะของมนุษย์เพราะต ้องโคลนนิ่ง
(cloning)คนที่เหมือนกันแล ้วนาอวัยวะของโคลนมาใช ้กับคนที่เป็นเจ ้า
ของเดิมทาให ้คนที่ถูกโคลนออกมามีอวัยวะไม่ครบ แต่ถึงอย่างนั้นยังมี
วิธีการอื่นที่ไม่ใช่การโคลนนิ่ง(cloning)ในการสร ้างอวัยวะอยู่ เช่น
สเต็มเซลล์(stem cell) เป็นต ้น นอกจากนี้การโคลนนิ่ง(cloning)ยังไม่
เป็นที่ยอมรับจากทางศาสนาอย่างนิกายโรมันคาทอลิก และยังไม่เป็น
ที่ยอมรับของนักสังคมศาสตร์ในแง่มุมของการพิสูจน์เอกลักษณ์บุคคล
อาจทาได ้ยากขึ้นหากยอมให ้มีการโคลนนิ่ง(cloning)เกิดขึ้น ดังนั้นใน
ปัจจุบันนี้การโคลนนิ่ง(cloning)มนุษย์จึงยังไม่อาจจะทาได ้และทาให ้
ข ้อมูลทางรายงานการวิจัยเกี่ยวกับการโคลนนิ่ง(cloning)มนุษย์ยังมี
50. ข ้อเสีย หรือ ผลเสีย ของการโคลนนิ่ง (Disadvantages of
Cloning)
-ทาให ้เกิดความไม่เป็นเอกลักษณ์ของสิ่งมีชีวิตที่เป็นตัวต ้นแบบ
-ทาให ้เกิดการขาดความหลากหลายทางชีวภาพ
-อาจทาให ้การพัฒนาสายพันธุ์ที่ดีมีน้อยลงเพราะมีลักษณะเหมือนกันไป
หมดไม่เปลี่ยนแปลง
-อาจทาให ้มีวิวัฒนาการลดลง และอาจลดความอยู่รอดของเผ่าพันธุ์ได ้
(เพราะมีความเหมือนกันเป็นจานวนมาก)
-มนุษย์ยังมีปัญหาด ้านจริยธรรม เช่น อย่างในกรณีการปลูกถ่ายทดแทน
อวัยวะของมนุษย์เพราะต ้องทาคนที่เหมือนกันออกมาแล ้วนาอวัยวะของ
โคลนนั้นมาปลูกถ่ายแทนที่อวัยวะคนที่เป็นต ้นแบบ ซึ่งทาให ้คนที่ถูก
โคลนออกมามีอวัยวะไม่ครบ
-มีปัญหาในทางด ้านกฎหมายในการพิสูจน์จาแนกผู้กระทาผิดในคดีต่างๆ
