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171215_IBMCP_AC
- 1. Nuevas herramientas para el control de la expresión génica en plantas basadas en pequeños RNAs artificiales Alberto Carbonell www.slideshare.net/AlbertoCarbonell1 acarbonell@ibmcp.upv.es @A_Carbonell_
- 2. Post-transcriptional Small RNA Pathways in Plants AGO dsRNA target RNA ssRNA Intramolecular (folding) RNA-dependent RNA polymerase DCL RDR .............. AGO .............. AGO .............. An sRNA An An Translational repression ............. RNA-dependent RNA polymerase target RNA RDR
- 3. Artificial Gene Silencing Pathways hpRNA pathway hpRNA transgene An# tasiRNA# target#RNA! |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| An# AGO1# DRB4# DCL4# DRB4# DCL4# SDE5# RDR6# SGS3# RDR6# TAS!primary#transcript! AGO1# HEN1# AGO# dsRNA! tasiRNA! hpRNA primary transcript An# tasiRNA# target#RNA! |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| An# AGO1# DRB4# DCL4# DRB4# DCL4# SDE5# RDR6# SGS3# RDR6# TAS!primary#transcript! AGO1# HEN1# AGO# dsRNA! tasiRNA! |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| An# AGO1# DRB4# DCL4# DRB4# DCL4# SDE5# RDR6# SGS3# RDR6# TAS!primary#transcript! HEN1# AGO# dsRNA! tasiRNA! ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||DCL4 DRB4 An# syntasiRNA+1# target#RNA! |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| An# AGO1# DRB4# DCL4# DRB4# DCL4# SDE5# RDR6# SGS3# RDR6# Modified#TAS!primary#transcript! AGO1# HEN1# AGO# dsRNA! syntasiRNA+1! syntasiRNA+2! syntasiR-1 syntasiR-2 syntasiR-1 syntasiR-2 An# syntasiRNA+2# target#RNA! AGO1# An# syntasiRNA+1# target#RNA! |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| An# AGO1# DRB4# DCL4# DRB4# DCL4# SDE5# RDR6# SGS3# RDR6# Modified#TAS!primary#transcript! AGO1# HEN1# AGO# dsRNA! syntasiRNA+1! syntasiRNA+2! syntasiR-1 syntasiR-2 syntasiR-1 syntasiR-2 An# syntasiRNA+2# target#RNA! AGO1# An# syntasiRNA+1# target#RNA! |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| An# AGO1# DRB4# DCL4# DRB4# DCL4# SDE5# RDR6# SGS3# RDR6# Modified#TAS!primary#transcript! AGO1# HEN1# AGO# dsRNA! syntasiRNA+1! syntasiRNA+2! syntasiR-1 syntasiR-2 syntasiR-1 syntasiR-2 An# syntasiRNA+2# target#RNA! AGO1# An# syntasiRNA+1# target#RNA! |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| An# AGO1# DRB4# DCL4# DRB4# DCL4# SDE5# RDR6# SGS3# RDR6# Modified#TAS!primary#transcript! AGO1# HEN1# AGO# dsRNA! syntasiRNA+1! syntasiRNA+2! syntasiR-1 syntasiR-2 syntasiR-1 syntasiR-2 An# syntasiRNA+2# target#RNA! 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- 4. Limitations Of Current AmiRNA/Syn-tasiRNA Systems 1. Design (WMD3): -Non-intuitive interface -Multi-step -Slow -No syn-tasiRNA design tool http://wmd3.weigelworld.org/ 1st PCR amiRNA insert 2nd PCR BamHI cut EcoRI cut Gel purification Gel purification Entry vector Cut pBSK vector with EcoRI Alkaline Phosphatase treatment Gel purification BamHI cut Entry plasmid Mini-prep Pick up positive colony Confirm the sequencing Ligation Transform into E. coli Entry plasmid Binary vector Binary plasmid Cut with restriction enzyme(s) Gel purification Mini-prep Pick up positive colony Confirm the replacement of the fragment Transform into Agro Ligation Transform into E. coli Cut with restriction enzyme(s) Alkaline Phosphatase treatment Gel purification2. Cloning: -Long and slow (multi-step) -Non cost-effective -Non-high throughput capability -Lack of covenient syn-tasiRNA cloning systems Schwabb et al., Plant Cell (2006) 3. Expression: -Frequent miss-processing of amiRNAs (-> off target effects!) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 amiRNAs -21 nt
- 5. This platform includes: a) Web-based tools for the design of artificial small RNAs b) A new generation of artificial small RNA vectors GOAL: To develop a new platform for the: 1. Design 2. Cloning (high-throughput) and 3. Expression of plant amiRNAs and syn-tasiRNAs in a simple, fast, cost- effective and effective manner for specific gene silencing in plants.
- 6. Fahlgren et al. Bioinformatics (2015) http://p-sams.carringtonlab.org/
- 7. Precursor Selection For New AmiRNA Vectors Ath-MIR390a For Eudicots A B Carbonell et al. Plant Physiology (2014) Osa-MIR390 For Monocots A B Carbonell et al. Plant Journal (2015)
- 8. Design Of Overlapping And Complementary Oligonucleotides For Direct AmiRNA Cloning In MIR390-based Vectors Carbonell et al. Plant Physiology (2014)
- 9. AmiRNA Cloning In New B/c Vectors Carbonell et al. Plant Physiology (2014)
- 10. Plant binary vectors New AmiRNA B/c Vectors Carbonell et al. Plant Physiology (2014) GATEWAY-compatible entry vectors Carbonell et al. Plant Journal (2015)
- 11. A AtMIR390a-Lfy amiR* amiR AtMIR390a-Ch42 AtMIR390a-based amiRNA foldbacks AtMIR390a-Trich AtMIR390a-Ft UA U AAU A C G U GGCUUUCCGUUAUAACCA UGGUUAUA A G GAA AGG CC C G C A UA U AAU A C G U GCACGUACUUUCACUGUU AACAGUGA A G UAC GUC GC A U G C UA U AAU A C G U GGGACAGUCUCGAAUGGG CCCAUUCGA A CUG UCG CC G C C U UA U AAU A C G U AGUUCUCUGUGUAAGCGA UAAGUGUC ACG GAA UCC CU U A A Functionality Of New AmiRNA Vectors For Eudicots amiR-Ch42 Ch42 mRNA 5’ TTAAGTGTCACGGAAATCCCT 3’ |||||||||||||||||| | 3’ CATTCACAGTGCCTTTAGGAA 5’ Carbonell et al. Plant Physiology (2014) G - U6 - amiRNA amiR- Trich - + amiR- Lfy - + amiR- Ch42 - + amiRNA accumulation in Arabidopsis transgenic lines amiR- Ft - + 21- 24- - amiRNA amiR-CH42 - + - U6 amiR- CH42 Severe Inter- mediate Wea k No phenotype C Weak 35S:GUS Intermediate Severe No phenotype Silencing of CHLORINA 42 (CH42) LFY - + amiR-Lfy TargetmRNA relativeexpression 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 CH42 - + amiR-Ch42 RNAaccumulation amiR-CH42 - + amiR* AtMIR390a-Ch42 AtMIR390a-Trich AtMIR390a-Ft UA U AAU A C G U GGCUUUCCGUUAUAACCA UGGUUAUA A G GAA AGG CC C G C A UAA CU GCACGUACUUUCACUGUU A G UA U AAU A C G U GGGACAGUCUCGAAUGGG CCCAUUCGA A CUG UCG CC G C C U UA U AAU A C G U AGUUCUCUGUGUAAGCGA UAAGUGUC ACG GAA UCC CU U A A 35S:GUS 35S:AtMIR390a-Trich amiR-Trich target mRNA 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||||||||||:| 3’ AGGGTAAGCTATGACGAGTGA 5’ TRY CPC 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||||||:|||:|| 3’ AGGGTAAGCTATGATGAGTGG 5’ ETC2 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||| ||:|||:|| 3’ AGGGTAAGCTACGATGAGTGA 5’ G - U6 - amiRNA amiR- Trich - + amiR- Lfy - + amiR- Ch42 - + amiRNA accumulation in Arabidopsis transgenic lines amiR- Ft - + 21- 24- Silencing of TRICH (TRY, CPC, ETC2) - amiRNA - + - U6 amiR-Trich amiR- Trich vector TRY CPC ETC2 - + - + - + amiR-Trich RNAaccumulation LFY - + amiR-Lfy TargetmRNA relativeexpression 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 amiR-Trich - + - + - + 62/101 25/101 10/101 vector 52/53 48/48 33/33
- 12. UC U AG C U A GACAGGCGUAAGAUUGCG CGCAAUCUU C GCC UGCUC A U G C 35S:OsMIR390-AtL- Bri1 16/20 AC U UG C U A GACAGGCGUAAGAUUGCG CGCAAUCUU C GCC UGCUC A U G C 35S:OsMIR390- Bri1vector 0/7 7/11 Silencing of BRASSINOSTEROID- INSENSITIVE 1 (BRI1) Carbonell et al. Plant Journal (2015) Functionality Of New AmiRNA Vectors For Monocots 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 amiR-Bri1 - + BRI1 RNA - 35S:OsMIR390 35S:OsMIR390- AtL + vector 35S:OsMIR390- Bri1 AtL-Bri1 21 - 24 - - amiRNA - U6 amiR-Spl11 35S: OsMIR390- Spl11 35S: OsMIR390-AtL- Spl11vector 0/33 8/8 23/23 AC U UG C U A UGGCUACUGCUCAGAUCG CGAUCUGAG A GUA GCCCA U A G A C UG C U A UGGCUACUGCUCAGAUCG CGAUCUGAG A GUA GCCCA U A G A U A vector 35S:OsMIR390- Spl11 AtL-Spl11 Silencing of SPOTTED LEAF 11 (SPL11) - + + SPL11 RNA 21 - 24 - - amiRNA - U6 LFY - + amiR-Lfy TargetmRNA relativeexpression 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 vector 35S:OsMIR390 35S:OsMIR390- AtL
- 13. Design Of Overlapping Oligonucleotides For Direct Syn-tasiRNA Cloning in AtTAS1c-based Vectors Carbonell et al. Plant Physiology (2014)
- 14. Syn-tasiRNA Cloning In New B/c Vectors Carbonell et al. Plant Physiology (2014)
- 15. pMDC123SB-AtTAS1c-B/c Gateway-compatible entry clone Plant binary vectors pMDC32B-AtTAS1c-B/c pENTR-TAS1c-B/c ccdB BsaI BsaIAtTAS1c 5’ 3’ KanRattL2attL 1 ccdB BsaI BsaIAtTAS1c 5’ 3’ HygRNosR B L B 2x35S BsaI KanR ccdB BsaI BsaIAtTAS1c 5’ 3’ BastaRNosR B L B 2x35S BsaI KanR New Syn-tasiRNA B/c Vectors Carbonell et al. Plant Physiology (2014)
- 16. AtTAS1c-D3&D4-Trich target mRNA 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC ||||||||||||||||||:| 3’ AGGGTAAGCTATGACGAGTGA TRY TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||||||||||:| AGGGTAAGCTATGACGAGTGA 5’ AtTAS1c-D3&D4-Ft target mRNA 5’ TTGGTTATAAAGGAAGAGGCC |||||||||||||||||:||| 3’ AACCAATATTTCCTTCTTCGG TTGGTTATAAAGGAAGAGGCC 3’ |||||||||||||||||:||| AACCAATATTTCCTTCTTCGG 5’ AtTAS1c-D3Trich-D4Ft target mRNA 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC ||||||||||||||||||:| 3’ AGGGTAAGCTATGACGAGTGA TTGGTTATAAAGGAAGAGGCC 3’ |||||||||||||||||:||| AACCAATATTTCCTTCTTCGG 5’ FT TRY TRY FT FT CPC 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC ||||||||||||||:|||:|| 3’ AGGGTAAGCTATGATGAGTGG ETC2 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC ||||||||||| ||:|||:|| 3’ AGGGTAAGCTACGATGAGTGA CPC TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||||||:|||:|| AGGGTAAGCTATGATGAGTGG 5’ ETC2 TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||| ||:|||:|| AGGGTAAGCTACGATGAGTGA 5’ CPC 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||||||:|||:|| 3’ AGGGTAAGCTATGATGAGTGG 5’ 2x35S:AtTAS1c miR173 target site miR173 5’ GUGAUUUUUCUCUACAAGCGAA 3’ |||||||:||||| |||||||| 3’ CACUAAAGAGAGACGUUCGCUU 5’ syn-tasiRNAs syn-tasiRNA-1 (3’D3[+]) syn-tasiRNA-2 (3’D4[+]) AtTAS1c-D3&D4-Trich target mRNA 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC ||||||||||||||||||:| 3’ AGGGTAAGCTATGACGAGTGA TRY TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||||||||||:| AGGGTAAGCTATGACGAGTGA 5’ AtTAS1c-D3&D4-Ft target mRNA 5’ TTGGTTATAAAGGAAGAGGCC |||||||||||||||||:||| 3’ AACCAATATTTCCTTCTTCGG TTGGTTATAAAGGAAGAGGCC 3’ |||||||||||||||||:||| AACCAATATTTCCTTCTTCGG 5’ AtTAS1c-D3Trich-D4Ft target mRNA 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC ||||||||||||||||||:| 3’ AGGGTAAGCTATGACGAGTGA TTGGTTATAAAGGAAGAGGCC 3’ |||||||||||||||||:||| AACCAATATTTCCTTCTTCGG 5’ FT AtTAS1c-D3Ft-D4Trich target mRNA 5’ TTGGTTATAAAGGAAGAGGCC |||||||||||||||||:||| 3’ AACCAATATTTCCTTCTTCGG FT TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||||||||||:| AGGGTAAGCTATGACGAGTGA 5’ TRY TRY TRY FT FT CPC 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC ||||||||||||||:|||:|| 3’ AGGGTAAGCTATGATGAGTGG ETC2 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC ||||||||||| ||:|||:|| 3’ AGGGTAAGCTACGATGAGTGA CPC TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||||||:|||:|| AGGGTAAGCTATGATGAGTGG 5’ ETC2 TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||| ||:|||:|| AGGGTAAGCTACGATGAGTGA 5’ CPC 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||||||:|||:|| 3’ AGGGTAAGCTATGATGAGTGG 5’ ETC2 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||| ||:|||:|| 3’ AGGGTAAGCTACGATGAGTGA 5’ CPC 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||||||:|||:|| 3’ AGGGTAAGCTATGATGAGTGG 5’ ETC2 5’ TCCCATTCGATACTGCTCGCC 3’ ||||||||||| ||:|||:|| 3’ AGGGTAAGCTACGATGAGTGA 5’ miR173 5’ GUGAUUUUUCUCUACAAGCGAA 3’ |||||||:||||| |||||||| 3’ CACUAAAGAGAGACGUUCGCUU 5’ syn-tasiRNA-1 (3’D3[+]) syn-tasiRNA-2 (3’D4[+]) Functionality of New Syn-tasiRNA Vectors 35S:GUS Trich Ft 35S:AtMIR390- 35S:GUS Trich Ft D3&D4-Trich D3&D4-Ft D3Trich-D4Ft D3Ft-D 35S:AtMIR390- 35S:AtTAS1c- vector syntasiRNA-Trich syntasiRNA-Ft 35S:GUS Trich Ft D3&D4-Trich D3&D4-Ft D3Trich-D4Ft D3Ft-D4Trich 35S:AtMIR390- 35S:AtTAS1c- Carbonell et al. Plant Physiology (2014)
- 17. syn-tasiRNA vectors for targeting single or multiple (sequence unrelated) genes -Arabidopsis (and close species) vectors: AtTAS1c-based -In other species if MIR173 is co-expressed amiRNA vectors for targeting single or multiple (sequence related) genes: -Eudicot vectors: AtMIR390a-based -Monocot vectors: OsMIR390-AtL-based Development of a new platform to design, clone and express plant artificial small RNAs in a simple, fast, cost-effective and effective manner to silence single or multiple genes in plants Summary P-SAMS webtool with two apps (P-SAMS amiRNA Designer and P-SAMS syn-tasiRNA Designer) for the automated design of amiRNAs and syn-tasiRNAs, respectively AtMIR390a-B/c vector amiRNA insert Oligo annealing BsaI digestion + ligation E. coli transformation Plasmid purification Sequencing amiRNA construct 1 h 5 min Plant transformation Day 6 Agrobacterium liquid culture Day 7 Day 2 amiRNA oligos Agrobacterium transformation Day 4 E. coli liquid culture Day 1 P-SAMS amiRNA Design Oligo ordering Day 3 1-10 min amiRNA sequence
- 18. World-Wide Usage Of P-SAMS (2015) Number of Sessions
- 19. B/c Vectors Are Available @ www.addgene.org
- 20. Some Organizations Having Requested B/c Vectors
- 21. Acknowledgements Mockler lab Todd Mockler Skyler Mitchell Past members: Kevin Cox Kevin Reilly DDPSC Bioinformatics Core Facility Noah Fahlgren Past members: Doug Bryant Steven Hill Carrington lab Jim Carrington Kerri Gilbert Steen Hoyer Robyn Stevens Past members: Atsushi Takeda Josh T. Cuperus Águeda Renovell Sonia Campo
- 22. A B C Specificity Of P-SAMS designed amiRNAs Carbonell et al. Plant Journal (2015)
Editor's Notes
- -En primer lugar quería darle las gracias a Luis por organizar estas jornadas del IBMCP y a Toni por darme un hueco en su sesión para hablar de mi trabajo. -En realidad le pedí a Toni un hueco porque quería dar una charla para mostraros un conjunto de herramientas muy potentes para estudios de función génica basadas en pequeños RNAs artificiales y que he desarrollado en el laboratorio de Jim Carrington en Saint Louis (USA) en los últimos años. Todo el trabajo del que voy a hablar ha sido publicado recientemente en 2014-2015, pero insisto quería dar esta charla en nuestro centro por un lado para estar seguros de que conoceis estas técnicas y por otro lado para convenceros de su tremenda sencillez y utilidad y ojalá que después de oir mi seminario muchos de vosotros os animeis a usarlas. -Por si a alguien le interesase, mi presentación está disponible públicamente en mi cuenta de slideshare en la siguiente dirección.
- Para que se entienda el modo de funcionamiento de los pequeños RNAs artificiales primero necesito introducir brevemente cómo funcionan las rutas posttranscripcionales de pequeños RNAs en plantas. -Estas rutas son iniciadas por un RNA bicatenario generado por un RNA monocatenario con mucha estructura secundaria (como este con forma de horquilla) o por una RNA polimerasa RNA dependiente que usa como moolde un RNA monocatenario para sintetizar el dsRNA -En cualquier caso, el dsRNA es procesado por una proteina Dicer-Like o DCL en duplexes de pequeños RNAs -Normalmente una de las cadenas del dúplex, el pequeño RNA guía, se asocia con una proteína ARGONAUTA y la guía para encontrar RNAs dianas que tienen alta complementariedad de secuencia con el pequeño RNA guía. -Cuando el complejo ternario sRNA/target RNA se forma, se puede inhibir la traducción del RNA diana, o más habitualmente, la AGO lo corta en 2 fragmentos -En la mayoría de los casos son degradados por la maquinaria de degradación de RNA celular, usually two things can happen: the target RNA can be translationally repressed or it can get sliced by the AGO protein into two cleaved fragments. -Sólo para un pequeño conjunto de transcritos esta señal de silenciamiento se puede amplificar ya que uno de los 2 fragmentos puede ser usado como molde por una RDR para sintetizar una nueva molécula de dsRNA que reinicia el ciclo. -Una vez conocido el funcionamiento estas rutas de silenciamiento enseguida se pensó en explotarlas con el objetivo de silenciar genes intencionadamente, y así disponer de una herramienta para el estudio de la función génica o como una vía para controlar patógenos de RNA como los virus. -En ppio si uno era capaz de introducir en la planta alguna forma de dsRNA de secuencia complementaria al gen que quería silenciar era esperable que la maquinaria endógena de silenciamineto hiciera el trabajo de procesar el dsRNA, …., para finalmente silenciar el gen de interés.
- -Esto se ha llevado haciendo desde finales de los 90-ppios de los 2000 expresando en plantas construcciones de tipo hairpin o horquilla que incluyen secuencias del gen a silenciar en orientación sentido y antisentido y separadas por un espaciador (generalmente un intrón). La trascripción del transgén produce un RNA bicatenario de tipo horquilla que es procesado por una DCL en pequeños RNAs interferentes que silenciaran el gen en cuestión que tiene homología de secuencia. Sin embargo, la principal desventaja de esta aproximación es la más que posible falta de especificidad, ya que son tan numerosos los siRNAs que se generan que es muy probable que alguno de ellos acabe uniendo a un gen no deseado y silenciarlo. Por ello se buscaron estrategias igualmente potentes pero más específicas, que son de las que voy a hablar hoy quí. -La primera es la de los microRNAs artificiales. -Aquí el transgen -Esta tecnología es útil para silenciar genes individuales o varios genes de secuencia similar -La segunda es la de los t -Tanto en los amiRNAs como en los syn-tasiRNAs la especificidad viene dada por la capacida de diseñar la secuencia de los sRNAs artificiales y respetar así su especificidad.
- Although these technologies have been extensively used during the last years there still have some limitations: 1. Respect to the design, for example, WMD3 is about the only website to design amiRNAs. Although it is being extensively used, it’s interface is not particularity intuitive, you have to go through multiple non integrated steps to finally get the amiRNA sequence and also the oligo sequences that you need to clone the amiRNA, it takes usually up to 24h to receive an e-mail with the results, you can only target genes from sequenced genomes but not for example un-anotated genes or exogenous genes such as reporter genes (GUS, GFP) or pathogenic RNAs (such as viruses…) and, finally, there is no specific syn-tasiRNA design tool 2. Respect to the cloning, or generation of the amiRNA construct, the preferred amiRNA system from the Weigel lab still uses a very long, slow, multi-step, non-cost effective method that is not compatible with high throughput amiRNA librarie. Finally, there is no syn-tasiRNA cloning systems ready to use in a convenient way. 3. Respect to the expression, although it is true that expression levels are usually high, amiRNA foldbacks are sometimes miss-processed leading to the acumulation of amiRNA species of different sizes that can have off-target effects, that is, that they may target genes other than the one we want.
- To overcome some of these limitations, the goal of the project was to develop a new integrated system for the design, cloning and expression for plant amiRNAs and syn-tasiRNAs in a simple, fast, cost-effective and efficient manner for specific gene silencing of single or multiple genes of interest in both eudicot and monocot species
- For an improved design tool we are building the P-SAMS web tool. P-SAMS stands for the Plant Small RNA Maker Suite. P-SAMS has a very intuitive interface that is compatible with phones and tablets, and has 2 different apps: -the P-SAMS amiRNA Designer and -the P-SAMS syn-tasiRNA Designer for the automated design of amiRNAs and syn-tasiRNA respectively Design (WMD3): -Intuitive interface -Phones and tablets -Wizard-assisted design -Short time to retrieve results (on screen) -Syn-tasiRNA design
- -La importancia de escoger un precursor con corta secuencia tallo-bucle distal es que podemos sintetizar dos oligonucleótidos so relativamente cortos y baratos (75 bases) que van a ser solapantes y complementarios y que cubren la region del amiRNA guía, la región tallo-bucle distal y el amiRNA estrella. -Para el diseño de los oligos es crítico respetar la estructura secundaria del precursor, por lo que hay una serie de reglas a seguir: una vez se tiene la secuencia del amiRNA guía, entonces bastan con
- These vectors are available through Addgene website.
- Una treintena de paises