L4 dna veranderen met revolutionaire precisie sylvia de pater

1Bij ons leer je de wereld kennen
DNA veranderen met
revolutionaire precisie
Sylvia de Pater | Lunteren 13-1-2017

2Universiteit Leiden. Bij ons leer je de wereld kennen
CRISPR/Cas in de media
de Volkskrant sept 2016
Nobelprijs

CRISPR/Cas in de media
De Volkskrant 31-12-2016
Dankzij CRISPR/Cas
kunnen we alles
genetisch veranderen
Malariamug
Doodeng

Presentatie overzicht
1.Wat is CRISPR/Cas?
2.Historie nucleasen
3.DNA herstel in eukaryoten
•NHEJ
•HR
4.Mutagenese mbv CRISPR/Cas in praktijk
5.Voorbeelden
6.Gene drive

Wat is CRISPR/Cas?

CRISPR/Cas
• CRISPR/Cas: Clustered regularly interspaced short palindrome repeats
(CRISPR) / CRISPR associated (Cas) proteins
• Adaptief immuun systeem in bacteriën en archaea tegen vreemd DNA dat de
bacteriecel binnendringt
•Biotechnologie toepassing:
- maken van dubbelstrengs breuken op bijna elke willekeurige plek
- Herstel kan verandering van DNA volgorde veroorzaken

CRISPR/Cas in bacteriën
A. Faag DNA komt
bacterie binnen
B. DNA wordt herkend
en geprocessed door
aantal Cas eiwitten
C. en ingebouwd
D. in CRISPR array
E. CRISPR array RNA
en TRACR RNA
worden
overgeschreven en
geprocessed
F. RNAs vormen
complex met Cas9
G. Faag DNA met
dezelfde volgorde als
het CR RNA wordt
herkend
H. en wordt geknipt
Ratner et al.CSH protocols 2016

Evolutie CRISPR/Cas
Nishimasu (2016) Curr Opin Struc Biol

Evolutie CRISPR RNP complexen
Mohanraju et al. Science 2016;353:aad5147
Klasse 1
Klasse 2

Type II Cas9 effector complexen
Nishimasu (2016) Curr Opin Struc Biol
Verschillende typen uit
verschillende bacteriën:
• Cas9 type II uit
Streptococcus pyogenes
heeft 3’PAM NGG
• Cpf1 type II uit Francisella
novicida heeft 5’PAM TTN

Cas9 domeinen
Cavanagh & Garrity, “CRISPR Mechanism”, CRISPR/Cas9, Tufts University, 2014.
https://sites.tufts.edu/crispr/ (2-3-2017)

sgRNA

Cas9-sgRNA
• Interactie met sgRNA geeft een
conformatieverandering in Cas9

Cas9-sgRNA-DNA
• Cas9-sgRNA zoekt homologie in
ds-DNA
• DSB wordt gemaakt 3bp van PAM

Historie nucleasen

DSB-geïnduceerde mutaties
• Maken van DSB-en op specifieke plekken in genoom was al langer mogelijk
• Specifieke nucleasen maken is lastig en/of duur
• Vaak niet zo actief of specifiek
• CRISPR/Cas is erg makkelijk, goedkoop en snel
• Zeer efficient

Nucleasen
• Mega-nucleasen
- Microbiele DNA nucleasen die 20-40 bp herkennen
- Selfish DNA elementen
- Tijdrovend en duur om specificiteit van DNA binding te
veranderen
• Zink-vinger nucleasen
- 3-6 ZF domein dat 9-18 bp herkent
- gekoppeld aan FokI nuclease domein
• TALE-nucleasen
- 15-20 TALE repeat domein dat 15-20 bp herkent
- gekoppeld aan FokI nuclease domein
• CRISPR/Cas nucleasen
- Cas9-sgRNA complex dat 20 bp herkent
- Zeer eenvoudig om 20bp in sgRNA te veranderen
- Enorme toename van onderzoek en toepassingen
Baltes (2015) Trends in Biotech 33, 120–131

CRISPR/Cas variaties
• Twee nuclease domeinen: RuvC
en HNH
• Beide DNA strengen worden
geknipt
• Mutatie in nuclease domein
geeft enkelstrengsbreuk
Barrangou (2012) Nature Biotech 30: 836

Verbeteren specificiteit
Komor et al. Cell (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.10.044

Veranderen epi-genetische informatie
Activatie genexpressie Repressie genexpressie

DNA herstel in eukaryoten

DNA schade en herstel
Hakem (2008) EMBO J 27, 589

Reparatie van dubbelstrengsbreuken
(geinduceerd) DSB
Chromosoom
HR
Homoloog DNANHEJ
variabele deleties en inserties exacte mutaties

Eiwitten voor herstel van DSBen
geen fouten
specifieke mutaties
veel foutenweinig fouten
Wood (2016) DNA Repair 44, 22–32

Mutagenese mbv CRISPR/Cas
Een praktijkvoorbeeld

Mutaties maken in planten
1. Plek kiezen in genoom waar je mutaties wilt maken
2. Voorwaarden:
- PAM (NGG, onderstreept) moet aanwezig zijn naast deze DNA volgorde
- Restrictie site (ROOD) in de buurt van de knipplaats
AGGAGACTATCTGCAGCATGAGG of TTGCTGTTGAACTACATTGGCGG
3. On line oligo-nucleotiden bestellen
4. Kloneren in plasmide (2 stappen) en in Agrobacterium transformeren
5. (Agrobacterium) transformatie van bv Arabidopsis (zandraket)
6. Analyse van gemuteerde planten
7. In de volgende generatie planten zoeken die in alle cellen dezelfde mutatie hebben

Transgene planten
• Agrobacterium transformatie
• Selectie van transgene planten
• Nakomelingen opgroeien
• Protoporphyrinogenoxidase (PPO) is
essentieel gen
veel mutaties weinig mutaties
Shen et al (2017) doi:10.1534/g3.116.035204

Analyse van mutaties
• DNA isolatie uit 1 of meerdere
planten
• Polymerase chain reaction (PCR)
rond de te verwachtte mutaties
• Knippen met restrictie enzym
• Resistent banden isoleren en
kloneren
• DNA volgorde (laten) bepalen van
PCR producten die resistent zijn
voor restrictie enzym
Mutaties 100% 75% 25% 0%
Gel
-
+

Mutaties in Arabidopsis (zandraket)
WT (Cas9-CRU)
WT CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTGCAGCATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT
PstI
-3 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTGCA---TGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT (3)
-4 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCT----CATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT
-4+1 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATC--C-GCATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT
-6 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATC------ATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT
-7 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTAT-------ATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT
-10 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGAC----------ATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT
-14 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGAC--------------GGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT
-14+6 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTGCA----TTTTAT----GAGAACATTGACGACCCTGCT (2)
-18+6 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTG-------ACGTGT-----GAACATTGACGACCCTGCT
-22+1 CCACAGGGCAACGG-----------A----------ATGAGGTCCCACGAGAACATTGACGACCCTGCT
-41 CCACAGGGCAACGGCCTTGAGGAGACTATCTGCA--------------------------------GAC
WT (Cas9-PPO)
WT CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACATTGGCGGGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA
FauI/PAM
-2 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACATT--CGGGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA
-4 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACAT----GGGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA
-5 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACAT-----GGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA
-6 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTAC------GGGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA
-7 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTAC-------GGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA
-11 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAA-----------GGTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA
-14 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACAT--------------ACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA
-14 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACA--------------AACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA (2)
-17 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTA-----------------ACACCGGAGTTCTGTCCAAGGTAAAAA
-17 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAAC-----------------AAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA (3)
-18 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACAT------------------CGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA
-18 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACA------------------CCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA
-30 CGG------------------------------GTCTACAAACACCGGAATTCTGTCCAAGGTAAAAA
-89+26 CGGAAGAATTTTGCTGTTGAACTACA---GCTTTATTCAACCACGTACACCTAAA------AACTGAT
Aantal mutaties is zeer
variabel: <1% tot 100%
Shen et al (2017) doi:10.1534/g3.116.035204

Volgende generatie
• Kleine plantjes met mutatie in PPO gen:
• Allemaal ‘T’ insertie: Mutant plant. CRISPR/Cas construct uitkruisen
WT TTGCTGTTGAACTACATTGGCGG
Cas9 TTGCTGTTGAACTACATTTGGCGG

Voorbeelden

CRISPR/Cas expressie in planten
• Agrobacterium transformatie met T-DNA met CRISPR/Cas gen
• DNA transformatie met plasmide DNA met CRISPR/Cas gen
• Virale infectie met plantenvirus met CRISPR/Cas gen
• Tijdelijke expressie van CRISPR/Cas zonder integratie in genoom
• Transfectie met gezuiverd Cas9 eiwit en sgRNA
Lengte en gewicht van tarwekorrel
veranderen.
Zhang et al 2016 Nat. Comm. 7,12617
Mutaties in Arabidopsis, tabak, rijst
Woo et al 2015 Nat. Biotech. 33, 1162

Droogte-tolerant mais
Droogte-tolerant dmv CRISPR/Cas
• ARGOS8 is negatieve regulator van ethyleen respons (stress hormoon).
• Verhoogde expressie van ARGOS8 maakt planten minder gevoelig voor ethyleen en
geeft verhoogde opbrengst onder droogte stress.
• Mbv CRISPR/Cas is de promoter uitgewisseld met andere (activere) promoter.
Shi et al (2016) Plant Biotech J doi:10.1111/pbi.12603.
droogte-tolerant droogte-gevoelig

Zetmeel veranderen in aardappel
• Aardappelzetmeel bestaat uit amylose en amylopectine.
• Voor sommige doeleinden wordt alleen amylopectine gebruikt.
• Aardappel heeft 4 genomen; mutatie van 4 genes noodzakelijk.
• Transient expressie CRISPR/Cas: amylose-vrije aardappels.
Wild type 3 mutant allelles GBSS 4 mutant allelles GBSS
amylose amylose NO amylose
Andersson et al Plant Cell Rep 2016

Mutagenese in druif
• Tartaarzuur (wijnsteenzuur) is belangrijk voor de smaak,
mondgevoel en de bewaarcapiciteit van wijn.
• CRISPR/Cas mutagenese van tartaarzuur biosynthese gen
in Chardonnay celsuspensie.
Ren, C. et al. (2016) Sci. Rep. 6, 32289; doi: 10.1038/srep32289.

CRISPR/Cas testen in muizen
• Toedienen dmv virus (adenovirus,
AAV lentivirus), nanodeeltjes (sgRNA
met Cas9 eiwit of mRNA) of injectie
met plasmide DNA of RNA
• Voorbeelden waarbij mutaties in
genen zijn aangebracht:
• Green Fluorescent Protein (GFP)
• Genen gerelateerd aan ziekten zoals
kanker, hoog cholesterol, spierziekte

CRISPR/Cas therapie voor spierziekte
• Duchenne muscular dystrophy (DMD) is een dodelijke spierziekte
• Mutations in the dystrophin gen
• Adenovirus voor toediening van CRISPR/Cas9 in mdx muizen
• Verwijderen van exon 23 uit het dystrophin gen
• Expression (gedeeltelijk) functional dystrophin gen
• Verbetering van spierontwikkeling
Nelson et al. Science 2016;351:403-407

CRISPR/Cas therapie voor longkanker
• Bepaal welke genetische afwijking
een kanker patient heeft (bv in
epidermal growth factor receptor;
EGFR)
• Ontwerp CRISPR/Cas om gen te
herstellen of te compleet uit te
schakelen
• Toediening dmv virus
Tang et al; EMBO Molecular Medicine (2016) DOI
10.15252/emmm.201506006 emmm.201506006

CRISPR testen in mens
• Wedloop USA en China
• China heeft als eerste
gemodificeerde cellen ingespoten in
longkanker patiënten
Cyranovski 2016) Nature 539, 479
Uitschakelen van het PD-1 gen in immuun cellen (rond)
zodat ze kanker cellen beter kunnen aanvallen.

CRISPR/Cas therapie in varkens
• Bescherming tegen porcine reproductive
and respiratory syndrome virus (PRRSV)
• Receptor CD163 is nodig voor het
binnenkomen van het virus in de cel
• Varkens worden niet meer ziek na
uitschakeling van receptor CD163 dmv
CRISPR/Cas
Whitworth, et al; Nature Biotechnology 34, 20–22 (2016) doi:10.1038/nbt.3434
Wild type CRISPR/Cas

Malariamug met CRISPR Gene Drive
Jim Gathany/CDC Anopheles stephensi mug, verspreider van malaria in Azie, die een mens steekt.

Malariabestrijding
• Uitschakelen van genen waardoor vrouwtjes muggen onvruchtbaar worden, waardoor
populaties muggen kleiner worden en malaria niet verspreidt.
(Hammond et al; Nature Biotechnology (2016) DOI:doi:10.1038/nbt.3439)
• Verspreiden van antimalaria-gen, waardoor malaria parasiet niet kan verspreiden.
(Gantz et al; PNAS (2015) DOI/10.1073/pnas.1521077112)
 Mutaties snel verspreiden door populatie: gene drive
Bloedcel geinfecteerd met Plasmodium vivax

Gene drive

Wat is een gene drive?
• Toepassing in de biotechnologie gebaseerd op CRISPR-Cas9.
• Snel en efficiënt verspreiden van een genetische eigenschap in een populatie.
• Verspreiding in organismen die een korte generatietijd hebben.
• Toepassing in organismen die zich geslachtelijk kunnen voortplanten.
Mutatie verspreiding via wetten
van Mendel
Mutatie verspreiding dmv Gene
Drive: alle nakomelingen
krijgen mutatie
Omar S. Akbari et al. Science 2015;349:927-929

Gene drive of mutatie-kettingreactie (MCR)
• A-C Insertie van CRISPR/Cas in locus
• D-E kopieëren naar andere chromosoom
Gantz and Bier (2015) Science;348:442-444
Dicarlo et al (2015) Nature Biotech 33, 1250–1255
• DSB in homoloog chromosoom
• DNA herstel via homologe recombinatie

Gene drive in gist en fruitvlieg
• Ade mutatie geeft rode kleur gist kolonie
Gantz and Bier (2015) Science;348:442-444
Dicarlo et al (2015) Nature Biotech 33, 1250–1255
• Yellow mutatie geeft gele kleur aan vlieg

Veiligheid gene drive experimenten
• Geen regelgeving over gene drive
• Gene drive experimenten nu alleen in labcondities in het buitenland
Akbari et al. (2015) Science 349:927-929

Anti-CRISPR
• Bacteriofaag anti-CRISPR eiwit
inactiveren Listeria monocytogenes
CRISPR-Cas9
• Deze eiwitten voorkomen binding
van Cas9 aan de DNA target
• Inhibitie van genome editing in
E.coli en menselijke cellen
Rauch et al., 2017, Cell 168, 1–9

Regelgeving en politiek
• Discussie over GMO regelgeving (methode (EU) vs product (USA)).
• CRISPR/Cas technologie vraagt om debat over aanpassing van regelgeving.
• CRISPR/Cas gemodificeerde organismen (bv landbouw gewas) zijn niet of moeilijk te
onderscheiden van planten die op een andere manier veredeld zijn.
Montage van DNA neemt hoge vlucht
De ‘verbeterde mens’ is er in 2017 nog niet,
maar het debat over crispr-cas, een genetische
modificatietechniek, kan losbarsten.
Wim Köhler
NRC 6 januari 2017

SchoolTV video en lesbrief
• NTR heeft video over CRISPR/Cas gemaakt (spierziekte FSHD).
• Link naar video en lesbrief komen ter beschikking op website.
• http://schooltv.nl/video/de-kennis-van-nu-in-de-klas-gentechnologie/#autoplay

51Bij ons leer je de wereld kennen
Vragen
b.s.de.pater@biology.leidenuniv.nl

L4 dna veranderen met revolutionaire precisie sylvia de pater

Recommended

Recommended

More Related Content

More from Tycho Malmberg

More from Tycho Malmberg (20)

L4 dna veranderen met revolutionaire precisie sylvia de pater

Editor's Notes