Cultivation.

1. 21.04.2021
1
TIBBİ LABORATUVAR TEKNİKLERİ
SAĞLIK HİZMETLERİ MESLEK
YÜKSEKOKULU
TLT116-TIBBİ MİKROBİYOLOJİ - I
Öğr. Gör. Nüket ÇALIŞKAN
nuket.caliskan@omu.edu.tr
Besiyerine Ekim Yöntemleri
Hafta-5
TLT116-TIBBİ MİKROBİYOLOJİ – I
UYGULAMA
2
MİKROBİYOLOJİK ÖRNEK ALMA VE KÜLTÜR
YAPMA(KÜLTİVASYON)
• Kültür tanımı: üzerinde veya içinde
mikroorganizma üretilmiş besiyerlerine kültür
adı verilir.
• Kültür tipleri:
• Sıvı kültür
• Katı kültür
• Saf kültür
• Karışık kültür
KÜLTÜR YAPMA (KÜLTİVASYON)
• Mikroorganizmaların bulundukları ortamdan belirli
tekniklerle alınarak uygun besleyici ortama
(besiyerine) aktarılması ve burada gelişmelerinin
sağlanması aşamalarını içerir.
• Kültüre ait bilgiler hazırlık aşamasında örnek
besiyerine aktarılmadan besiyerinin hazırlandığı petri
kutusu, tüp, balon veya erlenmayer üzerine
yazılmalıdır.
KÜLTÜRE AİT BİLGİLER
• İnkübasyonun başlatıldığı tarih ve gerekli ise
saat
• Ekimi yapılan örneğin adı veya kodu
• Örneğin dilüsyon oranı (dilüsyon yapılmışsa)
• Gerekirse besiyerinin adı
• Gerekirse inkübasyon sıcaklığı ve süresi
KÜLTÜR ELDE ETME AŞAMALARI
Örnek alma ve alınan örneğin inokülasyona
hazırlanması (aseptik koşullarda)
Dilüsyon hazırlama ve
İnokülasyon (Ekim, Aşılama)
İnkübasyon
KÜLTÜR

2. 21.04.2021
2
AKTARMA TEKNİKLERİ VE KULLANILAN
ALETLER
• İnokülasyon; incelenecek veya geliştirilecek olan
kültür mikroorganizmasının uygun besiyerine
transferidir.
• İnokulasyon işleminde öze, iğne öze, pipet, eküvyon
(yüzeylerden örnek alınırken) kullanılan aletlerdir.
• İnkübasyon: Kültür elde etmedeki en son aşamadır.
Ekim yapılmış besiyeri içeren kabın uygun bir
inkübatörde belirli sıcaklık derecesinde ve belirli süre
tutulması işlemidir. İnkübasyon için genellikle etüv ya
da su banyosu gibi inkübatörlerden faydalanılır.
AKTARMA TEKNİKLERİ VE KULLANILAN
ALETLER
• Ekim yapılarak bir besiyerinde üretilmiş
(kültürü yapılmış) mikroorganizmaların çeşitli
amaçlar için (çoğaltma, saf kültürlerini elde
etmek, üreme ve biyokimyasal özelliklerini
incelemek vb.) besiyerinden özeler kullanarak
yeni besiyerine aktarma işlemine pasaj denir.
Besiyerine Ekim Yöntemleri
• Sıvı besiyerinde hazırlanan kültürlerde:
✓ Mikroorganizmalar uygun koşullarda sıvı besiyerinde, katı besiyerine göre
daha hızlı ürer.
• Bakterinin üremesi tüpte bulanıklık oluşması ile anlaşılır.
• Bulanıklık homojen, üst yüzeyde zar veya dipte çöküntü
oluşturacak şekilde olabilir.
• Katı besiyerinde ise bakteriler tabaka halinde veya tek
tek koloni oluşturacak şekilde üreyebilirler.
✓ Katı besiyerine ekilen mikroorganizmalar, düştüğü alanda bölünüp
çoğalarak koloniler oluşturur. Koloniler, birçok hücrenin üst üste, yan yana
gelmesiyle oluşan bir hücre yığınıdır.
PETRİ KUTUSUNDAKİ AGARLI BESİYERİNE
İNOKULASYON
• Tek Koloni Ekimi (Sürme)
• Yayma
• Dökme tekniklerinden birisi kullanılarak
inokülasyon yapılabilir.
Tek Koloni Ekimi (Sürme Yöntemi)
• Tek koloni ekiminde amaç, plak yüzeyine ekimi
yapılacak mikroorganizma kolonilerini diğer
bakteri kolonilerinden ayrı üretmektir.
• Ekim örneğindeki hastalık yapıcı
mikroorganizmanın örnekte bulunan diğer
mikroorganizmalardan izolasyon ve
idendifikasyonunun yapılması için öncelikle
tek koloni elde edilmesi gerekmektedir
Tek Koloni Ekimi (Sürme Yöntemi)
• Ekim örneği, plak besiyerinin yüzeyine öze (ekim yapmak için
kullanılan alet) ile tek koloni (seyreltme ekimi) ekim tekniği
uygulanarak ekilir.
• Tek koloni ekiminde besiyerinin ilk ekim bölgeleri birbirine
yakın şekilde çok sayıda bakteri içerirken son ekim alanlarında
birbirlerine uzak çok az sayıda bakteri bulunur.
• Plak besiyerlerinde ayrı ayrı düşmüş bakteriler, diğer
bakterilerden bağımsız şekilde üreyerek bakterinin genetik
yapısına ve türünün özelliklerine uygun tipik koloni yapılarını
oluştururlar.

3. 21.04.2021
3
Tek Koloni Ekimi (Sürme Yöntemi)
Kolonilerin;
• Büyüklüğü,
• Biçimi,
• Yapısı,
• Rengi,
• Kokusu,
• Hemolitik aktivitesi (alyuvarları hemoliz etme)
bakteri türlerinin ayırt edilmesinde önemli
özelliklerdir
Tek Koloni Ekimi (Sürme Yöntemi)
• Laboratuvara ilk defa gelmiş idrar, BOS gibi sıvı
örnekler, gaita, balgam vb. katı örnekler ve bunların
sıvı kültürlerinden plak yüzeyine tek koloni ekimleri
yapılır.
• Laboratuvara gelen mikrobiyolojik örneklerin
alındıkları eküvyonlarla (Örnek almak amacıyla
kullanılan çubuk) veya gaita, idrar, balgam vb.
gönderildikleri steril kaplarından, eküvyon, öze, steril
cam pipet, otomatik pipet vb. uygun ekim araçları
kullanılarak aşağıdaki yöntemlerle plak besiyeri
yüzeyine ekimleri yapılır.
Yayma Tekniği
• petri kutusundaki besiyeri yüzeyine pastör
pipeti ya da 0.1 mL örnek aktarılır. Örnek
Drigalski özesi kullanılarak kurutulmuş agar
yüzeyine uygun şekilde yayılır.

4. 21.04.2021
4
Yayma Tekniği
Yayma tekniği ile ekim aşağıdaki şekillerde
gerçekleştirilir.
✓ Öze ile yaygın ekim
✓ Eküvyonla yaygın ekim
✓ Ekim örneğinin otomatik pipetle besiyerine nakletme
ve ekimi
✓ Drigalski spatülü (yayma yöntemi ile sayımda
kullanılan cam ya da metalden yapılmış kıvrık
çubuk.)kullanarak plak besiyeri yüzeyine yaygın ekim
yapma
Yayma Tekniği
• Antibiyogram testinde ve idrardaki bakterilerin
sayılmasında kullanılan ekim yöntemdir.
• Plak yüzeyine yaygın ekimde amaç ekim
örneğinde bulunabilecek mikroorganizmaların
plak besiyerinin tüm yüzeyinde yaygın bir
şekilde üremelerini sağlamaktır.
Yayma Tekniği
• İdrar kültürlerinden yapılan yaygın ekimler sonunda üreyen
mikroorganizmaların koloni sayımına dayalı (ekim örneğinin 1
ml’de bulunan) canlı bakteri sayımları da yapılır.
• Bu amaçla bakteri sayımı yapılacak ekim örneğinden ölçülü
öze, otomatik pipet ya da pipet kullanılarak genelde 0.1 ml
örnek besiyerine aktarılarak ekim yapılır.
• Antibiyotik duyarlılık testlerinde Mc Farland bulanıklık
standartlarına göre ayarlanmış içinde belirli sayıda bakteri
bulunan besiyerinden eküvyonla ekim örneği alınır, yine
eküvyonla besiyeri yüzeyine yaygın ekim yapılır.
Dökme plak yöntemi (Plak Besiyeri İçine Ekim )
• Sıvı kültürlerden veya sıvı örnekten (seri
dilüsyonlar yapılmış) steril pipetle 1mL
alınarak steril boş petri kutusuna aktarılır.
Üzerine daha önceden sterilize edilmiş ve 44-
48°C’ye ayarlanmış su banyosunda tutulan
katı besiyerinden petri kutusuna 15-20 mL
dökülür. Besiyeri içerisinde örneğin homojen
dağılması sağlanır.
Dökme plak yöntemi (Plak Besiyeri İçine Ekim )
• Plak besiyeri içine ekim, bakterilerin besiyeri
içinde oluşturdukları koloni morfolojilerini
görmek ve uygun O2 koşullarında üremesini
sağlamak amacıyla ekim örneğinin daha
önceden seyreltilerek katı besiyeri içine
yapılan ekim yöntemidir.

5. 21.04.2021
5
Tüpte Ekim Yöntemleri
• Tüpte Yatık (Yatık Jeloza) Besiyerine Ekim
• Tüpte Dikey Besiyerine Ekim
• Dik Jeloz Besiyerine Çalkalama Kültürü Ekimi
Tüpte Yatık (Yatık Jeloza) Besiyerine Ekim
• Kültürü yapılmış mikroorganizmanın belirlenen uygun
kolonisinden iğne öze ile örnek alınarak besiyeri içine
ve yüzeyine yapılan ekimdir.
• Amacı bakterinin;
✓ Saf kültürünü elde etmek,
✓Pigment oluşumunu sağlamak,
✓Karbonhidratlı besiyerlerinde gaz oluşturmasını sağlamak,
✓Bakterilerin yayılarak üremesiyle hareketlerini incelemek
vb. çalışmaları yapmak amacıyla uygulanan bir ekim
yöntemidir.
Tüpte Dikey Besiyerine Ekim (Batırma Ekim)
• Yüksek tabaka halinde dik olarak katılaştırılmış
besiyerinde bir iğne ile derin kısımlara tek bir
noktadan batırarak ekim yapılır.
• Bakterilerin hareketlerini, karbonhidratlar üzerindeki
etkilerini, bakterilerin gaz oluşturma vb. özelliklerini
araştırmak amacıyla yapılır. Ayrıca fakültatif anaerop
bazı bakterilerin uygun dik besiyerine ekimleri
yapılarak üreyen bakterilerin uygun koşul ve ortamlar
sağlanarak uzun süre saklanmasında da kullanılır.
Dik Jeloz Besiyerine Çalkalama Kültürü Ekimi
• Bakterilerin oksijene karşı duyarlılıklarını
belirlemek amacıyla yapılan ekim yöntemidir.

6. 21.04.2021
6
SAF KÜLTÜR
✓Bakterilerin kültür karakterlerinin incelenebilmesi için
diğer mikroorganizmalarla karışık olmadan saf olarak
üretilmesi gerekir.
✓Steril olmayan bir klinik örnekten yapılan kültürler
sonucunda karışık kültür elde edilir.
✓Bir karışık kültürden izole edilen farklı bakterilerin ayrı
ayrı tanımlanabilmesi için saf kültür olarak üretilmeleri
gerekir.
Tek tip mikroorganizmadan oluşan topluluğa saf
kültür denir. Değişik ortamlarda saf veya karışık
halde bulunan mikroorganizmları katı besiyeri
yüzeylerine veya sıvı besiyerine ekmede değişik
yöntemler kullanılır. Genelde bu ekimler öze ile
yapılır.
Çizgi ekim yöntemleri
Herhangi bir kültürün saflığını test etmek için
o kültürden katı besiyerine özeyle çizgi ekim
yapılır. İnkübasyon sonucunda benzer
görünümde koloniler oluşuyorsa kültür
muhtemelen saf demektir. Fakat, farklı tipte
koloniler meydana gelmişse karışık demektir.
Ayrıca bu kolonilerden yapılan boyama ve
mikroskobik inceleme sonucunda benzer
şekilli mikroorganizmalar görülürse saflık test
edilmiş olur. Aksi durumda kültür saf değildir.
SAF KÜLTÜR ELDESİ
• Tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarında hastadan alınan
inceleme örneklerinde hastalık etkenlerinin
identifikasyonunun (tanımı) yapılması gerekmektedir.
• Mikrobiyoloji laboratuvarlarında başvurulan
identifikasyon yöntemlerinden biri de etkenin uygun
katı besiyerine ekim yapılarak kültür elde edilmesidir.
• Uygun katı besiyerlerinde kültürleri yapılmış
mikroorganizmaların koloni özelliklerinden
yararlanılarak diğer mikroorganizmalardan
izolasyonları (ayırma işlemi) yapılır.
SAF KÜLTÜR ELDESİ
• Kültür yöntemiyle mikroorganizmanın
izolasyonunda uygun besiyeri seçimi
önemlidir.
• Ekimi yapılacak örneğin hastadan alındığı
bölge ve etken hakkındaki tahminler ekim
yapılacak besiyeri seçiminde rol oynar.
SAF KÜLTÜR ELDESİ
• Boğaz kültürleri: Kanlı agar, çikolatalı agar
• Gaita: EMB, SS agar
• Balgam: Kanlı agar, çikolatalı agar, EMB,
sabouraud agar
• BOS: Kanlı agar, çikolatalı agar, EMB
• Kan: Beyin – kalp infüzyonlu agar
• İdrar: Kanlı agar, EMB
• Yara: Kanlı agar, thioglikolatlı sıvı, EMB

7. 21.04.2021
7
Saf Kültür Elde Edilmesi
Bakterilerin üreme ve koloni yapısının, morfolojik
özelliklerinin, biyokimyasal etkilerinin, antijen
yapılarının tanınması ve antibiyotiklere
duyarlılık deneylerinin yapılması için saf kültür
olarak üretilmeleri gereklidir.
• Saf kültürün tanımlanması için:
– Morfoloji,
– Besin ihtiyacı,
– Kültür ve biyokimyasal özellikleri,
– Antijenik yapıları,
– Patojenitesi göz önüne alınır.
1. Petri kutusunda azaltma yöntemi:
– Petri 4 bölgeye ayrılır, öze ile alınan örnekten 1.
alandan başlayarak 4. bölgeye kadar ekim yapılır.
– Bir gece etüvde inkübe edildikten sonra 1. bölgede
en fazla 4. bölgede en az bakteri kolonisi elde edilir.
– Tek kolonilerden ekim yapıldığında o bakterinin saf
kültürü elde edilir.
2. Örnek özel bir işlemden geçirildikten sonra ekim
yapılır
1. Sporlu bakterileri üretmek için örnek 800C’de 10 dak
veya etil alkolde 1 saat bekletilir.
2. Tüberküloz bakterisini üretmek için örnek %4 NaOH ile
30 dak muamele edilir. Bu sürede aside dirençli
olmayan diğer bakteriler ölürler.
3. Özel Besiyerleri Kullanılır
1. Fazla tuz içeren (Chapman) besiyeri………..Stafilokoklar
2. Alkali besiyerleri………… Vibrio cholerae
3. Antibiyotikli besiyeri……Antibiyotiğe dirençli bakteriler
Katı Besiyerinde Bakteri Koloni Özellikleri
• Bakteri kolonileri her bakteri için özeldir.
Prensip olarak belirli bir cins bakteri, aynı
birleşimdeki besiyeri ve aynı ortam
koşullarında her zaman aynı morfolojik
özellikte koloniler oluşturur.
• Bakteri kolonilerinin büyüklüğü, biçimi, rengi,
kokusu, hemolitik aktivitesi bakteri türlerinin
ayırt edici özelliklerindendir.
S (smooth) koloni:
• Yuvarlak, düzgün kenarlı, düzgün yüzeyli, hafif
kabarık, nemli ve homojen kolonilerdir. Klinik
önemi olan bakterilerin çoğu S-koloni
oluşturur.

8. 21.04.2021
8
R (rough) koloni:
• Düzgün olmayan, yüzeyleri buruşuk veya tanecikli, kenarları
girintili çıkıntılı, yassı, basık görünümlüdür. Bacillus antracis,
Mycobacterium tuberculosis’in kolonileri R şeklindedir.
• S ve M koloni oluşturan bakterilerin kültürleri uzun süre
bekletilir veya uygun olmayan besiyerlerinde üretilirlerse R-
koloni tarzında üreme gösterirler.
M (mucoid) koloni:
• Polisakkarit kapsüllü bakterilerin oluşturduğu koloni
tipidir. Bu bakteriler, uygun zenginleştirilmiş
besiyerinde üretildiklerinde, sümüksü görünümlü,
yapışkan, parlak koloniler oluşturur.
• Koloniye öze ile dokunulup çekildiğinde koloni iplik
gibi uzar.
L tipi koloni:
• Yüzeyleri kabarık, granüllü, besiyeri içine doğru mıh gibi uzantı
yapan, bu kolonilerin görünümü aynı zamanda “sahanda
yumurta” görünümü olarak da tarif edilir.
• Bakterilerin L formları ve Mycoplasma türleri L-koloni
oluşturur. Bu bakterilerin kolonileri büyüteçle görülebilecek
kadar küçüktür.
Kültürler Nasıl Saklanır?
• Yeni bir besiyerine ekim yapılır (pasaj yapmak).
• Madeni yağ veya sıvı parafinle kültürler kapatılır.
• Liyofilize edilir.
– Kültürler hızla dondurulup, vakum altında kurutulurlar.
– Bu yöntemle çok uzun süre saklanabilirler.
• Soğukta saklanır.
– Aşılar, serumlar, bakteri kültürleri +40C’de,
– Virus içeren örnekler -200C ve hatta -700C’de saklanırlar.