克隆心得
- 1. 克隆心得——帮助新手快速做出克隆
一、片断平移的克隆（也适用于多片断连接）
简介：将用作载体的质粒 A（制作大片断）酶切 3μL ，要切出小片断的质粒 B 酶切 7μL；
琼脂糖回收胶电泳；切胶回收来自质粒 A 的大片段，和来自 B 的小片断，并回收到一管中；
酚氯仿法回收 DNA，酒精沉淀，干燥；加入 8μL 水、1μLligase Buffer、1μL ligase ，
4℃过夜；次日转化涂板。
酶切
配置可酶切共 10μL 质粒的酶切反应体系（双酶切）：
（提示 在克隆设计时尽量使用好切的内切酶<通常是效价高、便宜量大的酶>，且注意这两
个酶有比较兼容的 Buffer，即在这种公用 Buffer 中，两酶的效力变化不大<至少保持 60%
的活性>。酶切体系根据需要，可加入 BSA。）
酶切体系
A 质粒酶切－制作载体片断
公用 Buffer 3μL
酶I 1μL
酶 II 1μL
质粒 3μL
双蒸水 22μL
合计 30μL
B 质粒酶切－制作插入片断
公用 Buffer 7μL
酶I 2μL
酶 II 2μL
质粒 7μL
双蒸水 52μL
合计 70μL
混匀
37℃，酶切 3 小时。
（提示 关于酶量的问题。通常的内切酶效价在 10U/μL 左右，3μL 内切酶相当于 30U，足
够切 10μL 的质粒。因为通常小提质粒的浓度在 200－600ng/μL，一般浓度达不到
1μg/μL。根据 1U 酶切 1μg 质粒的原则，这一酶量是足够的。）
- 2. 1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）
1. 酶切产物加入 10％量的上样 Buffer，混匀。使用 1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产
物。
2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个 1.5mL 离心管
中。 （提示: 切胶前，需用分别含酒精、 NaOH 和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污
染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）
3. 12000rpm 1 分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻 20 分钟。
4. 取 200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化 Tip 头尖端，两 Tip 头尖相对来回相接触，
在 Tip 头顶部制成直径 3mm 左右的平头，准备用于碎胶。
5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用 200μL 枪套上平头 Tip 头，捣碎凝胶。（提示
200μL 的枪足够粗壮，不要用 100μL 的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，
轻而频率高地捣碎凝胶）
6. 凝胶管中加入 500μL 双蒸水，盖紧，振摇 200 下。
7. 加入 500μL Tris 饱和纯酚，盖紧，振摇 200 下。 12000rpm 4℃ 离心 15 分钟。
8. 在一新 1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤 7 的上清加入本
步骤离心管中。盖紧，振摇 200 下。 12000rpm 4℃ 离心 5 分钟。
9. 在一新 1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、 20μL 3M 的醋酸钠。 将步骤 8 的上
清小心加入本步骤离心管中。 颠倒数次混匀。 12000rpm 4℃ 离心 15 分钟。（提示 吸取步骤
8 中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。
另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）
10. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上 5 分钟。 室温下吹风干燥。 （提示 可将试管至
于超净台吹风干燥。 如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散
挂在管壁上，再打开管盖吹风。）
连接
向回收 DNA 的试管中加入 8μL 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将
液体甩到管底，再加入 1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，
瞬时离心将液体甩到管底。 置 4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer 应该在首次融解后分装，
每管可 2-3μL，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆。）
二、PCR 产物接入质粒的克隆
简介： 取 100μL PCR 产物，酒精沉淀、 干燥，直接加入酶切体系酶切；将用作载体的质粒
A（制作大片断）酶切 3μL；切胶回收来自质粒 A 的大片段，和来自 PCR 产物的小片断，并
回收到一管中；酚氯仿法回收 DNA，酒精沉淀，干燥；加入 8μL 水、1μLligase
Buffer 、1μL ligase ，4℃过夜；次日转化涂板。
PCR 产物回收
1. 制备 100μL PCR 产物。
2. 将 100μL PCR 产物加入一 1.5mL 离心管中，再加入 400μL 双蒸水，颠倒混匀。加入
900μL 预冷 无水乙醇、 20μL 3M 的醋酸钠。颠倒数次混匀。 （提示 本方法使用的醋酸钠量
- 3. 较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）
3. 4℃静置 30 分钟，以利于核酸沉淀。
4. 12000rpm 4℃ 离心 15 分钟，沉淀核酸。
5. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上 5 分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至
于超净台吹风干燥。 如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散
挂在管壁上，再打开管盖吹风。）
酶切
直接在回收 PCR 产物的试管中配置酶切体系：
PCR 产物酶切－制作插入片断
公用 Buffer 6μL
酶 I 3μL
酶 II 3μL
PCR 产物 ——
双蒸水 48μL
合计 60μL
要将 PCR 产物接入的质粒载体 A，取 A 质粒 3μL 进行酶切。
A 质粒酶切－制作载体片断
公用 Buffer 3μL
酶 I 1μL
酶 II 1μL
质粒 3μL
双蒸水 22μL
合计 30μL
混匀
37℃，酶切 3 小时。
1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）
1. 酶切产物加入 10％量的上样 Buffer，混匀。使用 1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产
物。
2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个 1.5mL 离心管
中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、 NaOH 和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污
染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）
3. 12000rpm 1 分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻 20 分钟。
4. 取 200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化 Tip 头尖端，两 Tip 头尖相对来回相接触，
在 Tip 头顶部制成直径 3mm 左右的平头，准备用于碎胶。
5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用 200μL 枪套上平头 Tip 头，捣碎凝胶。（提示
- 4. 200μL 的枪足够粗壮，不要用 100μL 的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，
轻而频率高地捣碎凝胶）
6. 凝胶管中加入 500μL 双蒸水，盖紧，振摇 200 下。
7. 加入 500μL Tris 饱和纯酚，盖紧，振摇 200 下。 12000rpm 4℃ 离心 15 分钟。
8. 在一新 1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤 7 的上清加入本
步骤离心管中。盖紧，振摇 200 下。 12000rpm 4℃ 离心 5 分钟。
9. 在一新 1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、 20μL 3M 的醋酸钠。 将步骤 8 的上
清小心加入本步骤离心管中。 颠倒数次混匀。 12000rpm 4℃ 离心 15 分钟。（提示 吸取步骤
8 中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。
另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）
10. 弃上清，将离心管导致于干净吸水纸巾上 5 分钟。 室温下吹风干燥。 （提示 可将试管至
于超净台吹风干燥。 如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分
散挂在管壁上，再打开管盖吹风）
连接
向回收 DNA 的试管中加入 8μL 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将
液体甩到管底，再加入 1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，
瞬时离心将液体甩到管底。 置 4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer 应该在首次融解后分装，
每管可 2-3μL，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆。）
三、 一步法感受态细胞制作（已经检验过 DH5α 和 BL21 系菌）
来自 Nucleic Acid Research 1988 16 3580
http://www.pubmedcentral.gov/pagerender.fcgi?artid=336520&pageindex=1
（提示：建议首次使用本方法时，先培养 20mL 菌，可得到总数 2mL 的感受态菌，足够作 30
次转化。制作感受态细胞时注意无菌操作。）
1. LB medium 培养至 OD 值 0.3-0.5。
2. 4℃ 3000g（或 6000rpm） 5 分钟。弃上清，收菌。
3. 重悬于原培养体积 1/10 的 TSB 中。
4. 冰上置 10 分钟。 分装，每管 60μL，置冰上。 放入－70℃冰箱。（提示 每次使用拿出一
管，避免反复冻融。 －70℃可保存一年不影响转化效率）
TSB 配方（需高压）：
LB （PH6.1）
10% PEG 3350
5% DMSO
10mM MgCI2
10mM MgSO4
10％ 甘油
- 5. * TSB 的配置同原文稍有改动，即把甘油加入 TSB 并一起高压（简化步骤）。实践数次证明
对于感受态制备没有影响。
5×KCM 溶液配方：（配置数毫升即可，－20 ℃保存，可反复冻融）
0.5 M KCI
0.15M CaCl2
0.25M MgCI2
TSB (100ml)
M.W. 称取质量
Peptone 1g
NaCl 1g
Yeast Extract 0.5g
PEG3350 10% 10g
DMSO 5% 10ml
MgCl2·6H2O 10mM 203.30 1ml 1M 母液
MgSO4·7H2O 10mM 246.47 1ml 1M 母液
Glycol 10% 10ml
调 PH 值到 6.1，然后 0.22μm 滤膜抽滤即可
5×KCM（ 100ml）
M.W. 称取质量
KCl 0.5M 74.55 3.7275g
CaCl2（无水） 0.15M 110.99 1.66485g
MgCl2·6H2O 0.25M 203.30 5.0825g
转化 Protocol：
1. 连接产物 10μL、5×KCM 溶液 10μL、双蒸水 30μL，（共 50μL）混匀，置冰上。
2. 从-70℃冰箱中取 1 支感受态细胞，置冰上。 融化后立即取 50μL，加入步骤 1 中的混合
液中，轻轻吹打数次混匀（不可用力过大，不可涡旋）， 立即置冰上。
3. 冰上放置 20 分钟。
4. 室温放置 10 分钟。
5. 加入 500μL 新鲜 LB， 150 转 37 ℃ 1 小时。
6. 6000 转/分 5 分钟离心收菌。留 150μL 上清（其余上清丢弃），吹打数次，重悬菌体。
7. 涂板。 37 ℃ 孵箱过夜。
（提示：可使用质粒转化该感受态细菌，检验转化效率。 1μL 的质粒转化，DH5α 菌板满板
不可计数；BL21 菌板有 200－300 个菌落。）
- 6. 小结：
本方法采用简洁的步骤。 最有特点的地方是片断回收后收到一个试管中，而不象一般的操作
分别收到不同的试管中，回收后再电泳定量，并计算大小片断的比例，最后配置连接体系。
这种简洁的步骤不仅提高效率、 避免引入人为的误差（例如肉眼对 DNA 的定量的误差），还
减少了 DNA 的损失，保证了更多的 DNA（实际上是全部的 DNA）进入下面的连接反应。
所以本方法的第一个优点，是保证连接和转化中，有“足够量”的核酸。 连接和转化的核
酸量得到保证，克隆成功就得到保证。
例如本方法中，制作大片断的 A 质粒取 3μL，对于通常的小提质粒，3μL 意味者 600－
1800ng 的 DNA。一般认为大片段的适当范围是 50－200ng/10μL 连接反应。本方法即使在回
收过程中损失一半，仍然剩 300－900ng。实际上，使用本方法，在片断平移的克隆中，如
果把转化的菌液全部涂板，得到的克隆多得不可计数；片断平移克隆实际上只取一半转化
菌涂板即可。 PCR 接入载体的克隆效率没有那么高，但是一般也达到 40－60 转化子/平板。
本方法的另一优点，是这些看起来固定的步骤，例如酶切、酶连、以及转化等方案，实际上
已经遵循了很多原则，而且这些步骤之间互相平衡，组成一个很稳定和可操作性很强的系
统。
例如起始酶切 A 质粒和 B 质粒的量——3μL：7μL，已经隐含了载体：插入片断＝1：2~3
的比例（PCR 克隆经折算后大概是 1：5~10）。即使加上 DNA 回收中会损失、大片断和小片断
回收效率不同、 酶切质粒同酶切 PCR 效率不同等影响因素，最后回收在试管中的大小片断比
例仍然可以落在一个合适的范围内。
酶切使用的酶量，是经过计算的。可以保证是采用 3－5 倍的量切割质粒或 PCR 片断，因此
可以保证酶切反应的效率。
连接反应在 4℃下可以达到最大的转化率。实际上对于大多数粘端突出 3 碱基的酶切位点，
18 ℃ 3 小时已经足够。
Nucleic Acid Research 上登载的感受态菌制备方法，可以得到效果很稳定的感受态细胞。
每微克 DNA 可获得 10 的八次方个转化子。
因此，这套方法考虑到了克隆的每个重要环节，并以可靠的手段将这些环节“固定”下来。
这套方法对于操作者和试剂带来的波动也有很好的“容错”能力，或者说，它的系统冗余
比较大，保证了这套方法极高的成功率。
