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南京农业大学学报 2005, 28 ( 2 ) : 37 ～40
Jou rna l of N an jing A g ricu ltu ra l U n iversity
利用巢式 PCR检测玉米细菌性枯萎病菌
1 13 1 1 1 2
王茂华 , 胡白石 , 卢玲 , 刘凤权 , 许志刚 , 陈建东
( 11南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室 , 江苏 南京 210095 ;
21江苏出入境检验检疫局 , 江苏 南京 210001)
摘要 : 利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定 。通过序列比较 , 设计了一
对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物 , 并对所有参试菌株进行扩增 。结果显示 : 该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病
菌中特异性地扩增出 1 条 299 bp 的条带 , 而其他参试菌株没有扩增信号 。与扩增细菌 ITS区域的通用引物结合使用 , 建
立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式 PCR 技术 , 其检测灵敏度可达到 4 个细菌细胞 , 可以准确 、灵敏地检测和鉴
定玉米细菌性枯萎病菌 。
关键词 : 玉米细菌性枯萎病菌 ; 巢式 PCR; 检测
中图分类号 : S41 30 文献标识码 : A 文章编号 : 1000 2030 ( 2005 ) 02 0037 04
Detection of Pan toea stewa rtii subsp. stewa rtii by nested2PCR
13
WANG M ao 2hua , HU B ai2shi , LU L ing , L I Feng2quan , XU Zhi2gang , CHEN J ian 2dong
1 1 1 1 2
U
(11 Key Laboratory of Monitoring and M anagement of Plant D iseases and Insects, M inistry of Agriculture, Nanjing Agricultural
University, Nanjing 210095, China; 21J iangsu Export and I port Inspection and Quarantine Service, Nanjing 210001, China )
m
Abstract: Intergenic transcrip tion spacer ( ITS) areas of Pan toea stew a rtii subsp. stew a rtii ( Pss) and related species were am 2
p lified w ith universal p rim ers and sequenced. Based on the conserved sequence determ ined by alignment using the DNAman soft2
ware, a pair of specific p rim ers was synthesized. A band of 299 bp was amp lified from Pss strains but not from other bacteria test2
ed. U sing this pair of specific p ri ers together w ith universal p rim ers, nested 2PCR was developed for monitor Pss which detected
m
less than 4 bacterial cells by this method.
Key words: Pan toea stew a rtii subsp. stew a rtii; nested 2PCR; detection
玉米细菌性枯萎病是玉米上的一种毁灭性的病害 , 尤其是甜玉米 , 在严重情况下可造成绝产 。目前
[1]
国内尚无该病害正式分布的报道 。玉米细菌性枯萎病菌被我国列为禁止入境的一类检疫性有害生物 。
我国在口岸检疫中 , 一直沿用传统的分离培养 、生理生化鉴定 、噬菌体检测 、免疫荧光染色和致病性试
验等检验方法 , 耗时长 、效率和灵敏度均较低 。
利用病原细菌特有的序列设计引物可以特异性地检测植物病原细菌 。这些特异序列 , 有的是来自于
未知基因 , 如 RAPD 扩增所得的特异性扩增片段 ; 有的来自于已知基因 , 如致病基因 、质粒 DNA 或核
糖体 DNA 等 。细菌 16S 23S rDNA ITS区域选择压力小 , 进化速率快 , 种间的多态性更加丰富 , 而在
[ 2 ～5 ]
种内却非常保守 , 因此可以利用 ITS区域设计引物进行病原细菌检测 , 现已有很多报道 。
本研究根据玉米枯萎病菌 ITS区域序列 , 选择特异性序列 , 设计了一对引物 , 并对其特异性检测和
灵敏度进行了研究 , 以期开发一种快速 、灵敏 、高度特异性检测玉米细菌性枯萎病菌的分子生物学检测
方法 。
1 材料与方法
111 供试菌株及菌悬液制备
供试菌株及其来源见表 1。将供试菌株移于营养琼脂 ( NA ) 斜面上 , 在 NA 平板上划线培养 48 h,
收稿日期 : 2004 06 28
基金项目 : 国家高技术发展研究计划项目 ( 2001AA249021)
3
作者简介 : 王茂华 ( 1975 ) , 博士研究生 。 通讯作者 Corresponding author: 胡白石 ( 1968 ) , 副教授 , 从事植物检疫 、植物病原
细菌研究 , E 2
mail: hbs@ njau1 edu1 cn。
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・38・ 28 卷
南 京 农 业 大 学 学 报 第
挑取单菌落在 LB 培养液中振荡培养 ( 28 ℃, 180 r・m in ) 24 h。取振荡培养菌液 115 mL , 6 000 g 离
- 1
心 5 m in, 收集菌体 。菌体用 1 mL 0101 mol・L 的 PB S缓冲液 ( pH 714 ) 溶解 , 再次离心 、洗涤 3 次 ,
- 1
最后用 115 mL PBS缓冲液溶解 。所得菌液 96 ℃处理 5 m in后冷冻保存备用 。同时用系列稀释法测定振
荡培养的菌液浓度 。
表 1 参试菌株及来源
Table 1 Source of tested isola tes
菌株 菌株代号 来源
Isolates Code Source
华南农业大学
S 2, DC147
W
South China Agricultural University
玉米细菌性枯萎病菌 Pantoea stew a rtii subsp. stew artii
中国植物检疫实验所
7451, 0085
China Plant Quarantine Experim ental Institute
华南农业大学
粟细菌性褐斑病菌 Pantoea stew a rtii subsp. indologenus DCSS1, DCSS2, DCSS4
South China Agricultural University
华南农业大学
石头花根癌细菌 Pantoea agg lom ercm s subsp 1 gypsoph ilae DCSS6, DCSS9
South China Agricultural University
河北省农业科学院
成团泛菌 Pantoea agg lom ercm s Eh
Hebei Academy of Agricaltural Sciences
华南农业大学
菠萝软腐泛菌 Pantoea ananas DC130, DC417
South China Agricultural University
噬夏孢子泛菌 Pantoea uredovora Eu 中国科学院 China Academy of Sciences
天津出入境检验检疫局
分散泛菌 Pantoea dispersa pd
Tianjin Export and I port Inspection and Quarantine Service
m
燕麦噬酸菌 A cidovorax avenae Fc440 D r1 Schaad, USDA , ARS
稻黄单胞菌 X anthom onas oryzae subsp. oryzae GX41 南京农业大学 Nanjing Agricultural University
菊欧文氏菌 E r in ia ch rysan them i
w Ech 南京农业大学 Nanjing Agricultural University
大白菜软腐病菌 E r in ia ca rotovora pv
w . ca rotovora Ecc 南京农业大学 Nanjing Agricultural University
中国植物检疫实验所
梨火疫病菌 E r in ia am ylovora
w 0036
China Plant Quarantine Experim ental Institute
丁香假单胞菌 Pseudom onas syringae pv. syringae Pssy 南京农业大学 Nanjing Agricultural University
荧光假单胞菌 Pseudom onas fluorescence Pf 南京农业大学 Nanjing Agricultural University
112 玉米细菌性枯萎病菌 ITS 序列的扩增与序列测定
由 TaKaRa 公司合成 , 并稀释至 200 μmol・L
[4] - 1
ITS扩增通用引物 , - 20 ℃保存 , 使用前用超纯
水稀释 10 倍 。引物序列如下 :
2GCGCGCGTCGACACCTGCGGTTGGAACACC 2 ′
ITSA: 5 ′ 3
2GCGCGCTCTAGACACCGTGTACGCTTAGTC 2 ′
ITSB: 5 ′ 3
PCR 反应体系包括 : Taq 酶 011 μL , 25 mmol ・L 115 μL , 10 ×PCR 反应缓冲液 215 μL ,
- 1 2+
Mg
215 mol・L dNTP混合液 013 μL , 20 μmol・L 引物 015 μL , DNA 模板或菌体 1 μL , 超纯水补足至
- 1 - 1
25 μL。离心混匀后在 PCR 仪上进行扩增 。
反应程序为 : 94 ℃ 5 m in; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 45 s, 72 ℃ 2 m in, 循环 35 次 ; 72 ℃ 7 m in。
反应结束后取 5 μL 扩增产物于 018%琼脂糖凝胶中电泳 1 h ( 5 V ・cm ) , 紫外灯下观察结果并拍
- 1
照。
[6]
用冻融法 对扩增产物 500 bp 左右的片段进行回收 。步骤如下 : 紫外灯下切取目标片段 , 在灭菌
的 115 mL 离心管中捣碎 , 加入等体积饱和酚 , - 20 ℃迅速冷冻 15 m in 后 , 再取出融化 , 如此反复冻融
3 次 。然后离心 , 取上清液至 1 新的离心管中 , 用等体积的氯仿抽提 , 离心 。取出上清液加入 2 倍体积
无水乙醇 、 1 /10 体积乙酸钠 , 振荡后于 4 ℃静置 30 m in, 离心 。沉淀用 70%乙醇洗涤 2 次 , 离心后去
上清 , 将离心管倒置风干后再用 10 μL 超纯水溶解 , 取 2 μL 电泳检测回收效果 。回收产物交上海联众
公司克隆并测序 。
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第 2 期 王茂华等 : 利用巢式 PCR 检测玉米细菌性枯萎病菌 ・3 9 ・
113 特异性引物的设计与合成
利用得到的玉米枯萎病菌及其近缘种的 ITS序列 , 用生物学软件 DNAman进行序列比较 , 根据玉米
枯萎病菌特有序列设计引物 。引物委托 TaKaRa 公司合成 , 并配成 200 μmol・L 母液 , - 20 ℃
- 1
保存 ,
使用前用超纯水稀释 10 倍 。
114 利用 nested 2PCR 对玉米枯萎病菌进行检测
用合成的引物对参试菌株的菌悬液进行扩增 , 检测其特异性 。
第 1 轮 PCR 反应体系包括 : Taq酶 011 μL , 25 mmol・L M g 112 μL , 10 ×PCR 反应缓冲液 215
- 1 2+
μL , 215 mol・L dNTP混合液 012μL , 20μmol・L 通用引物 014μL , 参试菌体 5μL , 超纯水补足至
- 1 - 1
25 μL。离心混匀后滴加 20 μL 石碏油 , 在 PCR 仪上进行扩增 。扩增条件同 112。
第 2 轮反应体系除了模板为第 1 轮扩增产物 ( 1 μL ) 和引物不同外 , 其余成分相同 。扩增条件 :
94 ℃ 4 m in; 92 ℃ 50 s, 66 ℃ 50 s, 72 ℃ 95 s, 循环 35 次 ; 72 ℃ 8 m in。
PCR 扩增结束后 , 在 018%琼脂糖凝胶上电泳 ( 5 V ・cm ) , 检测结果并拍照 。
- 1
115 Nested 2PCR 的灵敏度与特异性测定
11511 引物特异性测定 用建立的 nested 2PCR 对 4 个玉米细菌性枯萎病菌和其他 17 个参试菌株进行了
5 - 1
测试 , 参试菌株的浓度为 8 × CFU ・mL 。
10
11512
8 - 1
灵敏度测定 用系列稀释法测得 7451 菌菌悬液原液的浓度为 8 × CFU ・mL , 对此菌液的
10
10 ×系列稀释菌液按 nested 2PCR 程序扩增 。
扩增结束后 , 在 018%琼脂糖凝胶上电泳 ( 5 V ・cm ) , 检测结果并拍照 。
- 1
2 结果与分析
211 ITS区域的 PCR扩增
采用通用引物 ITSA、 ITSB 分别扩增了 Pan toea
stew a rtii subsp. stew a rtii的 2 个菌株 ( 7451 和 0085 )
和其近缘种的 5 个菌株 ( DCSS1, DCSS61, DC417,
0036, Ecc ) 。扩增产物依菌株的不同 , 有 3 ～ 5 条
500 ～800 bp 的条带 (图 1 ) , 它们都是 ITS区域扩增
产物 。但由于其中所含 tRNA 基因的拷贝数不同 , 扩
[6]
增出的产物大小不一 。每一菌株的扩增产物均回
收到 500 bp 左右的片段 。 图 1 供试菌株 ITS区域扩增结果
212 玉米细菌性枯萎病菌 ITS 序列特异性引物设计 F ig11 Am plica tion results of ITS area
经上海联众基因公司测序 , 得到 2 株玉米细菌性 (Lane 1 7: 7451, 0085, DCSS1, DCSS6, DC417, Ecc
and 0036; Lane 8: Negative CK; M: DL2000 marker, bands from
枯萎病 菌 和 其 他 相 关 参 试 菌 株 的 ITS 序 列 。利 用
the top down is 2 000, 1 000, 750, 500, 200 and 100 bp , respec2
DNAm an 软件进行序列比较 , 选取差异位点进行引物
tively)
设计 。
按照引物设计的原则 , 选用玉米枯萎病菌 ITS区域第 59 至第 78, 第 340 至第 357 碱基的序列 , 其
特异性强 , 且符合引物选择的原则 。最终设计的引物序列如下 : PSA: 5 ′ GCGCTTGCGTGTTATGAGCT2
2
2
3 ′ PSB: 5 ′
和 AGTCGGCTGCGAAGCCGA 2 ′
3 。该对引物从理论上讲可以扩增 1 条 299 bp 的片段 。
213 特异性检测结果
用合成的引物对 21 个参试菌株进行了 PCR 扩增 , 结果只能从玉米枯萎病菌 7451、 0085、 S 2 和 W
DC147 中扩增出约 300 bp 的特异性条带 (扩增产物经测序大小为 299 bp , 与理论相符 , 数据未给出 ) ,
而从其他参试菌株中不能扩增出此条带 (图 2 ) 。
214 灵敏度测定结果
图 3 结果显示 , 当反应体系中只有 4 个菌体时 , 第 2 轮扩增后仍能观察到 299 bp 的特异性条带 。
因此 , 这种基于 ITS序列的 nested 2PCR 技术检测灵敏度为 4 个玉米枯萎病菌菌体 。
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・40・ 28 卷
南 京 农 业 大 学 学 报 第
图 2 Nested 2PCR特异性检测结果
F ig12 Spec if ic ity of nested 2PCR ba sed on ITS
(Lane 1 4: 7451, 0085, S 2 and DC147; Lane 5
W 10: DCSS1, DCSS2, DCSS4, DCSS6, DCSS9 and Eh; Lane 12 22: DC130,
DC417, Eu, pd, Fc440, GX41, Ech, Ecc, 0036, Pssy and Pf; Lane 11: Negative CK; M: DL2000 marker, bands from the top down is
2 000, 1 000, 750, 500, 200 and 100 bp, respectively)
3 结论
玉米细菌性枯萎病是玉米上危害最重的种传
[7]
细菌病害 , 传入我国的风险很大 。中国加入
W TO 后 , 将向美国等玉米生产国家开放玉米市
场 , 因此需要一种快速 、灵敏 、专一性好的检测
技术来阻止玉米细菌性枯萎病传入我国 。已报道 图 3 Nested 2PCR检测灵敏度
的玉米细菌性枯萎病菌的检测技术主要是传统的 F ig13 Sen sitiv ity of nested2PCR ba sed on ITS
分离培养和血清学技术 , 其耗时长 , 效率和灵敏 (Lane 1 8: 8 ×107 , 8 ×106 , 8 ×105 , 8 ×104 , 8 ×103 , 8 ×
度均较低 。本研究利用 ITS序列设计引物研制的 102 , 8 × 1 , 8 ×100 CFU ・mL - 1 , refer to the second round amp lified
10
nested 2PCR技术可以直接从菌体中扩增出特异性 from the first round respectively)
片段 , 无需提取基因组 DNA , 可以在 6 h内完成检测 , 节省了检测的时间 , 提高了灵敏度 , 可以满足口
岸检疫和田间病害诊断的要求 。
参考文献 :
[1] 姚文国 . 中国进出境植物检疫手册 [M ]. 第 7 版 . 北京 : 中国农业出版社 , 1996. 52.
[ 2 ] L i X, De Boer S H. Selection of polymerase chain reaction p rim ers from an RNA intergenic spacer region for specific detection of C lavibacter
m ich iganensis subsp. sepedon ics [ J ]. Phytopathol, 1995, 85: 837 ～842.
[ 3 ] Takeuchi T, Sawada H, Suzuki F, et a l Specific detection of B urkholderia plan tarii and B.
. g lum ae by PCR using p rim ers selected from
the 16S 23S rDNA spacer regions [ J ]. Ann Phytopathol Soc Jpn, 1997, 63: 455 ～462.
[ 4 ] Kim W S, Gardan L, Rhim S L , et a l
. E r in ia pyrifoliae sp.
w nov , a novel pathogen that affects A sian pear trees ( Pyrus pyrifolia Nakai)
.
[ J ]. Int J Syt Bacteriol, 1999, 49: 899 ～906.
[5] 焦振泉 , 刘秀梅 . 细菌分类与鉴定的新特点 : 16S - 23S rDNA 间区 [ J ]. 微生物学通报 , 2001, 28 ( 1) : 85 ～89.
[6] 郝福英 , 朱玉贤 , 朱圣庚 , 等 . 分子生物学实验技术 [M ]. 北京 : 北京大学出版社 , 1998. 1 ～130.
[ 7 ] B lock C C, H ill J H, McGee D C. Seed transm ission of Pan toea stew artii in field and sweet corn [ J ]. Plan D is, 1998, 82: 775 ～780.
责任编辑 : 夏爱红
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