A very good Information

1. Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnica in vitro bazată pe principiul reacției de polimerizare ADN, prin care o
anumita secventa de ADN poate fi amplificat și transformat în copii multiple. Folosind această tehnică oamenii de stiinta au
acum posibilitatea de a studia gene si proteine intr-un mod mult mai bună și această tehnică a impulsionat domeniul
biotehnologiei în întreaga lume. Acest articol este împărțită în trei părți și acoperă următoarele subiecte:
1. Partea I: Principiul, Componente, procedura și etapele de PCR (articolul actual)
2. Partea a II-: validare, Optimizare, limitările și aplicații
3. Partea III: Variațiile sau Tipuri de PCR și perspectivele de viitor ale PCR
Partea I
Polymerase Chain Reaction este una dintre cele mai importante instrumente de cercetare științifică ingenioase ale secolului 20
in biologie moleculara, care permite amplificarea exponențială de scurte secvente de ADN într-o moleculă de ADN mai catenar
dublu. Acesta a fost inventat de Kary Mullis în asociere cu Fred Faloona, Henry A. Erlich, și Randall K. Saiki în anul 1983, în
timp ce lucra în Emeryville, California pentru Cetus Corporation. Mullis cuprinse procedura: "Începând cu o singura molecula de
ADN-ului de material genetic, PCR poate genera 100 de miliarde de molecule similare într-o după-amiază. Reacția este ușor de
a executa. Este nevoie de nu mai mult de un tub de testare, cateva reactivi simplu, și o sursă de căldură. Reacția este ușor de a
executa. Este nevoie de nu mai mult de un tub de testare, cateva reactivi simplu, și o sursă de căldură ". [1] În 1993 K.Mullis a
câștigat Premiul Nobel chimie pentru dezvoltarea PCR.
Principiu
Polymerase Chain Reaction sau PCR este o tehnică in vitro bazată pe principiul reacției de polimerizare ADN. Ea se bazează
pe cicluri termice constând din cicluri repetate de încălzire și răcire a reacției de topire ADN și replicarea enzimatică a ADN-ului,
folosind ADN polimerază termostabilă, secvența primer (complementar la regiunea țintă) și dNTP. Se poate amplifica astfel o
secvență specifică de ADN de cat mai multe ca un miliard de ori. Cele mai multe metode de PCR pot amplifica fragmente de
ADN de până la ~ 10 perechi de baze kilogram (kb), deși unele tehnici permit amplificarea fragmentelor de până la 40 kb în
dimensiune.
Componente
Componentele de bază și reactivii necesari infiintarii o reacție PCR 100 ul sunt:
1. Tub Microfuge.
Acestea sunt mici de plastic cilindrice recipiente conice cu fund conic, cu un capac clipă. Ele sunt formate din polipropilenă,
astfel poate rezista la o gamă largă de temperatură.
2. Thermal Cycler.
Este un aparat utilizat pentru a amplifica segmente de ADN. Ea are un bloc termic cu gauri unde pot fi introduse tuburi care
dețin amestecurile de reacție PCR. Ciclor funcționează pe principiul efectului Peltier, care ridică și coboară temperatura blocului
într-o manieră pre-programat prin inversarea curentului electric.Tuburi de reacție cu pereți subțiri permite conductivitate termică
favorabil pentru a permite echilibrarea termică rapidă.
3. matriță de ADN.
Soluția de reacție trebuie să conțină cel puțin (1e5-1e6 molecule țintă).
4. Primer.
Acestea sunt oligonucleotide care definesc secvența de amplificat. Două primer care sunt complementare 3 "(trei prim) se
încheie de fiecare sens și anti-sens componenta a obiectivului de ADN (Tm 52-58 grade Celsius preferat). Primerii cu

2. temperaturi de topire mai 65 grade Celsius au o tendință de recoacere secundar. Conținutul GC (numărul de G și lui C în
primerul ca procent din totalul bazelor) de grund trebuie să fie 40-60%. [2]
Formula pentru grund calcul Tm:
Temperatura de topire Tm (OK) = {AH / ΔS + R ln (C)}; Or topire temperatura Tm (° C) = {AH / ΔS + R ln (C)} - 273,15 unde
AH (kcal / mol): H este entalpia. Entalpia este cantitatea de energie termică posedat de substanțe. AH este schimbarea în
entalpie. În formula de mai sus SH se obține prin însumarea tuturor valorilor pereche de entalpie di-nucleotide ale fiecărei
perechi de baze mai apropiat vecin.
ΔS (kcal / mol): S este valoarea de tulburare a exponate sistem este numit entropie. ΔS este schimbarea în Entropy. Aici se
obține prin însumarea tuturor valorilor de entropie Perechea di-nucleotide de fiecare apropiat perechi de baze vecin. Se adaugă
o corecție suplimentară de sare ca cel mai apropiat parametrii Vecinul au fost obținute de la studii de topire ADN efectuate în
1M Na + tampon și aceasta este condiția implicit folosit pentru toate calculele.
ΔS (corecție sare) = ΔS (1M NaCl) + 0.368 x N x ln ([Na +])
Unde
N este numărul de perechi de nucleotide în primerul (lungime grund -1).
[Na +] este sare echivalent în mM.
Temperatura de cuplare a primerului este definit prin formula:
Ta = 0,3 x Tm (grund) + 0,7 Tm (produs) -14.9
unde, Tm (primer) = Temperatura de topire a primerilor
Tm (produs) = temperatura de topire a produsului
5. Tris-HCl.
Soluția tampon recomandată este de 10 până la 50 mM Tris-HCl (pH 8.3-8.8) la 20 grade Celsius.
6. MgCl2.
Este cofactor al enzimei. Este benefic pentru a optimiza concentrația de ioni de magneziu. Ionul de magneziu afectează
recoacere grunduri, temperaturile strand disociere de șablon și produs de PCR, specificitate produsului, formarea de artefacte-
primer dimer și a activității enzimatice și fidelitate. Taq ADN polimerază necesită magneziu liber, care se leaga la ADN, primeri,
și dNTPs.
7. KCl.
KCl este de a fi utilizate pentru reacție a facilita alinierea primerului.
8. Gelatina sau ser bovin.
Gelatină Aautoclaved sau albumine serice bovine-nuclează liber sunt incluse pentru a ajuta la stabilizarea enzimei.
9. apă distilată.
A fost folosit apă distilată autoclavizat. Volumul depinde reacția.

3. 10. trifosfați Deoxyneuclotide.
Acestea sunt pietrele de temelie ADN. DNTP (TTP-timidina trifosfat), dCTP (trifosfat deoxycyctidine), soluții dATP (trifosfat
dezoxiadenozină) și dGTP (deoxiguanozină trifosfat) neutralizată la pH 7,0. Soluție stoc primar sunt diluate la 10 mm, alicote, și
depozitate la stocul de lucru -20 grade C. O conținând 1 mM este recomandat fiecare dNTP. Stabilitatea în timpul dNTP cicluri
repetate de PCR este de așa natură încât aproximativ 50% rămâne la fel de dNTP după 50 de cicluri (Corey Levevenson,
comunicare personală).Concentrațiile dNTP între 20 și 200 de uM este cel mai bun pentru reacția. 4 dNTP ar trebui să fie la
concentrații echivalente pentru a minimiza eroare mis-încorporare.
11. ADN polimerazei.
Este o enzima care catalizează reacția. Taq ADN polimerază izolat din Thermus aquaticus în creștere în izvoare termale
acționează cel mai bine la 72 grade Celsius, iar temperatura de denaturare a 90 de grade Celsius nu distruge activitatea sa
enzimatică. Alte enzimă termostabilă ca Pflu ADN polimerază izolat dinPyrococcus furiosus și Vent polimeraza izolată
din litoralis Thermococcus , au fost descoperite și s-au dovedit a fi mai eficient. O concentrație recomandat de polimerază Taq
(Perkin-Elmer Cetus) este între 1 și 2,5 unități (SA = 20 unități / pmol) la 100 uL reacție. Cu toate acestea activitatea enzimatică
va varia cu privire la template-uri țintă individuale sau primeri.
Pentru a configura un uL reacție 25 sau 50 concentrația reactivului sunt următoarele:
Reactiv
Tampon 10X 2.5 uL 5 uL
dNTP 0,5 1
Primer 1 2
Primer Reverse 1 2
Polimerază Taq 0,15 0,3
apă 18,85 uL 38,7 uL
ADN (30-50 ng) 1 1
Volumul total 25 uL 50 uL
Procedură
Reacție de polimerizare în lanț este construit pe 20-40 cicluri repetate în cazul în care modificările de temperatură în fiecare
ciclu. Ciclism începe cu un singur pas de temperatură (denumit apăsat) la o temperatură ridicată (> 90 de grade Celsius), urmat
de o așteptare de la sfârșitul de prelungire a produsului final sau pentru depozitare scurt.[3] Diversele etape ale PCR sunt:
1. Inițializarea pas.
Acesta este primul pas al ciclului care constă din ridicarea temperaturii de reacție la 94-96 ° C sau 98 ° C dacă se utilizează
polimerazele extrem termostabile, care are loc timp de 1-9 minute. Acest proces activeaza polimeraza ADN utilizat în reacție. [4]
2. Denaturarea pas.
Se compune din încălzirea amestecului de reacție la 94-98 grade Celsius timp de 20-30 de secunde. Acest lucru ajută la
spargerea legăturile de hidrogen dintre baze complementare, rezultând molecule ADN mono-catenar.
3. pas Recoacerea.

4. Amestecul este acum răcit la o temperatură de 50-65 grade Celsius timp de 20-40 de secunde care ajută la recoacerea
primerilor la șablonul ADN monocatenar. Legături de hidrogen stabilă ADN-ADN sunt formate numai atunci când secvența
primer potrivește îndeaproape secvența matriță care permite recoacere a grundului la secvențele complementare ale ADN-
ului. De regulă, aceste secvențe sunt situate la capătul 3 'al celor două categorii ale segmentului de a fi amplified.The durata de
recoacere pas este de obicei de 1 min, timp, primul cât și ciclurile ulterioare de PCR. Deoarece concentrația de grund este
menținut foarte mare față de cea a ADN-ului șablon, formarea primer-matriță hibrid este mult favorizată față recoacerea firelor
șablon. [5]
4. Extinderea / alungire pas.
Este un proces dependent ADN polimerază. Polimerază Taq are temperatura activitate optimă la 75-78 grade
Celsius. Temperatura la acest pas depinde ADN polimerazei utilizat; Polimerază Taq are temperatura activitate optimă la 75-80
grade Celsius. Temperatura este reglată astfel încât acum polimeraza ADN sintetizează catenele complementare prin utilizarea
3'-OH a primerului. Primerii sunt extinse spre altele în așa fel încât segmentul de ADN situată între cei doi primeri este
copiat; aceasta este asigurată prin utilizarea primeri complementari la capetele 3 'ale segmentului de a fi amplificate. Durata de
extensie a primerului este de obicei de 2 minute la 72 ° C. Taq polimerază amplifică obicei fragmente de ADN de până la 2
Kb; sunt necesare pentru amplificarea de segmente lungi condiții de reacție speciale. Ca regulă degetul mare, la temperatura
optimă, ADN polimeraza va polimeriza o mie de baze pe minut, ceea ce duce la exponențială (geometric) amplificarea
fragmentului de ADN specific. [6] [7]
5. alungire finală.
Acest pas este realizată la o temperatură de 70-74 grade Celsius timp de 5-15 minute după ultimul ciclu PCR pentru a se
asigura că orice ADN monocatenar rămas este complet extins. [5]
6. așteptare finală.
În această etapă, amestecul este lăsat să se răcească la o temperatură de 4-15 grade Celsius pentru depozitarea pe termen
scurt a reacției. [5]
Etapele PCR
1. amplificare exponențială.
Ca urmare a fiecărui ciclu, numărul de copii ale segmentului dorită devine de două ori numărul prezentă la sfârșitul ciclului
anterior.
Cu cat mai multe ori cele trei cicluri PCR se repetă mai mult ADN-ul puteți obține. Acest lucru se datorează faptului că fiecare
ciclu de o reacție PCR dublează teoretic cantitatea de exemplare vizate, deci ne așteptăm la o amplificare geometrică. Cu alte
cuvinte PCR este un proces exponențială.
Se poate folosi această formulă pentru a calcula ieșirea teoretic de orice intrare:
Y = X (1 + eficiență) n
Y = cantitate de țintă amplificare
X = intrare numărul de copii
n = numărul de cicluri
Factorul de eficiență este dată pentru fiecare ciclu în kit
2. Leveling pe scena.

5. Reacția încetinește ca polimeraza ADN-și pierde activitatea și ca un consum de reactivi, cum ar fi dNTP și primeri îi face să
devină limitare.
3. etapă Plateau.
Termenul "efect platou" este folosit pentru a descrie atenuarea ratei exponențială a acumulării produs care are loc în timpul
ciclurilor PCR târzii. Efectul platou este afectată de:
 Utilizarea substraturi (dNTP sau primeri).
 Stabilitatea Reactive (dNTP sau enzimă).
 Inhibarea End-produs (pirofosfat, ADN duplex).
 Concurență pentru reactanți de produse nespecifice sau grund-dimer.
 Recoacerea produs specific în concentrații mai mari 1E8 M (poate reduce rata de extindere sau processivity al ADN
polimerazei Taq sau cauza ramură migrarea produse fire și deplasarea de primeri.
 Incompletă separare denaturare / fir de produs în concentrație ridicată.