https://uploading.vn/h2pmgx6elhvr

1. BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ THỊ HOA
Mã sinh viên: 1101191
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID
COROSOLIC TRONG CAO
BẰNG LĂNG NƯỚC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2016

2. BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ THỊ HOA
Mã sinh viên: 1101191
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID
COROSOLIC TRONG CAO
BẰNG LĂNG NƯỚC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Nguyễn Kiều Anh
DS. Nguyễn Mai Hương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Phân Tích và Độc Chất
Trường Đại Học Dược Hà Nội
HÀ NỘI - 2016

3. LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và cảm ơn sâu sắc tới hai người
thầy của tôi là PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh và DS. Nguyễn Mai Hương -
những người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong
quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến công ty Traphaco đã cung cấp mẫu và hóa chất
trong quá trình tôi tiến hành khóa luận.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên của
Bộ môn Hóa Phân tích và Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội đã hỗ trợ, giúp
đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn khích lệ,
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 07 tháng 05 năm 2016
Sinh viên
Lê Thị Hoa

4. MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.......................................................................................3
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY BẰNG LĂNG NƯỚC VÀ ACID
COROSOLIC..........................................................................................................3
1.1.1. Cây Bằng lăng nước .................................................................................3
1.1.1.1. Đặc điểm của cây Bằng lăng nước....................................................3
1.1.1.2. Phân bố..............................................................................................4
1.1.1.3. Bộ phận dùng ....................................................................................4
1.1.1.4. Thành phần hóa học ..........................................................................4
1.1.1.5. Công dụng .........................................................................................5
1.1.1.6. Các nghiên cứu về tác dụng của Bằng lăng nước .............................6
1.1.2. Acid corosolic...........................................................................................6
1.1.2.1. Công thức cấu tạo và đặc tính hóa lý................................................7
1.1.2.2. Tác dụng của acid corosolic..............................................................7
1.1.2.3. Một số phương pháp định lượng acid corosolic................................8
1.2. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO...............................10
1.2.1. Nguyên lý chung của sắc ký lỏng hiệu năng cao ...................................10
1.2.2. Một số thông số đặc trưng......................................................................12
1.2.3. Ứng dụng................................................................................................13

5. 1.2.3.1. Định tính..........................................................................................13
1.2.3.2. Định lượng ......................................................................................13
1.3. VÀI NÉT VỀ CAO THUỐC..........................................................................14
1.3.1. Định nghĩa ..............................................................................................14
1.3.2. Phương pháp điều chế ............................................................................14
1.3.3. Yêu cầu chất lượng.................................................................................16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................17
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ........................................17
2.1.1. Nguyên vật liệu.......................................................................................17
2.1.2. Thiết bị phân tích....................................................................................17
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................18
2.2.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu ....................................................................18
2.2.2. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp ..............................................18
2.2.3. Thẩm định phương pháp nghiên cứu......................................................18
2.2.4. Áp dụng phương pháp xây dựng định lượng acid corosolic trong một số
mẫu thực ...........................................................................................................20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ....................................21
3.1. KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH.............................21
3.1.1. Chuẩn bị mẫu phân tích..........................................................................21
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký .......................................................................21
3.1.2.1. Khảo sát lựa chọn tỷ lệ pha động....................................................22
3.1.2.2. Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng........................................................23
3.1.2.3. Khảo sát lựa chọn nhiệt độ cột........................................................23
3.1.2.4. Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu......................................25
3.1.2.5. Điều kiện phân tích .........................................................................26

6. 3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID COROSOLIC ........27
3.2.1. Sự phù hợp hệ thống...............................................................................27
3.2.2. Độ đặc hiệu.............................................................................................27
3.2.3. Độ tuyến tính ..........................................................................................29
3.2.4. Độ lặp lại ................................................................................................31
3.2.5. Độ đúng ..................................................................................................32
3.3. ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRÊN MỘT SỐ MẪU CAO
BẰNG LĂNG NƯỚC...........................................................................................34
3.4. BÀN LUẬN ...................................................................................................35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT......................................................................................42
1. KẾT LUẬN
2. ĐỀ XUẤT
TÀI LIỆU THAM KHẢO

7. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BLN
HPLC
ĐTĐ
T.bình
RSD
SD
MeOH
ACN
LC- MS
EtOAc
CA
RP
NP
ELSD
RI
MC
PDA
Bằng lăng nước
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Đái tháo đường
Trung bình
Độ lệch chuẩn tương đối
Độ lệch chuẩn
Methanol
Acetonitril
Sắc ký lỏng ghép khối phổ
Ethylacetat
Acid corosolic
Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha thuận
Detector tán xạ bay hơi
Detector khúc xạ
Sắc ký khối phổ
Detector UV Diode Array

8. DANH MỤC BẢNG
Bảng Nội dung Trang
1 Mẫu cao Bằng lăng nước 18
2 Thiết bị phân tích 18
3.1 Kết quả sự phù hợp của hệ thống 30
3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 33
3.3 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu M01 35
3.4 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với mẫu M01 36
3.5 Hàm lượng acid corosolic trong các mẫu cao Bằng lăng nước 38

9. DANH MỤC HÌNH VẼ
Bảng Nội dung Trang
1.1 Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers.) 3
1.2 Cấu trúc hóa học của acid corosolic 7
1.3 Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 12
3.1 Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 25
3.2 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 26
3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn khảo sát nhiệt độ cột 27
3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết của mẫu M01 28
3.5 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp 31
3.6 Sắc ký đồ của dung dịch acid corosolic chuẩn nồng độ từ 50-100
μg/ml
33
3.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic của
acid corosolic
34

10. 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đường (ĐTĐ) là tình trạng tăng đường huyết mạn tính với sự tăng
glucose huyết do thiếu hụt tương đối hoặc tuyệt đối insulin [2]. Dân số mắc đái tháo
đường gia tăng với tốc độ ngày càng cao. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO), số người bị bệnh ĐTĐ tăng từ 108 triệu người (1980) đến 422 triệu người
(2014), tỷ lệ người lớn trên 18 tuổi mắc ĐTĐ tăng từ 4,7% (1980) lên 8,5% (2014)
[29]. Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Bệnh viện Nội tiết Trung ương, năm 2002
cả nước chỉ có khoảng 2,7% dân số mắc bệnh ĐTĐ nhưng đến năm 2012 tỷ lệ này
tăng lên gần 5,7% (điều tra tại 6 vùng trên cả nước). Cùng tốc độ phát triển nhanh
chóng, với tính chất của một bệnh mạn tính kéo dài gây nhiều biến chứng, ĐTĐ đã
và đang gây ra gánh nặng về sức khỏe và kinh tế cho cá nhân người bệnh cũng như
cho toàn xã hội. Vì vậy, việc nghiên cứu thuốc điều trị ĐTĐ là một trọng tâm được
chú ý của các nhà khoa học.
Ở một số nước châu Á (Ấn Độ, Philippin, Nhật Bản,…), lá Bằng lăng nước
được dùng làm trà chủ yếu để phòng và điều trị ĐTĐ [21]. Lá có chứa acid
corosolic – một hợp chất thuộc nhóm saponin triterpenoid với hàm lượng cao, có
tác dụng hạ đường huyết thông qua cơ chế gián tiếp tăng vận chuyển glucose vào
trong tế bào [10], [16], [25], [26]. Hàm lượng hoạt chất cao và đã được tiến hành
thử nghiệm lâm sàng tác dụng hạ đường huyết trên người.
Ở Việt Nam, Bằng lăng nước phân bố rộng rãi khắp cả nước, đặc biệt là các
tỉnh miền Bắc, cây phát triển rất tươi tốt – đây là nguồn nguyên liệu sẵn có, thuận
lợi cho việc nghiên cứu, phát triển sản phẩm thuốc từ dược liệu này. Trong sản xuất,
dược liệu Bằng lăng nước được bào chế thành cao thuốc. Lá được làm sạch, nghiền
nhỏ, chiết bằng cồn, sấy ở nhiệt độ thích hợp tạo thành cao khô. Cao khô được
nghiền nhỏ tạo thành bột cao khô. Dược liệu làm thuốc cần phải được tiêu chuẩn
hóa chất lượng, Dược điển Việt Nam IV lại chưa có chuyên luận nào về BLN [3],
nghiên cứu của tác giả Trần Thị Hằng [7] đã bước đầu xác định được acid corosolic
trong lá Bằng lăng nước nhưng vẫn còn nhiều hạn chế. Để góp phần tiêu chuẩn hóa

11. 2
cao dược liệu phục vụ sản xuất chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu
định lượng acid corosolic trong cao Bằng lăng nước” với 2 mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid corosolic trong cao
Bằng lăng nước.
2. Ứng dụng phương pháp mới xây dựng, định lượng acid corosolic trong một
số mẫu cao Bằng lăng nước.

12. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY BẰNG LĂNG NƯỚC VÀ ACID
COROSOLIC
1.1.1. Cây Bằng lăng nước
1.1.1.1. Đặc điểm của cây Bằng lăng nước
Bằng lăng nước (BLN) tên khoa học là Lagerstroemia speciosa (L.) Pers., là một
trong số 50 loài thuộc chi Tử vi (Lagerstroemia), họ Lythroideae.
Bằng lăng nước là cây lá rụng, thân gỗ, kích thước trung bình, cao khoảng 5-20
m, mọc nhiều ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Vỏ cây màu nâu hoặc màu kem. Lá
BLN là kiểu lá đơn, hình bầu dục, tròn ở gốc, nhọn ngắn ở chóp, mép lá nguyên,
chiều dài 10-20 cm, chiều rộng 5-9 cm. Lá BLN rất dai, bề mặt lá nhẵn, cả 2 mặt
đều có màu xanh nhạt, có 12-14 gân bên, khi già ngả sang màu vàng hoặc đỏ. Cụm
hoa dạng chùy, mọc ở ngọn, nụ hoa màu đỏ, nhánh chùy có lông sát. Hoa to, rộng 3
cm, màu đỏ tím, đôi khi màu hồng, 6 cánh hoa có cuống 5 mm, không mùi, nhị hoa
nhiều. Quả nang hình tròn hoặc oval, kích thước 20 x 18 mm mang lá đài xòa ra,
khi khô nở thành 6 mảnh. Hạt có cánh mảnh, đường kính 12-15 mm màu nâu nhạt.
Cây ra hoa vào khoảng tháng 4-5 [5], [6].
Hình 1.1. Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers.)

13. 4
1.1.1.2. Phân bố
BLN thường mọc ở vùng nhiệt đới, chủ yếu ở Nam Á và Đông Nam Á như Ấn
Độ, Indonesia, Philipin, Malaysia… ngoài ra cây còn phân bố ở một số nước Nam
Mỹ [8].
Ở Việt Nam, BLN được trồng nhiều ở Tây Nguyên, Bình Phước, Tây Ninh, Đồng
Nai và một số thành phố lớn khác như Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nẵng… Cây mọc
hoang hoặc được trồng làm cảnh [5].
1.1.1.3. Bộ phận dùng
Bộ phận dùng chủ yếu là lá, vỏ, quả [5], [13].
1.1.1.4. Thành phần hóa học
Các loài thực vật thuộc chi Lagerstroemia phân bố rộng và có nhiều loài được
dùng trong Y học. Đến nay hơn 40 hợp chất bao gồm triterpen, tannin, acid ellagic,
glycosid và flavon đã xác định từ lá của L. speciosa [15]. Trong đó có 4 triterpen
(acid ursolic, acid corosolic, acid asiatic và acid alphitolic), 8 acid ellagic, 1
coumarin và 1 neolignan [18].
+ Triterpenoid:
Năm 2009, Hou W. và cộng sự đã phân lập 6 triterpenoid từ dịch chiết
ethylacetat (EtOAc) của lá BLN: acid oleanolic, acid arjunolic, acid asiatic, acid
maslinic, acid corosolic và acid 2, 3-hydroxy ursolic [17].
Ở Việt Nam, Phùng Thanh Hương và cộng sự đã phân lập được 2 acid là acid
corosolic và acid urosolic từ phân đoạn n- hexan của dịch chiết methanol (MeOH)
lá BLN [11]. Công thức phân tử của một vài triterpen như sau:

14. 5
Triterpen
R1 = H, R2 = H (acid ursolic)
R1 = OH, R2 = H (acid corosolic)
R1 = OH, R2 = OH (acid asiatic)
Trong đó, acid corosolic (acid 2 α-hydroxyursolic) phân lập được từ dịch chiết
methanol của lá BLN, có tác dụng hạ glucose huyết trên người thông qua gián tiếp
vận chuyển glucose vào trong tế bào [26].
+ Tanin:
Trong nhóm này đáng chú ý nhất là nhóm ellagitanin (đã phân lập và xác định
được cấu trúc của 6 ellagitanin monome và dime mới (flosin A và B, reginin (A, B,
C, D), 3 ellagitanin mới (lagerstanin A, B, C) từ dịch chiết aceton của L.speciosa)
và nhóm gallotanin (gồm acid tanic và penta-o-galloyl-D-glucopyranose (PGG) [9],
[16]. Trong các ellagitanin của lá BLN Lagerstroemin có tác dụng kích thích vận
chuyển glucose vào tế bào, tăng cường biểu thị gen mã hóa receptor của insulin,
tăng cường phosphoryl hóa tyrosin ở hậu thể của insulin. Acid tanic của lá BLN có
tác dụng tăng cường nhạy cảm của tế bào mỡ với insulin, từ đó dẫn đến một loạt
đáp ứng sinh lý tương tự như insulin [5].
1.1.1.5. Công dụng
BLN có nhiều công dụng được ứng dụng rộng rãi trong y dược như [8]:
- Vỏ cây có tác dụng hạ sốt. Nước sắc vỏ cây dùng chữa đau bụng, tiêu chảy
- Rễ có tác dụng săn se, giảm sốt
- Hạt có chất gây ngủ
- Lá có tác dụng làm giảm đường huyết.

15. 6
1.1.1.6. Các nghiên cứu về tác dụng của Bằng lăng nước
BLN được sử dụng rộng rãi trong bài thuốc dân gian để điều trị bệnh tiểu
đường ở nhiều quốc gia, chủ yếu là khu vực Đông Nam Á [26]. Nhân dân Philipin,
Ấn Độ sử dụng lá BLN làm trà uống để trị tiểu đường. Ở Việt Nam, theo Phạm
Hoàng Hộ (2000), trong y học người ta sử dụng lá BLN để trị bệnh tiểu đường, béo
phì, rễ và vỏ trị sốt, đau và loét dạ dày, quả đắp trị lở miệng.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học trên lá BLN, chủ yếu tập trung vào nhóm hợp chất có tác dụng làm hạ
đường huyết và nhóm hợp chất phân cực.
Nghiên cứu của Kakuda 1996 trên chuột nhắt đái tháo đường typ 2 di truyền
KK-Ay, dịch chiết nước lá BLN sau 5 tuần điều trị trên chuột đã giảm đáng kể
glucose huyết, glucose niệu, nồng độ cholesterol toàn phần và insulin huyết thanh
[20]. Dịch chiết ethanol của lá BLN (Lagerstroemia speciosa L. Pers.) với liều 10
g/kg đã làm giảm nồng độ glucose, triglycerid, cholessterol toàn phần trong máu,
nhưng không làm thay đổi rõ rệt về cân nặng, nồng độ insulin huyết thanh và tình
trạng mô tụy nội tiết của chuột cống ĐTĐ typ 2 gây ra bởi chế độ ăn giàu chất béo
kết hợp với streptozocin liều thấp [10]. Tác dụng của dịch chiết lá BLN trên chuột
ĐTĐ có thể giải thích bằng nhiều cơ chế khác nhau. Trước hết, có thể khẳng định
dịch chiết lá BLN không có khả năng kích thích tụy sản xuất insulin, tác dụng của
BLN gián tiếp thông qua sự cải thiện tình trạng kháng insulin, nhờ đó làm giảm
gánh nặng cho tụy, giúp tụy phục hồi [10].
Dịch chiết nước lá Bằng lăng nước có tác dụng chống oxi hóa và gốc tự do
trong môi trường thử nghiệm in vitro chứa các gốc tự do và oxi hóa. Dịch chiết từ lá
BLN được chứng minh có tác dụng khử gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl) [27].
1.1.2. Acid corosolic

16. 7
1.1.2.1. Công thức cấu tạo và đặc tính hóa lý
C30H48O4 PTL: 472,7 g/mol
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của acid corosolic
Tên khoa học:
Acid (1S, 2R, 4aS, 6aR, 6aS, 6bR, 8aR, 10R, 11R, 12aR, 14bS)-10,11-
Dihydroxy –1, 2, 6a, 6b, 9, 9, 12a-heptamethyl-2, 3, 4, 5, 6, 6a, 7, 8, 8a, 10, 11, 12,
13, 14b-tetradecahydro-1H-picene-4a-carboxylic.
Tên gọi khác:
Glucosol; acid corsolic; acid colosic; acid 2α-Hydroxyursolic.
Tính chất vật lý:
- Là bột có màu vàng nâu
- Acid corosolic là một pentacyclic triterpen thuộc nhóm saponin [15], [26]. Do các
saponin ít có các nối đôi, nhất là nối đôi liên hợp nên thường chỉ có hấp thụ tử ngoại
ở vùng sóng ngắn 195-210 nm.
1.1.2.2. Tác dụng của acid corosolic
Hầu hết tác dụng của acid corosolic trong BLN chủ yếu tập trung vào tác dụng
hạ đường huyết và tác dụng chống ung thư.
Tác dụng hạ đường huyết
Các nghiên cứu về tác dụng hạ glucose huyết của BLN tập trung chủ yếu với
hoạt chất chính là corosolic acid và polyphenol. Nghiên cứu tác dụng hạ đường
huyết trên chuột ĐTĐ typ 2 chủng KK-Ay, sau khi uống corosolic với liều đơn 10

17. 8
mg/kg, có sự chênh lệch đáng kể mật độ GLUT4 giữa màng microsom và màng bào
tương so với lô chứng. Điều đó chứng tỏ acid corosolic có tác dụng kích thích sự
chuyển dịch của GLUT4 - yếu tố vận chuyển glucose ở tế bào cơ của chuột ĐTĐ
typ 2 [22].
Năm 2008, Yamada đã phát hiện ra acid corosolic trong lá BLN kích thích sự
biểu hiện của receptor PPARα ở tế bào gan và PPARγ ở tế bào mỡ. Các chất đồng
vận trên receptor PPARα có tác dụng kích thích quá trình β oxy hóa acid béo ở gan,
giảm triglycerid dự trữ, ngăn ngừa biến chứng trên tim mạch. Các chất đồng vận
trên receptor PPARγ, tăng biệt hóa tế bào mỡ, làm giảm acid béo tự do, tăng cường
hấp thu glucose vào trong tế bào. Vì vậy acid corosolic có tác dụng hoạt hóa đồng
thời trên cả 2 receptor nên giải quyết được tình trạng tăng glucose huyết và béo phì
ở người ĐTĐ typ 2 [30].
Như vậy, acid corosolic trong BLN có tác dụng hạ đường huyết thông qua cơ
chế giảm tình trạng kháng insulin - một trong những nguyên nhân chính gây ra tăng
glucose huyết và biến chứng trong ĐTĐ typ 2.
Tác dụng chống ung thư
Năm 2014, Bokyung Sung và đồng nghiệp [14] đã nghiên cứu về tác dụng của
acid corosolic (CA) trên tế bào ung thư đại trực tràng HCT116. Nhận thấy CA có
khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư đại trực tràng HCT116 thông qua
sự thay đổi về hình thái tế bào, gây ngưng tụ nhiễm sắc thể, giáng hóa tế bào
(apoptosis) HCT116 ở giai đoạn S-G1 và hoạt hóa caspase - một emzym thủy phân
protein đóng vai trò trong làm chết tế bào theo chu trình.
1.1.2.3. Một số phương pháp định lượng acid corosolic
Neeshad P. Joshi và cộng sự [23] sử dụng sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS) để
định lượng acid corosolic trong huyết tương người. Điều kiện phân tích là cột
Kromasil C18, rửa giải isocratic. Kết quả thu được: khoảng tuyến tính của acid
corosolic: 5-1000 ng/mL, độ chính xác 85-115%. Tổng thời gian rửa giải khoảng 5
phút.

18. 9
Nghiên cứu của tác giả Trần Thị Hằng [7] sử dụng HPLC nghiên cứu định
lượng acid corosolic trong lá một số mẫu thuộc chi Lagerstroemia ở Việt Nam với
điều kiện sắc ký: cột RP 18 (240 x 4 mm, 5μm), pha động là acetonitril : acid
formic 0,1% (80:20, tt/tt), detector UV bước sóng 205 nm. Kết quả thu được: thời
gian xuất hiện chất phân tích từ 19,1-19,3 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan là
0,9959.
W. Zong và cộng sự [28] sử dụng HPLC để định lượng acid corosolic trong
dịch chiết MeOH của lá L.speciosa với cột Phenomenex Luna C18 (250 x 4,6 mm,
5μm), pha động là acetonitril : dung dịch acid phosphoric 0,1% trong nước (60:40,
tt/tt), rửa giải isocratic, detector UV bước sóng 204 nm. Kết quả phân tích: thời gian
xuất hiện pic chất phân tích: 19,05 phút, độ tuyến tính hệ số tương quan là 0,9998.
Katta Vijaykuma và cộng sự [21] sử dụng phương pháp HPLC và HPTLC để
định lượng acid corosolic trong lá, cao và chế phẩm của L.speciosa. Với phương
pháp HPLC tác giả sử dụng điều kiện phân tích là cột: Phenomenex Luna C18 (250
x 4,6 mm, 5 µm), pha động là acetonitril : dung dịch H3PO4 0,1% trong nước
(75:25, tt/tt), rửa giải isocratic, detector PDA bước sóng: 210 nm. Kết quả phân tích
thu được: thời gian xuất hiện pic chất phân tích khoảng 9,4 phút, độ tuyến tính có hệ
số tương quan 0,9981, độ lặp lại RSD: 0,02-0,08% (< 2%), độ đúng nằm trong
khoảng 95,98-100,16%. Với phương pháp HPTLC: pha động là clorroform :
methanol tỷ lệ 9:1, hệ số di chuyển Rf là 0,4. Kết quả thu được: độ tuyến tính có hệ
số tương quan là 0,9735, độ lặp lại có RSD bằng 1,16-1,78% (< 2%), độ đúng nằm
trong khoảng 98,91-100,93%.
Neeshad P. Joshi và cộng sự [24] sử dụng phương pháp HPLC định lượng acid
corosolic trong lá và chế phẩm của L.speciosa. Dịch chiết methanol từ lá cây BLN
được sử dụng để phân tích HPLC với cột HyPurity C18 (100 x 2,1 mm, 5 μm), pha
động acetonitril : nước, rửa giải gradient, sử dụng detector PDA với bước sóng là
210 nm. Kết quả phân tích: thời gian xuất hiện pic phân tích: 7,366 phút, độ tuyến
tính có hệ số tương quan là 0,9998, độ đúng RSD trong phạm vi 85-115%, độ lặp lại
(≤ 2%).

19. 10
1.2. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.2.1. Nguyên lý chung của sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC còn gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao, là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ
sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển
của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố,
trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1]. Trong sắc ký
lỏng hiệu năng cao, mẫu phân tích được tiêm vào buồng tiêm và đi vào cột nhờ pha
động, các thành phần trong mẫu được tách ra trên pha tĩnh chứa trong cột và đi qua
detector để phát hiện, cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ.
a) Pha tĩnh trong sắc ký lỏng
Pha tĩnh hay dùng nhất trong HPLC được chế tạo từ silica. Nhóm – OH trên
bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo dẫn chất siloxan.
Khi R là nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl,… ta có
sắc ký pha đảo (RP-HPLC). Chất phân cực được rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân
cực của pha động thì thời gian lưu tăng dần. Cột hay sử dụng trong sắc ký pha đảo
là cột ODS (RP C18) (octadecylsilan), C8 với kích cỡ hạt 5 hay 10 µm.
Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril, pha động là dung
môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC). Chất ít phân cực được rửa giải
đầu tiên, tăng độ phân cực của pha động thời gian lưu giảm dần.
b) Pha động trong sắc ký lỏng
Pha động trong sắc ký lỏng đóng vai trò quan trọng trong việc tách các chất
phân tích. Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt ưu cầu sau:
- Hòa tan mẫu phân tích
- Phù hợp với đầu dò

20. 11
- Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh
- Có độ nhớt thấp để tránh áo suất dội lại cao
- Tinh khiết.
Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Hay sử dụng là
acetonitril, methanol, nước… Pha động một thành phần thường không đáp ứng thời
gian rửa giải, người ta thường kết hợp 2 hoặc 3 thành phần dung môi để có độ phân
cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động
và nồng độ theo thời gian gọi là rửa giải gradient, cố định thành phần pha động và
nồng độ theo thời gian gọi là rửa giải isocratic.
c) Detector trong sắc ký
Có nhiều loại detector khác nhau, tùy thuộc vào bản chất lý hóa của chất phân
tích mà lựa chọn detector thích hợp.
- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV- VIS: áp dụng cho các chất có khả năng
hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến
- Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh
quang. Đối với các chất không phát quang cần phải dẫn xuất hóa chất phân tích để
tạo sản phẩm có khả năng hấp thụ huỳnh quang
- Detector khúc xạ: thường dùng định lượng hợp chất đường
- Detector độ dẫn: phù hợp các chất có hoạt tính điện hóa
Ngoài ra còn có detector tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), khối
phổ (MC)…trong đó detector chuỗi diode (PDA) cho phép thay đổi bước sóng theo
chương trình đã đặt trong một quá trình sắc ký [12].
a) Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

21. 12
Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
Trong đó :
1- Bình chứa dung môi pha động
2- Bộ phận khử khí
3- Bơm cao áp
4- Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay Autosample)
5- Cột sắc ký (pha tĩnh)
6- Detector (nhận tín hiệu)
7- Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu, sử lý dữ liệu và điều khiển hệ
thống HPLC
8- Bộ phận in dữ liệu
1.2.2. Một số thông số đặc trưng
Thời gian lưu (kí hiệu tR) của chất phân tích là thời gian từ lúc tiêm mẫu đến
khi xuất hiện pic chất phân tích ở nồng độ max (Cmax) trên sắc ký đồ. Thời gian lưu
trên sắc ký đồ là thông tin định tính chất phân tích trong mẫu. Trong điều kiện sắc
ký nhất định (cột, nhiệt độ, tốc độ dòng ,…) thời gian lưu của chất phân tích là một
hằng số.
Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết (N) trên cột.
N được tính theo công thức:

22. 13
N = 16 (
𝑡𝑅
𝑊
)2
= 5,54 (
𝑡𝑅
𝑊1/2
)2
Trong đó:
tR là thời gian lưu chất phân tích (min)
W là độ rộng pic (min)
W1/2: độ rộng pic ở ½ chiều cao pic (min)
Độ phân giải: là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký
Rs =
2 (𝑡𝑅1−𝑡𝑅2)
𝑤1+𝑤2
Trong đó:
TR là thời gian lưu (min)
W: độ rộng đáy pic (min)
Rs = 0,75: hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều
Rs = 1,0: hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%
Rs = 1,5: hai pic tách gần như hoàn toàn, chỉ xen phủ nhau 0,3%
1.2.3. Ứng dụng
1.2.3.1. Định tính
Sự tương tự nhau về thời gian lưu (tR ) của chất phân tích trên sắc ký đồ của
dung dịch chuẩn và dung dịch thử trong cùng một điều kiện sắc ký là cơ sở của
phép định tính. Với detector PDA, tR kết hợp với chồng phổ của chất chuẩn và chất
thử cho hệ số Match là cơ sở định tính chất phân tích.
1.2.3.2. Định lượng
Nguyên tắc: về mặt kỹ thuật, việc định lượng chất phân tích bằng HPLC có
thể dựa vào sự so sánh chiều cao của pic hay so sánh diện tích pic của chất phân
tích với một hay nhiều mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ.
Phương pháp định lượng
Phương pháp chuẩn ngoại
Phương pháp chuẩn nội
Phương pháp chuẩn hóa diện tích [4]

23. 14
Trong phạm của nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn ngoại
để xác định nồng độ của chất phân tích. Nội dung của phương pháp được trình bày
cụ thể như sau:
Mẫu thử và mẫu chuẩn được tiến hành sắc ký trong cùng một điều kiện. So
sánh diện tích pic của mẫu thử với mẫu chuẩn. Kết quả có thể tính theo phương
pháp chuẩn ngoại một điểm hay đường chuẩn.
- Phương pháp chuẩn ngoại một điểm
Xác định diện tích pic của mẫu thử và một mẫu chuẩn ở nồng độ xác định,
nồng độ của chất thử được tính theo công thức:
𝐶𝑥 = 𝑆𝑥 ×
𝐶𝑜
𝑆𝑜
- Phương pháp đường chuẩn
Pha các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ khác nhau tương ứng với chất
cần xác định rồi tiến hành sắc ký để thu được các pic chất chuẩn ở các nồng độ trên.
Xây dựng đường chuẩn hồi quy tuyến tính biểu hiện mối quan hệ giữa nồng độ và
diện tích pic: y = a.C + b. Tiến hành sắc ký một mẫu thử và xác định Sx. Dựa vào
đường chuẩn để xác định Cx.
1.3. VÀI NÉT VỀ CAO THUỐC
1.3.1. Định nghĩa
Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định
các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích
hợp [3].
Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia nhỏ đến
kích thước thích hợp). Cao thuốc được chia làm 3 loại: cao lỏng, cao đặc và cao
khô. Cao khô là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm.
1.3.2. Phương pháp điều chế
Quá trình điều chế cao thường có 2 giai đoạn:
Giai đoạn I

24. 15
Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi thích hợp. Tùy theo bản chất của dược
liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm cũng như điều kiện, quy mô
sản xuất và trang thiết bị, có thể sử dụng các phương pháp chiết xuất: ngâm, hầm,
hãm, sắc, ngâm kiệt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng thiết bị siêu âm, chiết
xuất bằng phương pháp sử dụng điện trường và các phương pháp khác. Khi đó,
dược liệu thô đã được chia nhỏ đến kích thước phù hợp, được làm ẩm với một
lượng dung môi vừa đủ rồi đậy kín để yên trong khoảng 2-4 giờ. Sau đó, chuyển
khối dược liệu vào bình ngấm kiệt, thêm lượng dung môi vừa đủ đến khi ngập hoàn
toàn khối dược liệu. Thời gian ngâm lạnh và tốc độ chảy trong quá trình chiết có thể
thay đổi theo khối lượng và bản chất của dược liệu thô đem chiết.
Giai đoạn II
Cao lỏng: sau khi thu được dịch chiết, tiến hành lọc và cô dịch chiết bằng các
phương pháp khác nhau để thu được cao lỏng có tỷ lệ theo như quy ước (1 ml cao
lỏng tương ứng với 1 g dược liệu). Để riêng phần dịch chiết đầu đậm đặc bằng 4/5
lượng dược liệu đem chiết. Sau đó cô các phần dịch chiết tiếp theo trên bếp cách
thuỷ hoặc cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60ºC cho đến khi loại hết
dung môi. Hoà tan cắn thu được vào trong dịch chiết đầu đậm đặc và nếu cần, thêm
dung môi vào để thu được cao lỏng đạt tỷ lệ quy định. Cao lỏng có khuynh hướng
bị lắng cặn vì vậy để cao lỏng ở chỗ mát trong thời gian ít nhất 3 ngày, rồi lọc.
Cao đặc và cao khô: dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại không quá
20%. Trong trường hợp điều chế cao khô, tiếp tục sấy khô để độ ẩm còn lại không
quá 5%. Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thường
được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60°C.
Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cô cách
thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ không quá 80°C. Trường
hợp muốn thu cao thuốc có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành loại tạp chất bằng các
phương pháp thích hợp tuỳ thuộc vào bản chất cuả dược liệu, dung môi và phương
pháp chiết xuất. Có thể cho thêm chất bảo quản hoặc các chất trơ để làm chất mang

25. 16
hay để cải thiện các tính chất vật lý. Đối với cao khô có thể sử dụng các bột trơ
thích hợp để điều chỉnh nồng độ hoạt chất đến tỷ lệ quy định.
1.3.3. Yêu cầu chất lượng
Cao thuốc phải đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và đạt
các yêu cầu chung sau đây:
- Độ tan: cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi được sử dụng để điều chế cao.
- Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả
trong chuyên luân riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng. Ngoài ra,
cao lỏng còn phải đồng nhất, không có váng thuốc, không có cặn bã dược liệu và
vật lạ.
- Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác) thì:
Cao đặc không quá 20%; Cao khô không quá 5%.
- Hàm lượng cồn: đạt 90-110% lượng ethanol ghi trên nhãn (áp dụng cho cao lỏng
và cao đặc).
- Kim loại nặng: đáp ứng yêu cầu qui định trong chuyên luận riêng.
- Dung môi tồn dư: nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn
hợp cồn - nước thì phải xác định dư lượng dung môi sử dụng và đáp ứng yêu cầu
qui định trong Dược điển.
- Giới hạn nhiễm khuẩn: đáp ứng yêu cầu qui định về tổng số vi khuẩn hiếu khí, vi
khuẩn gây bệnh và nấm men, nấm mốc.
- Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: đáp ứng yêu cầu quy định.

26. 17
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ
2.1.1. Nguyên vật liệu
- Chất chuẩn: acid corosolic chuẩn, hàm lượng 98% tính theo nguyên trạng do công
ty Traphaco cung cấp.
- Đối tượng nghiên cứu: các mẫu cao BLN do công ty Traphaco cung cấp được
trình bày ở Bảng 2.
Bảng 1. Mẫu cao Bằng lăng nước
STT Tên mẫu Ngày sản xuất
1 BLN M01 26/02/16
2 BLN M02 26/02/16
3 BLN 01-16 (1) T3/2016
4 BLN 01-16 (2) 4/3/2016
- Dung môi, hóa chất: Theo DĐVN IV (TT) dùng cho HPLC
Acetonitril (TT); Methanol (TT); Acid phosphoric đặc (TT); Nước cất 2 lần
2.1.2. Thiết bị phân tích
Bảng 2. Thiết bị phân tích
Thiết bị phân tích Hãng sản xuất
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100 series Mỹ
Máy siêu âm Sonorex Đức
Cân phân tích Sartorius Đức
Cân phân tích Precisa ES 225 SM-DR Thụy Sĩ
Máy ly tâm Harmonic Series Đức
Máy hút chân không Rocker 400 Mỹ
Bình định mức 5, 10, 20, 25 ml Đức

27. 18
Pipet thủy tinh chính xác 1, 2, 3 ml Đức
Vial, cốc có mỏ, ống thủy tinh, màng lọc 0,45 μm, pipet
thường,...
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên tắc: Mẫu được chiết và định mức đến thể tích thích hợp, dịch chiết
được ly tâm và lọc qua màng lọc 0,45 μm, sau đó tiêm vào hệ thống HPLC, ghi lại
sắc ký đồ. Số liệu thu được từ kết quả thực nghiệm ứng dụng phương pháp HPLC.
2.2.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu
Quy trình xử lý mẫu
Cân chính xác lượng mẫu thích hợp vào bình định mức, thêm dung môi chiết
(MeOH), đem siêu âm. Chiết mẫu trong khoảng thời gian thích hợp, ly tâm thu
được dịch chiết, lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm, tiêm mẫu vào hệ thống HPLC.
Khảo sát thời gian chiết: khảo sát thời gian chiết là 15, 30, 45, 60, 70 phút.
2.2.2. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp
Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100 series detector
PDA để khảo sát điều kiện sắc ký mẫu chuẩn acid corosolic.
- Khảo sát lựa chọn pha động
- Khảo sát tốc độ dòng
- Khảo sát nhiệt độ cột
Yêu cầu: pic chất phân tích tách khỏi nền mẫu, sắc gọn, cân đối, thời gian
phân tích phù hợp, áp suất không cao.
2.2.3. Thẩm định phương pháp nghiên cứu
Xử lý mẫu thử theo quy trình đã lựa chọn, dung dịch thu được tiến hành sắc ký
như điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ tiêu: sự phù hợp
của hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng.

28. 19
- Độ đặc hiệu: tiến hành chạy sắc ký lần lượt với mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu
thử, ghi lại sắc ký đồ. Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời
gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn, thời gian lưu của chất phân
tích trong mẫu thử phải tương đương với thời gian lưu của chất phân tích trong sắc
ký đồ mẫu chuẩn.
- Sự phù hợp của hệ thống: đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời gian lưu
và diện tích pic khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị, ghi lại các giá trị
thời gian lưu, diện tích pic. Yêu cầu: độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp
ứng phân tích ≤ 2,0% theo AOAC.
- Độ tuyến tính: tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả mối tương
quan tuyến tính trong khoảng xác định (là khoảng nồng độ đảm bảo sự phụ thuộc
tuyến tính giữa đại lượng đo được Y và nồng độ chất phân tích X).
Xây dựng đường chuẩn 5 điểm từ X1 đến X5 của dung dịch chất chuẩn acid
corosolic trong khoảng nồng độ thích hợp. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa
chọn. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic. Yêu
cầu: hệ số tương quan r > 0,998 theo AOAC.
- Độ lặp lại của phương pháp: độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy
trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm, trong khoảng thời gian ngắn. Tiến
hành: chuẩn bị 6 mẫu thử theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng, chạy mẫu trên hệ
thống HPLC, ghi lại sắc ký đồ. Xác định độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của hàm
lượng hoạt chất trong mẫu thử. Yêu cầu: độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2,7% đối
với hàm lượng chất phân tích ≥ 1% và < 10% theo AOAC.
- Độ đúng: độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thu được với giá trị thực
của kết quả. Tiến hành: độ đúng được tiến hành bằng phương pháp thêm chuẩn,
thêm một lượng chính xác chất chuẩn thích hợp vào trong mẫu thử sao cho tổng
hàm lượng chất phân tích trong dung dịch nằm trong khoảng tuyến tính. Tiến hành
sắc ký theo điều kiện đã chọn. Dựa vào hàm lượng corosolic đã biết trong mẫu thử,
lượng chất chuẩn thêm vào và diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn và dung
dịch thử thêm chuẩn, tính được lượng acid corosolic thu hồi lại trong mẫu thử. Yêu

29. 20
cầu: độ thu hồi nằm trong khoảng 97 – 103% đối với hàm lượng hoạt chất ≥ 1% và
< 10% theo AOAC.
2.2.4. Áp dụng phương pháp xây dựng định lượng acid corosolic trong một số
mẫu thực
Xác định độ ẩm của mẫu thực theo Dược điển Việt Nam IV, làm đồng nhất
mẫu, cân và xử lý mẫu, tiến hành phân tích bằng HPLC, tính kết quả theo phương
pháp so sánh với chuẩn.
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý dựa vào một số hàm trong Microsoft Excel.
- Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE
- Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV
- Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)
RSD =
100 × 𝑆𝐷
𝑋
%
Tương quan hồi quy tuyến tính: Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiên quan
hệ giữa diện tích pic (Y) và nồng độ chất phân tích (C): Y = aC + b
Trong đó:
Hệ số góc: a
Hệ số chắn: b
Hệ số tương quan r

30. 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH
3.1.1. Chuẩn bị mẫu phân tích
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, chuẩn làm việc
+ Chuẩn gốc: cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn vào bình định mức 20 ml,
thêm khoảng 15 ml MeOH lắc cho tan hoàn toàn, thêm MeOH vừa đủ đến vạch,
lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm.
+ Chuẩn làm việc: pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH đến nồng độ tương
đương với nồng độ acid corosolic trong dung dịch thử. Lọc qua màng lọc 0,45 μm.
- Dung dịch thử
Cân chính xác khoảng 0,10 g cao dược liệu vào bình định mức 25 ml. Thêm
khoảng 15 ml MeOH lắc đều, đậy nút. Siêu âm, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc
đều. Lấy 6 ml dung dịch này vào ống ly tâm, ly tâm 3500 vòng/phút trong 5 phút.
Hút phần dịch phía trên, lọc qua màng lọc 0,45 μm.
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
Dựa vào tài liệu [21], [23], [24], [28] và điều kiện thực tế phòng thí nghiệm,
chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc ký như sau:
- Cột sắc ký: cột Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm)
- Detector PDA: bước sóng 210 nm
- Pha động: Acetonitril : dung dịch H3PO4 0,1% trong nước (*
)
- Thể tích tiêm: 10 μl
- Nhiệt độ phòng
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
(*
): Dung dịch H3PO4 0.1%: pha loãng khoảng 0,66 ml acid phosphoric đặc đến vừa
đủ 1000 ml bằng nước.
Để lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát bằng cách
thay đổi các điều kiện như: tỷ lệ pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ cột.

31. 22
3.1.2.1. Khảo sát lựa chọn tỷ lệ pha động
Pha động là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký, nó có thể
ảnh hưởng tới độ chọn lọc, thời gian lưu giữ, hiệu lực của cột tách, độ phân giải độ
rộng của pic,…
Tiến hành khảo sát tỷ lệ pha động acetonitril : dung dịch H3PO4 0,1% lần lượt:
75:25, 90:10 (tt/tt), cố định các điều kiện khác. Sắc ký đồ như Hình 3.5.
Hình 3.1. Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ thành phần pha động
a) Tỷ lệ 75:25 (tt/tt) b) Tỷ lệ 90:10 (tt/tt)

32. 23
Nhận xét:
Với tỷ lệ thành phần pha động acetonitril : dung dịch H3PO4 0,1% 75:25 (tt/tt)
thời gian phân tích quá dài (> 40 phút), acid corosolic chưa được rửa giải. Tăng tỷ
lệ này lên 90:10 (tt/tt) thời gian xuất hiện pic chất phân tích 28,284 phút, pic gọn,
cân đối, thời gian phân tích được cải thiện đáng kể. Chúng tôi lựa chọn tỷ lệ pha
động acetonitril : dung dịch H3PO4 0,1% 90:10 (tt/tt) để tiếp tục khảo sát các điều
kiện tiếp theo.
3.1.2.2. Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng
Tiếp tục tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn như trên nhưng thay đổi tốc độ
1,0 ml/phút, 1,5 ml/phút. Sắc ký đồ chất phân tích như Hình 3.2.
Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng
Nhận xét:
Với tốc độ dòng là 1,5 mL/phút cho pic sắc ký nhọn, cân đối, thời gian xuất
hiện pic chất phân tích (19,429 phút) giảm đi khoảng 2/3 so với tốc độ dòng là 1,0
ml/phút (28,284 phút), áp suất cột là 78 bar. Tăng tốc độ dòng lên có thể làm giảm
thời gian lưu nhưng làm tăng áp suất. Chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng là 1,5 ml/phút
cho kết quả cân bằng giữa áp suất và thời gian lưu của chất phân tích.
3.1.2.3. Khảo sát lựa chọn nhiệt độ cột.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cột đến thời gian lưu của hoạt chất.
Điều kiện tiến hành sắc ký:

33. 24
- Cột sắc ký: cột Eclipse XDB-C18 (4,6 x 250 mm, 5 μm)
- Detector PDA: bước sóng 210 nm.
- Pha động: Acetonitril: dung dịch H3PO4 0,1% (90:10, tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
Khảo sát nhiệt độ cột lần lượt ở nhiệt độ phòng (25°C ) và 30°C. Kết quả thu
được như Hình 3.3.
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu chuẩn khảo sát nhiệt độ cột
(a) Nhiệt độ phòng (b) Nhiệt độ 30°C
Nhận xét:
Sắc ký đồ ở nhiệt độ phòng và 30°C đều cho pic đẹp, gọn và cân đối. Thời
gian xuất hiện pic chất phân tích ở nhiệt độ 30°C (tR2 = 14,733 phút) giảm đi 5 phút
min
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
mAU
0
10
20
30
40
50
DAD1 A, Sig=210,4 Ref=360,100 (CO153004.D)
14.733
b)

34. 25
so với điều kiện nhiệt độ phòng (tR1 = 19,571 phút). Tăng nhiệt độ cột có thể làm
tăng vận tốc tách nhưng có thể ảnh hưởng đến chất phân tích, đến dung môi pha
động. Chúng tôi lựa chọn nhiệt độ cột 30°C để phân tích và kết quả này cũng tương
tự như điều kiện tác giả Trần Thị Hằng [7].
3.1.2.4. Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu.
Dựa và tính chất tan trong methanol của acid corosolic và các tài liệu [21],
[24] nên chúng tôi lựa chọn methanol làm dung môi chiết.
Khảo sát thời gian chiết:
Tiến hành khảo sát chiết mẫu cao M01 bằng phương pháp chiết siêu âm, dung
môi chiết là methanol, thời gian chiết khảo sát: 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút,
70 phút. Dựa vào đáp ứng phân tích (diện tích pic/ khối lượng cân mẫu) để lựa chọn
thời gian chiết. Kết quả biểu thị ở Hình 3.4.
Hình 3.4. Kết quả khảo sát thời gian chiết của mẫu M01
Nhận xét:
Đáp ứng phân tích của mẫu M01 chiết trong thời gian từ 15 phút đến 45 phút
thay đổi đáng kể, tăng thời gian chiết lên 60 phút và 70 phút đáp ứng phân tích thay
đổi không đáng kể. Như vậy, chúng tôi lựa chọn thời gian 60 phút để chiết acid
2,98
4,09
4,7
6,61
6,68
0 1 2 3 4 5 6 7 8
15
30
45
60
70
Đáp ứng phân tích
Thời
gian
(
phút)

35. 26
corosolic ra khỏi nền mẫu vì thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lần nhiều tạp, ảnh
hưởng đến kết quả phân tích.
3.1.2.5. Điều kiện phân tích
Xử lý mẫu
Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn vào bình định
mức 20 ml, thêm khoảng 15 ml MeOH lắc cho tan hoàn toàn, thêm MeOH vừa đủ
đến vạch, lắc kỹ. Lọc qua màng lọc 0,45 μm.
Dung dịch chuẩn làm việc: pha loãng dung dịch chuẩn gốc đến nồng độ thích
hợp tương đương nồng độ acid corosolic trong dung dịch thử. Lọc qua màng lọc
0,45 μm.
Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 0,10 g cao dược liệu vào bình định mức
25 ml. Thêm khoảng 15 ml MeOH lắc đều, đậy nút. Siêu âm 60 phút, sau đó thêm
MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Cho khoảng 6 ml dung dịch này vào ống ly tâm và
ly tâm 3500 vòng/phút trong 5 phút. Hút phần dịch phía trên và lọc qua màng lọc
0,45 μm.
Điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký: cột Eclipse XDB-C18 (4,6 x 250 mm, 5 μm)
- Detector PDA bước sóng 210 nm
- Pha động: Acetonitril: dung dịch H3 PO4 0,1% 90:10 (tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
- Nhiệt độ cột: 30°C
- Thể tích tiêm: 10 μl
Sử dụng điều kiện xử lý mẫu và điều kiện sắc ký trên, tiến hành thầm định
phương pháp định lượng acid corosolic trong cao BLN.

36. 27
3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID COROSOLIC
3.2.1. Sự phù hợp hệ thống
Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn acid corosolic có nồng độ 200 μg/ml theo điều
kiện sắc ký đã lựa chọn ở mục 3.1.2.5. Ghi lại sắc ký đồ, xác định các thông số của
pic chất phân tích. Kết quả được trình bày ở bảng sau
Bảng 3.1. Kết quả sự phù hợp của hệ thống
STT Thời gian lưu
(phút)
Diện tích pic
(mAU.s)
1 14,70 1554,0
2 14,74 1554,5
3 14,71 1554,6
4 14,72 1556,3
5 14,73 1549,8
6 14,72 1578,1
Trung bình 14,72 1557,9
RSD (%) 0,098 0,650
Nhận xét:
Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống cho thấy độ lệch chuẩn tương đối
(RSD) của thời gian lưu và diện tích pic của acid corosolic trong 6 phép phân tích
song song đều nhỏ hơn 2%. Điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký sử dụng là phù hợp,
đảm bảo độ ổn định cho phép phân tích định lượng acid corosolic.
3.2.2. Độ đặc hiệu
Tiến hành thẩm định độ đặc hiệu trên mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử.
- Mẫu trắng: dung môi pha mẫu (MeOH).

37. 28
- Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 500 μg/ml
- Mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,10 g mẫu M01 vào bình định mức 25 ml, thêm
15 ml MeOH và xử lý tương tự như mục 3.1.2.5.
Tiêm mẫu vào hệ thống HPLC, tiến hành phân tích như điều kiện đã lựa chọn,
thu được sắc ký đồ như Hình 3.5.
min
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
mAU
0
5
10
15
20
25
DAD1 A, Sig=210,4 Ref=360,100 (CO153009.D)
min
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Norm.
0
20
40
60
80
100
120
DAD1 A, Sig=210,4 Ref=360,100 (CO153002.D)
14.876
a)
b)

38. 29
Hình 3.5. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp
a) Sắc ký đồ mẫu trắng b) Sắc ký đồ mẫu chuẩn c) Sắc ký đồ mẫu M01
Nhận xét:
Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic chất phân tích tại thời gian
lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ của mẫu thử xuất
hiện pic chất tương ứng với pic của chất nghiên cứu trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
Do đó phương pháp đạt độ đặc hiệu.
Dựa vào thời gian lưu của pic chất phân tích trên sắc ký đồ mẫu thử trùng với
thời gian lưu của pic acid corosolic trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, sẽ định tính được
chất phân tích trong mẫu thử.
3.2.3. Độ tuyến tính
Từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 500 μg/ml, pha loãng chính xác
để được dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ từ 50 μg/ml - 400 μg/ml bằng MeOH.
Lọc qua màng lọc 0,45 m. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn mục
3.1.2.5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được trình bày ở Bảng 3.2, Hình 3.6,
Hình 3.7.
min
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
mAU
0
20
40
60
80
100
120
DAD1 A, Sig=210,4 Ref=360,100 (CO153010.D)
14.754
c)

39. 30
Hình 3.6. Sắc ký đồ của dung dịch acid corosolic chuẩn nồng độ từ 50-100
μg/ml
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính
STT Nồng độ hoạt chất (µg/ml) Diện tích pic (mAu.s)
1 400 3082,1
2 300 2341,5
3 200 1578,1
4 100 794,2
5 50 389,7
Hệ số tương quan: r ≥ 0,998
Phương trình hồi quy
r = 0,9998
y = 7,6932x + 21,557

40. 31
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic của acid
corosolic
Nhận xét:
Kết quả khảo sát tính tuyến tính cho thấy trong khoảng nồng độ từ 50-400
μg/ml có sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic rất (hệ số tương quan
r = 0,9998).
3.2.4. Độ lặp lại
Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá dựa trên kết quả phân tích các mẫu
độc lập trong cùng một điều kiện phân tích. Tiến hành định lượng 6 lần độc lập trên
mẫu thử M01 (độ ẩm: 7,18%) theo điều kiện xử lý mẫu và sắc ký đã lựa chọn mục
3.1.2.5. Tính hàm lượng acid corosolic theo dược liệu khô trong mẫu thử, độ lệch
chuẩn tương đối, kết quả được trình bày ở Bảng 3.3.
y = 7.6932x + 21.557
R² = 0.9998
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 100 200 300 400 500
diện
tích
pic
(mAU.s)
nồng độ (μg/ml)

41. 32
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu M01
STT Khối lượng
cân (g)
Diện tích
pic
(mAu.s)
Hàm lượng acid
corosolic tính theo
cao khô
(mg/100mg)
Thống kê độ lặp lại
RSD ≤ 2,7%
1 0,10377 712,3 2,328 Hàm lượng trung bình:
2,34%
Độ lệch chuẩn tương
đối:
RSD (%) = 0,94%
2 0,10476 716,8 2,321
3 0,10209 705,8 2,345
4 0,10956 769,2 2,381
5 0,10871 748,5 2,335
6 0,10476 719,2 2,327
Nhận xét:
Theo AOAC, hàm lượng chất phân tích ≥ 1 và < 10%, độ lặp lại của phương
pháp RSD (%) phải đạt < 2,7 %. Kết quả phân tích cho thấy độ lặp lại của phương
pháp đối với acid corosolic đạt yêu cầu (RSD = 0,94%). Như vậy, phương pháp có
độ lặp lại đạt yêu cầu của AOAC [19].
3.2.5. Độ đúng
Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn: thêm một lượng chính
xác chất chuẩn acid corosolic vào mẫu thử sao cho nồng độ của hoạt chất vẫn nằm
trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tiến hành định lượng dung dịch thử bằng
phương pháp đã lựa chọn ở mục 3.1.2.5. Dựa vào hàm lượng acid corosolic đã biết
trong mẫu thử, diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn và dung dịch thử thêm
chuẩn, xác định giá trị phần trăm tìm lại chuẩn. Kết quả khảo sát độ đúng được trình
bày ở bảng sau:

42. 33
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với mẫu M01
STT
Diện tích pic
(mAU.s)
Cm+c Cm Cc
Độ tìm lại (%)
97 – 103%
1 1455,67 0,186 0,0781 0,106 101,79
2 1404,40 0,180 0,0765 0,106 97,45
3 1433,26 0,183 0,0776 0,106 99,43
4 1436,74 0,184 0,0769 0,106 101,04
5 1418,33 0,182 0,0776 0,106 98,49
6 1414,46 0,181 0,0770 0,106 98,11
T.bình 99,39
RSD(%) 1,73
Trong đó:
Cm+c: Nồng độ acid corosolic trong dung dịch mẫu thử thêm chuẩn (mg/ml)
Cm: Nồng độ acid corosolic từ mẫu thử có trong dung dịch mẫu thử thêm chuẩn
(mg/ml)
Cc: Nồng độ acid corosolic từ chuẩn thêm vào trong dung dịch mẫu thử thêm chuẩn
(mg/ml)
Nhận xét:
Với quy trình đã lựa chọn, định lượng các chất đã nghiên cứu có độ thu hồi
đều nằm trong khoảng đáp ứng yêu cầu về thẩm định phương pháp đối với phân
tích mẫu của AOAC: Mẫu M01 có độ thu hồi của acid corosolic là 97,5 – 101,8%
(nằm trong khoảng 97 – 103% với hàm lượng mẫu ≥ 1 và < 10% theo AOAC).

43. 34
3.3. ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRÊN MỘT SỐ MẪU CAO
BẰNG LĂNG NƯỚC
Xác định độ ẩm của mẫu cao BLN theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục
12.16. Cân nhanh 0,50 g mẫu thử đã nghiền thành bột mịn vào một cốc đáy bằng có
đường kính khoảng 50 mm và chiều cao khoảng 30 mm. Sấy ở 100 – 105 0
C trong 3
giờ. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm có chất hút ẩm phosphor pentoxyd hoặc
silica gel và cân. Tính toán kết quả theo phần trăm khối lượng.
Chuẩn bị các dung dịch mẫu thử và dung dịch mẫu chuẩn, tiến hành phân tích
với điều kiện như mục 3.1.2.5.
Xác định hàm lượng acid corosolic trong mẫu thử cao BLN dựa vào diện tích
pic acid corosolic trong sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn, nồng độ acid
corosolic trong dung dịch chuẩn, khối lượng, độ pha loãng và độ ẩm của mẫu thử
cao dược liệu. Sử dụng số liệu của dung dịch chuẩn có đáp ứng phân tích (diện tích
pic) tương đương với dung dịch mẫu thử để tính kết quả. Hàm lượng hoạt chất trong
mẫu thử tính theo cao khô được tính theo công thức:
ST . Cc . 10-6
. HSPLT
Hàm lượng (%) =  x 100
SC . mT. (1-H%)
Trong đó:
ST và SC: Diện tích pic acid corosolic trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử và mẫu
chuẩn
Cc : Nồng độ acid corosolic trong dung dịch chuẩn (µg/ml)
mT: Khối lượng mẫu thử (g)
HSPLT: Hệ số pha loãng dung dịch thử
H: Độ ẩm của mẫu thử
Kết quả được trình bày như Bảng 3.5.

44. 35
Bảng 3.5. Hàm lượng acid corosolic trong các mẫu cao Bằng lăng nước
STT Mẫu thử
Độ ẩm
(%)
Khối
lượng
(g)
Diện tích
pic
(mAU.s)
Hàm lượng acid
corosolic tính theo
cao khô (%)
1 BLN M02 2,10 0,10501 452,65 1,41(a)
2 BLN 01-16 (1) 4,07 0,10490 587,89 1,78(a)
3 BLN 01-16 (2) 4,81 0,10380 494,73 1,61(a)
4 BLNL Mẻ 39 6,25 0,20387 866,54 1,43(b)
Chuẩn acid corosolic:
(a) là kết quả tính theo nồng độ: 50 µg/ml, diện tích pic: 389,73 mAU.s
(b) là kết quả tính theo nồng độ: 100 µg/ml, diện tích pic: 794,22 mAU.s
Như vậy, hàm lượng acid corosolic trong các mẫu cao Bằng lăng nước định
lượng cho kết quả khá đều nhau từ 1,41-1,78%.
3.4. BÀN LUẬN
Về lựa chọn phương pháp phân tích
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hiện đại có thể
định tính, định lượng, phân tích được nhiều hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mà
không cần phân tách trước đó. Phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, độ đúng và độ
chính xác cao nên được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm.
Tác giả Katta Vijaykumar [21] sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu
năng cao (HPTLC) định lượng acid corosolic trong cao Bằng lăng nước. Phương
pháp này có ưu điểm là tiến hành đơn giản, không cần quá quan tâm đến ảnh hưởng
của nền mẫu, nhưng quá trình tiến hành chịu ảnh hưởng của của nhiều yếu tố như sự
chính xác của thể tích chấm sắc ký, cách chấm, thiết bị hay chương trình xử lý số
liệu,... các yếu tố đó làm ảnh hưởng đến kết quả phân tích. So với HPTLC, phương

45. 36
pháp HPLC có hiệu năng tách cao hơn, phân tích chính xác hơn, thường quy trong
các phòng thí nghiệm, góp phần tiêu chuẩn hóa cao dược liệu phục vụ sản xuất.
Về lựa chọn xử lý mẫu
Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu dựa vào độ tan của hoạt chất trong dung môi
thông thường. Acid corosolic là một triterpenoid, dễ tan trong methanol [24] vì vậy
chúng tôi lựa chọn methanol để chiết hoạt chất trong cao bằng phương pháp siêu
âm. Phương pháp siêu âm là phương pháp thường dùng để chiết hoạt chất từ dược
liệu, phương pháp này làm tăng mạnh tính thẩm thấu, khuếch tán nhờ tác dụng của
sóng siêu âm: tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng thành
các hạt nhỏ, tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy
thời gian chiết mẫu ảnh hưởng đến đáp ứng phân tích của hoạt chất chiết ra. Cụ thể
khi chiết mẫu trong thời gian 15, 30, 60 phút đáp ứng phân tích tăng, khi tăng thời
gian chiết lên 70 phút đáp ứng phân tích thay đổi không đáng kể. Sắc ký đồ của dịch
chiết mẫu thử trong 60 phút cho pic chất phân tích gọn, cân đối, thời gian lưu phù
hợp. Tăng thời gian chiết hàm lượng hoạt chất tăng không đáng kể, mặt khác có thể
làm tăng khả năng hòa tan các tạp, ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Về điều kiện sắc ký
Sắc ký lỏng pha đảo hiện nay được sử dụng rộng rãi vì khả năng tách và phân
tích được nhiều hợp chất có độ phân cực đa dạng, từ phân cực đến ít phân cực và
không phân cực. Pha tĩnh không phân cực với cột (C18) là loại pha tĩnh có hiệu quả
tách tốt, sử dụng phổ biến nhất hiện nay.
Nhiệt độ cột ảnh hưởng đến khả năng phân tích do ảnh hưởng đến sự rửa giải
của hoạt chất. Khi tăng nhiệt độ, độ nhớt của dung môi pha động giảm, chất phân
tích sẽ được rửa giải nhanh hơn. Khảo sát nhiệt độ cột ở 30°C cho thời gian lưu của
chất phân tích (14,733 phút) giảm khoảng 5 phút so với nhiệt độ phòng (19,571
phút), như vậy lựa chọn nhiệt độ cột 30°C làm giảm đáng kể thời gian lưu chất phân
tích. Nhiệt độ cột này cũng tương đồng với nghiên cứu của tác giả Trần Thị Hằng
[7].

46. 37
Với điều kiện sắc ký đã lựa chọn, thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký
đồ là 14,70 – 14,74 phút (giảm khoảng 1
5
⁄ so với nghiên cứu của tác giả Trần Thị
Hằng [7] (tR = 19,10 – 19,30 phút) và nghiên cứu của tác giả W. Zong [28] (tR =
19,05 phút)), pic chất phân tích gọn, cân đối, tách khỏi nền mẫu, đạt độ phân giải
đường nền.
Thẩm định phương pháp
Các phương pháp định lượng acid corosolic trong lá, cao Bằng lăng nước ở
trong và ngoài nước chủ yếu dùng phương pháp HPLC với detector UV-VIS. Tác
giả Trần Thị Hằng [7] đã nghiên cứu định tính, định lượng acid corosolic trong lá
Bằng lăng nước bằng HPLC nhưng chưa thẩm định phương pháp và chưa đạt độ
phân giải đường nền. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thẩm định phương pháp
phân tích với các chỉ tiêu: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng. Kết
quả cho thấy phương pháp đạt độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính có hệ số tương quan
chặt chẽ giữa nồng độ hoạt chất và đáp ứng phân tích (diện tích pic sắc ký) (r =
0,9998) tương tự như nghiên cứu của Neeshad P. Joshi [24] và W. Zong [28], tốt
hơn nghiên cứu của tác giả Trần Thị Hằng [7] (r = 0,9959). Độ đúng được tính toán
dựa vào phần trăm tìm lại chuẩn, kết quả thu được có RSD: 97,5-101,8% đạt yêu
cầu theo AOAC, cũng phù hợp với nghiên cứu của Katta Vijaykumar [21] (RSD:
95,98-100,16%). Độ lặp lại của phương pháp diễn tả độ chính xác của quy trình
phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm và trong một khoảng thời gian ngắn. Kết
quả độ lặp lại của phương pháp phù hợp với tiêu chuẩn của AOAC (RSD = 0,94% <
2,7%).
Ứng dụng của phương pháp
Hàm lượng hoạt chất trong cao BLN: 1,41-2,34% tính theo cao khô. Phương
pháp tiến hành nhanh, đơn giản, tổng thời gian phân tích và xử lý mẫu khoảng 2 giờ
đáp ứng nhu cầu phục vụ sản xuất.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

47. 38
1. KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi thu được một số kết quả như sau:
1. Đã xây dựng được phương pháp định lượng acid corosolic trong cao BLN bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao. Mẫu thử cao Bằng lăng nước được chiết với methanol
bằng siêu âm trong 60 phút, dịch chiết được ly tâm và tiến hành sắc ký với cột pha
đảo Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6 mm, 5μm), nhiệt độ cột 30°C, pha động:
acetonitril: dung dịch H3PO4 0,1% 90:10 (tt/tt). Tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích
tiêm mẫu 10 μl, detector PDA bước sóng 210 nm. Định tính acid corosolic trong
mẫu thử căn cứ vào thời gian lưu của dung dịch mẫu thử trùng với thời gian lưu
tương ứng với dung dịch mẫu chuẩn. Xác định hàm lượng acid corosolic trong mẫu
thử dựa vào đáp ứng phân tích của mẫu thử, mẫu chuẩn, nồng độ dung dịch chuẩn,
khối lượng và độ pha loãng của mẫu thử.
2. Đã thẩm định phương pháp phân tích acid corosolic trong cao Bằng lăng nước
theo hướng dẫn của AOAC 2012. Kết quả thu được cho thấy các chỉ tiêu thẩm định:
độ chọn lọc đảm bảo, độ tuyến tính có tương quan chặt chẽ giữa diện tích pic với
nồng độ trong khoảng 50 - 400 μg/ml (r = 0,9998), độ lặp lại tốt (RSD = 0,936%),
độ đúng từ 97,5 - 101,8% nằm trong khoảng giới hạn 97 - 103% đối với hàm lượng
mẫu ≥ 1% và < 10% theo AOAC.
3. Đã áp dụng phương pháp để định lượng acid corosolic trong 5 mẫu cao nghiên
cứu. Dựa vào phương pháp chuẩn ngoại 1 điểm xác định hàm lượng acid corosolic
trong cao BLN từ 1,4 - 2,34% tính theo cao khô. Phương pháp tiến hành nhanh, đơn
giản với tổng thời gian xử lý mẫu và phân tích khoảng 2 giờ, đáp ứng yêu cầu phục
vụ sản xuất.
2. ĐỀ XUẤT
Ứng dụng phương pháp phân tích acid corosolic đã xây dựng, định lượng acid
corosolic trong mẫu cao phục vụ sản xuất và làm cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn dược
liệu Bằng lăng nước.

48. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Trần Tử An và cộng sự (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, tr.
84-111.
2. Bộ Y Tế (2011), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh đái tháo đường týp
2.
3. Bộ Y Tế (2010), Dược điển Việt Nam IV.
4. Bộ Y Tế (2007), Hóa phân tích NXB Y Học, Hà Nội.
5. Võ Văn Chi (1996), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr. 76.
6. Võ Văn Chi, Trần Hợp (2002), Cây cỏ có ích ở Việt Nam, NXB Giáo dục,
Hà Nội, tr. 1025-1026.
7. Trần Thị Hằng (2015), Nghiên cứu định tính, định lượng acid corosolic
trong lá một số mẫu thuộc chi Lagerstroemia tại Việt Nam, Khóa luận tốt
nghiệp Dược sỹ, Đại Học Dược Hà Nội.
8. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ, Thành phố Hồ Chí
Minh, tr. 29.
9. Phùng Thanh Hương (2010), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết và ảnh
hưởng trên chuyển hóa của dịch chiết lá cây Bằng lăng nước
(Langerstroemia speciosa (L.) Pers.) ở Việt Nam, Luận án tiến sỹ dược học,
Đại Học Dược Hà Nội.
10. Phùng Thanh Hương, Nguyễn Thị Thu Hiền (2009), "Tác dụng của dịch
chiết lá Bằng lăng nước (Lagerstroemia Speciosa (L.) Pers.) trên chuột cống
đái tháo đường typ 2", Tạp chí khoa học, (401).
11. Phùng Thanh Hương, Nguyễn Xuân Thắng (2009), "Phân lập acid corosolic
vad acid ursolic từ lá cây Bằng lăng nước (Langerstroemia speciosa (L.)
Pers.) thu hái ở Tây Ninh", tr. 32- 36.
12. Nguyễn Thị Quế Mai (2015), Xây dựng phương pháp định tính, định lượng
đồng thời adenosin và cordycepin trong chế phấm chứa đông trùng hạ thảo

49. bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Luận văn thạc sỹ dược học,
Đại Học Dược Hà Nội.
13. Nguyễn Quyết Tiến, Phạm Thị Hồng Minh (2011), "Góp phần nghiên cứu
thành phần hóa học của cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) ở Việt
Nam".
Tiếng Anh
14. Bokyung Sung Yong Jung Kang, Dong Hwan Kim, Seong Yeon Hwang,
Yujin Lee, Minjeong Kim, Jeong Hyun Yoon, Cheol Min Kim, Hae Young
Chung, Nam Deuk Kim (2014), "Corosolic acid induces apoptotic cell death
in HCT116 human colon cancer cells through a caspase-dependent pathway",
International Journal of Molecular Medicine, pp. 943-949.
15. Eric Wei Chiang Chan Lea Ngar Tan, Siu Kuin Wong (2014),
"Phytochemistry and Pharmacology of Lagerstroemia speciosa: A Natural
Remedy for Diabetes ", International Journal of Herbal Medicine, 2(2), pp.
100-105.
16. Guy Klein Jaekyung Kim, Klaus Himmeldirk, Yanyan Cao, Xiaozhuo Chen,
(2007), "Antidiabetes and Anti-obesity Activity of Lagerstroemia speciosa",
Evid Based Complement Alternat Med, 4(4), pp. 401-407.
17. Hou W1 Li Y, Zhang Q, Wei X, Peng A, Chen L, Wei Y (2009), "Triterpene
acids isolated from Lagerstroemia speciosa leaves as alpha-glucosidase
inhibitors", Phytother Research, 23(5), p. 2661.
18. Huang GH Zhan Q, Li JL, Chen C, Huang DD, Chen WS et al (2013),
"Chemical constituents from leaves of Lagerstroemia speciosa L",
Biochemical Systematics and Ecology, 51, pp. 109-112.
19. International AOAC (2012), AOAC official methods of analysis. Appendix K:
Guidelines for dietary supplements and botanicals, Part 1: AOAC Guidelines

50. for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary
Supplements and Botanicals 2012.
20. Kakuda T., Sakane I. (1996), "Hypoglycemic effect of extracts from
Lagerstroemia speciosa L. leaves in genetically diabetic KK-AY mice",
Biosci Biotechnol Biochem, 60(2), pp. 204-208.
21. Katta Vijaykumar Papolu B. Murthy, Sukala Kannababu, B. Syamasundar,
Gottumukkala V. Subbaraju, (2007), "Quantitative determination of
corosolic acid in Lagerstroemia speciosa leaves, extracts and dosage forms ",
International Journal of Applied Science and Engineering 4(2), pp. 103-114.
22. Miura T., Ueda N. (2006), "Antidiabetic effects of corosolic acid in KK-Ay
diabetic mice", Biol Pharm Bull, 29(3), pp. 585-587.
23. Neeshad P. Joshi Vas V. Vaidya, Siddeshwar V Patankar, Maharudra B
Kenkare (2013), "A rapid bioanalytical method for simultaneous
determination of coroslic acid and asiatic acid in human plasma by soild
phase extraction and direct injection into liquid Chromatrography mass
spectrometry ", International Journal of Bioassays, 02 (12), pp. 1585-1591
24. Neeshad P. Joshi Vikas V. Vaidya, Sachin S. Pawar, Jaydeep N. Gadgil
(2013), "Development and validation of hplc method for simultaneous
determination of bio-active markers corosolic acid, asiatic acid and β-
sitosterol from leaves of Lagerstroemia speciosa linn. and from marketed
formulation ", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, 5(4), pp. 223-226.
25. Shi L., Zhang W., et al. (2008), "Corosolic acid stimulates glucose uptake via
enhancing insulin receptor phosphorylation", Eur J Pharmacol, 584(1), pp.
21-29.
26. Sidney J.stohs Howard Miller, Gilbert R. kaats (2012), "A review of the
efficacy and safety of Banaba (Lagerstroemia speciosa L.) and corosolic
acid", Phytotherapy research, 26(3), pp. 3664.

51. 27. Unno T Sakane I, Masumizu T, KohnoM, Kakuda T (1997), "Antioxidant
activity of water extracts of Lagerstroemia speciosa leaves", Biosci
Biotechnol Biochem, pp. 1772–1774.
28. W. Zong W. Xia, B. Cui (2007), "Determination of corosolic acid and
maslinic acids in Lagerstroemia speciosa leaves by TLC/HPLC method",
Pharmaceutical Chemistry Journal, 41(4), pp. 43-45.
29. World Health Organization (2016), Global report on diabetes.
30. Yamada K "Dietary corosolic acid ameliorates obesity and hepatic steatosis
in KK-Ay mice", Biological Pharmaceutical Bulletin, 31(4), pp. 651-655.