berbagai alat deteksi cepat dalam bahan baku hasil perairan

1. MODUL PRAKTIKUM 3
THP 411. PENGANTAR DESAIN ALAT UJI PRAKTIS DAN METODE DETEKSI
MUTU BAHAN BAKU HASIL PERAIRAN
PJMK: Dr Asadatun Abdullah, SPi, MSM, MSi
“Desain Primer Spesifik untuk Amplifikasi DNA Produk Hasil
Perairan”
PENDAHULUAN
Desain primer adalah langkah terpenting untuk keberhasilan proses
amplifikasi dalam metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Primer merupakan
asam nukleat pertama untuk peletakan DNA polymerase. Primer harus memiliki
urutan basa yang optimal untuk spesifikasi maksimal dan efesiensi proses PCR.
Primer yang kurang baik akan menghasilkan sedikit amplikon karena amplifikasi
yang kurang spesifik. Pembuatan primer dengan bantuan alat dan perangkat lunak
bioinformatika (Kumar dan Chordia 2015).
Pembuatan primer spesifik harus memperhatikan karakteristik primer yang
baik. Pembuatan primer dengan memperhatikan panjang primer, suhu leleh, selisih
suhu leleh, kadungan basa G/C, GC clamp, struktur sekunder yang terbentuk, dan
perimer dimer (Sasmito et al. 2014). Karakteristik primer untuk qPCR berbeda
dengan primer yang digunakan untuk PCR konvensional. Kriteria primer untuk
qPCR antara lain komposisi GC 30-80%, Tm 50-60 ºC (selisih Tm antar primer tidak
lebih dari 2 ºC), pengulangan nukleotida makimal 3-4, panjang sekuen 15-30 bp,
panjang amplikon 50-150 bp, primer dimer dihindari, dan maksimal dua G/C
diakhir 5 bp (Rodriguez-Lazaro dan Hernandez 2013). Primer untuk PCR dengan
kriteria PCR mini barcode antara lain komposisi GC 40-60%, Tm 45-65 ºC (selisih
Tm antar primer tidak lebih dari 5 ºC), pengulangan nukleotida makimal 4, panjang
sekuen 15-30 bp, panjang amplikon antara 500 bp, primer dimer dihindari, dan
maksimal tiga G/C diakhir 5 bp (Lorenz 2012).
Primer yang digunakan untuk amplifikasi berbasis PCR berasal dari DNA
mitokondria. Autentikasi dengan analisis DNA dari gen mitokondria dapat dengan
menggunakan barcode DNA seperti gen COI dan gen cytochrome b (Abdullah et
al. 2020). Primer dirancang dapat dengan software online maupun aplikasi.
Pembuatan primer secara online dengan webtool Primer3 dan primer-BLAST
(Kumar dan Chordia 2015). Pembuatan primer secara manual dengan aplikasi
Bioedit. Aplikasi Bioedit memiliki menu Program ClustalW yang membantu untuk
pensejajaran urutan basa untuk penentuan kawasanan lestari (Wahyuni et al. 2020).
Atau dapat juga dengan aplikasi MEGA-X. Primer kemudian diuji spesifitasnya
melalui BLAST-NCBI untuk memastikan bahwa primer yang digunakan benar-
benar unik dan tidak menempel pada organisme lain (Sasmito et al. 2014). Webtool
Oligoevaluator digunakan untuk evaluasi karakteristik primer yang telah dirancang
(Abdullah et al. 2019).

2. TUJUAN PRAKTIKUM
Tujuan praktikum yaitu praktikan dapat mengetahui pemanfaatan perangkat lunak
untuk desain primer spesifik dan dapat membuat primer spesifik untuk alat PCR
konvensional dan qPCR.
ALAT DAN BAHAN
Alat dan bahan yang digunkan dalam praktikum yaitu komputer, koneksi internet,
dan sekuen DNA spesies target.
METODE
Mengenal website NCBI dan mengunduh sekuen
1. Langkah pertama, masuk ke website https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ hingga
muncul gambar seperti dibawah ini, pada bagian popular resource terdapat
berbagai tool baik untuk mencari sekuen gen, nukleotida atau protein serta tool
analisis tool seperti BLAST

3. 2. Untuk mencari sekuen DNA tertentu, klik Nucleotide, maka akan muncul gambar
seperti dibawah. Masukkan nama spesies dan gen yang akan dicari pada kolom
yang diberi tanda merah lalu klik search
3. Selanjutnya akan muncul pilihan sekuen spesies dan gen yang tersedia di database
Klik sekuen spesies yang diinginkan maka akan muncul tampilan seperti berikut

4. 4. Klik Fasta lalu send to dan create file untuk menyimpan file sekuen
Sekuen gen
Sekuen protein

5. Mengenal website BOLD dan mengunduh sekuen
1. Langkah pertama masuk ke website BOLD
https://www.boldsystems.org/index.php/ lalu pilih public data dan masukkan nama
spesies dan gen yang akan dicari pada kolom search
2. Hasil yang didapatkan dapat dilihat pada Gambar

6. Cara Desain Primer menggunakan web tool Primer3Plus
1. Langkah pertama, cari sekuen yang ingin di desain primernya pada website gen bank
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) lalu download dalam bentuk FASTA
2. Desain primer menggunakan web tool Primer3Plus di link
https://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi, lalu masukkan sekuen di choose
file lalu pada Load serve settings pilih default untuk PCR konvensional dan qPCR
untuk primer qPCR
3. Sesuaikan pengisian parameter General Setting dan Advanced setting di Primer3Plus
sesuai spesifikasi primer yang diinginkan lalu Pick Primer

7. 4. Primer3Plus akan menyediakan beberapa pilihan terbaik primer sesuai karakteristik
primer yang diinginkan

8. 5. Uji spesifitas kandidat primer yang didapatkan dari primer BLAST menggunakan web
tool BLAST
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSe
arch&LINK_LOC=blasthome)
Masuk sekuen primer forward/reverse pada kolom enter accession sequen atau choose
file lalu klik BLAST
6. Hasil BLAST primer yang memiliki spesifitas baik dapat dilihat dibawah ini

9. 7. Masing-masing kandidat primer juga diuji kesesuaian karakteristiknya menggunakan
web tool OligoEvaluatorTM
(http://www.oligoevaluator.com/OligoCalcServlet)

10. Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu komputer, koneksi internet, dan sekuen
DNA
METODE
Cara desain primer dengan primer BLAST
1. Langkah pertama, cari sekuen yang ingin di desain primernya pada website gen bank
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) lalu download dalam bentuk FASTA
2. Desain primer menggunakan web tool Primer BLAST di link
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
3. Sesuaikan pengisian parameter di Primer BLAST dengan primer spesifik yang
diinginkan lalu klik Get Primers

11. 4. Primer BLAST akan menyediakan maksimal 10 pilihan terbaik primer sesuai
karakteristik primer yang diinginkan
5. Uji spesifitas kandidat primer yang didapatkan dari primer BLAST menggunakan web
tool BLAST
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSe
arch&LINK_LOC=blasthome)
Masuk sekuen primer forward/reverse pada kolom enter accession sequen atau choose
file lalu klik BLAST

12. 6. Hasil BLAST primer yang memiliki spesifitas baik dapat dilihat dibawah ini
7. Masing-masing kandidat primer juga diuji kesesuaian karakteristiknya menggunakan
web tool OligoEvaluatorTM
(http://www.oligoevaluator.com/OligoCalcServlet)

14. Design Primer manual menggunakan BioEdit
1. Buka aplikasi bioedit, tampilan software seperti gambar di bawah ini
2. Klik File lalu pilih new alignment atau klik icon gambar pada ujung kiri bagian
atas, maka akan muncul tampilan seperti di bawah ini
3. Untuk memasukkan sekuen klik menu File lalu pilih import → sequence alignment
file (sekuen diunduh dari database NCBI)

15. 4. Pilih file sekuen yang akan digunakan untuk desain primer lalu klik open seperti
contoh di bawah ini
5. Berikut tampilan sekuen yang telah dimasukkan

16. 6. Lakukan pensejajaran sekuen atau alignment dengan memilih menu “Accessory
Application” lalu pilih “CrustalW Multiple Alignment”
7. Langkah selanjutnya klik Run CrustalW, lalu muncul kotak seperti tampilan dibawah
klik ok

17. 8. Setelah proses alignment selesai, pilih icon gambar (view conservation by plotting
identities to a standard as a dot) untuk memudahkan dalam mengetahui daerah yang
lestari/koservatif pada sekuen

18. 9. a. Lakukan desain pimer dengan memilih sekuen pada daerah lestari dengan
memperhatikan kriteria primer optimal, lakukan desain primer untuk primer forward
terlebih dahulu

19. b. Untuk desain primer reverse setelah pemilihan sekuen, lakukan reverse
complement sebelum dilakukan analisis lanjut. Dengan masuk pada website “
http://reverse-complement.com/ ”, copy sekuen pilihan lalu run dengan klik reverse
complement seperti contoh di bawah ini
c. Hasil reverse complement primer reverse seperti gambar di bawah ini, kemudian
baru bisa digunakan untuk analisis

20. 10. Setelah memilih sekuen lakukan evaluasi untuk mengetahui apakah sekuen tersebut
telah memenuhi kriteria primer optimal menggunakan OligoEvaluatorTM
dengan meng-
copy sekuen tersebut, lalu pilih calculate. Lakukan langkah ke 9 dan 10 secara
berulang-ulang hingga mendapat primer yang memenuhi kriteria primer optimal)
11. Untuk menetahui sekuen tersebut benar sekuen yang kita ingin, lakukan evaluasi
menggunakan blast NCBI atau klik langsung pilihan sequencing pada kolom BLAST,
seperti gambar di bawah ini
Klik

21. 12. Blast sekuen primer terpilih dengan klik pilihan blast
13. Hasil blast sekuen primer seperti gambar di bawah ini
Klik

22. 14. Hasil desain primer yang dapat digunakan untuk identifikasi spesies
Sekuen yang dapat diaplikasikan untuk identifikasi lebih lanjut

23. DAFTAR PUSTAKA
Abdullah A, Nurilmala M, Muttaqin E, Yulianto I. 2020. DNA-based analysis of shark products
sold on the Indonesian market towards seafood labelling accuracy program. Biodiversitas.
(21): 1385-1390.
Abdullah A, Sativa HA, Nurhayati T, Nurilmala M. 2019. Pemanfaatan DNA barcoding untuk
ketertelusuran label berbagai produk olahan ikan berbasis surimi komersial. Jurnal
Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia. 22(3): 508-519.
Kumar A dan Chordia N. 2015. In Silico PCR Primer Designing and Validation. Methods in
Molecular Biology. 1275: 143- 151.
Lorenz TC. 2012. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization
strategies. Journal of Visualized Experiments. 63(5): 1-15.
Rodriguez-Lazaro D, Hernandez M. 2013. Real-time PCR in food science: introduction. Curr.
Issues Mol Biol. 15: 25-38.
Sasmito DEK, Kurniawa R, Muhimmah I. 2014. Karakteristik primer pada Polymerase Chain
Reaction (PCR) untuk sekuensing DNA: mini review. Seminar Nasional Informatika Medis
(SNIMed). 5(1): 93-102.
Wahyuni FD, Saraswati H, Dewi KS. 2020. In-Silico Analysis for cryI Gene amplification from
Bacillus thuringiensis. Bioedukasi. 18 (1): 8-14.