LOKALIZACIJA CELIČNIH STRUKTUR V BIOLOŠKIH VZORCIH Z MIKROSKOPSKIMI TEHNIKAMI IN DIFERENCIALNO BARVANJE TKIV

UNIVERZA V LJUBLJANI
BIOTEHNIu SKA FAKULTETA
ODDELEK ZA BIOLOGIJO
Nejc DRAGANJEC
LOKALIZACIJA CELIv CNIH STRUKTUR V BIOLOu SKIH
VZORCIH Z MIKROSKOPSKIMI TEHNIKAMI IN
DIFERENCIALNO BARVANJE TKIV
POROv CILO O VAJAH PRI PREDMETU
FUNKCIONALNA BIOLOGIJA CELICE
Molekulska in funkcionalna biologija MSc
Mentor: asist. dr. Nada u ZNIDARu SIv C
Mentor: dr. Magda TUu SEK u ZNIDARIv C
Ljubljana, 2014

Draganjec N., Lok. cel. struk. v biol. vzorcih z mikroskop. tehnikami in diferenc. barvanje tkiv
Porov cilo o vajah, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehnik ska fakulteta, Oddelek za biologijo, 2014
II
KAZALO
1 Uvod 2
2 Materiali in metode 3
2.1 Materiali in oprema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.1.1 Priprava polilizinskih stekelc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.2 Metode diferencialnih barvanj . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.2.1 Barvanje s sudan v crno B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.2.2 Barvanje z DAPI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.2.3 Barvanje s hematoksilin-eozin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.2.4 Barvanje s trikromatskim barvanjem po Massonu . . . . . . . . 5
3 Rezultati 6
3.1 Sudan v crno B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.2 DAPI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.3 Hematoksilin-eozin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3.4 Trikromo barvanje po Massonu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
4 Diskusija 25
Viri 25

1
SLIKE
3.1 Jetra goveda (Bos taurus) -- KONTROLA . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.2 Jetra goverda (Bos taurus) -- SUDAN v CRNO B . . . . . . . . . . . . . 7
3.3 Mik sica lososa (Salmo salar) -- KONTROLA . . . . . . . . . . . . . . . 8
3.4 Mik sica lososa (Salmo salar) -- SUDAN v CRNO B . . . . . . . . . . . . . 9
3.5 Mik sica lososa (Salmo salar) -- DAPI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
3.6 Celice epitela v clovek ske (Homo sapiens sapiens) ustne sluznice I -- DAPI 12
3.7 Celice epitela v clovek ske (Homo sapiens sapiens) ustne sluznice II -- DAPI 13
3.8 v Crevo prak siv ca (Sus scrofa domestica) -- HEMATOKSILIN-EOZIN . . . 14
3.12 Rep podgane (Rattus sp.) -- HEMATOKSILIN-EOZIN . . . . . . . . . 18
3.13 Kov za mov cerila (Proteus anguinus) -- HEMATOKSILIN-EOZIN . . . . . 19
3.14 Kov za mov cerila (Proteus anguinus) -- TRIKROMO BARVANJE PO MAS-
SONU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.15 Rep podgane (Rattus sp.) -- TRIKROMO BARVANJE PO MASSONU 21

2
1 UVOD
K izrednemu napredku mikroskopije ni prispeval le razvoj orodij, torej razvoj novih
mikroskopov in izboljk sava v ze obstojev cih tehnik mikroskopiranja. Kljuv cno je k razvoju
prispeval tudi napredek metodologije in pojav novih postopkov priprave mikroskopskih
preparatov. Kadar biolok ski vzorec pripravljamo za mikroskopijo moramo biti k se posebej
pozorni na ohranjanje celiv cne strukture in biolok skih delov/molekul, ki so predmet
preuv cevanja. Dobre metode priprav vzorcev za lokalizacijo omogov cajo selektivnost
v postopku priprave, postopek mora biti natanv cen in obv cutljiv, ohranjati rekacijski
produkt in omogov ca enostavno in kontrastno vizualizacijo preuv cevane strukture. Med
pripravo ne smemo pozabiti na pozitivne in negativne kontrole (u Znidark siv c, 2014).
Nekateri postopki priprave mikroskopskih preparatov so znani v ze zelo dolgo, takk sna
so predvsem nespecifiv cna barvanja in kontrastiranje vzorcev. Mnogo tehnik, ki jih
uporabljamo danes, pa je povsem novih. Zelo pogosto se uporabljajo selektivna barvanja,
dokazovanje encimske aktivnosti, imunolokalizacija, hibridizacija in situ, oznav cevanje s
fluorescenv cnimi proteini (npr. GFP) (Chopra et al., 2012; u Znidark siv c, 2014). . .
Na vajah smo za lokalizacijo uporabili barvanja s sudan v crno B (lipidi), DAPI (nukleinske
kisline), hematoksilin-eozin (jedra, citoplazma in kolagen) in trikromatsko barvanje po
Massonu.

3
2 MATERIALI IN METODE
2.1 MATERIALI IN OPREMA
Selektivna barvanja za lokalizacijo specifiv cnih struktur so pogosto metodolok sko pre-
cej zahtevna in potekajo v vev cih zelo natanv cno dolov cenih korakih. Pozorni moramo
biti na koncentracije uporabljenih barvil in kemikalij, na v cas izpostavljenosti, nav cin
izpostavljenosti in pa seveda lastno zak sv cito, saj so histolok ske kemikalije pogosto to-
ksiv cne. Potrebovali smo razliv cne kemikalije: barvila, lestvico koncentracij alkoholov
za izpiranje in dehidriranje/rehidriranje, barvila, smole, v cistila za laboratorijsko ste-
klovino, destilirano vodo. . . Rezanje biolok skih vzorcev je potekalo v kriotomu in na
mikrotomu, pregledovanje konv cnih vzorcev pa na namenskih mikroskopih (klasiv cni
mikroskop, fluorescenv cna mikroskopija in delovni v laboratoriju za sprotno preverjanje
barvanja preparatov). Barvali smo v namenskih steklenih kadeh z nosilci za stekelca, ki
smo jih premikali s pinceto. Za zak sv cito smo poskrbeli z rokavicami, posebno nevarne
korake pa izvedli v digestoriju.
2.1.1 Priprava polilizinskih stekelc
Polilizinska stekelca so objektna stekla premazana z adhezivom (Poly-L-lizin). Priprava
je dolgotrajna, tako da smo za lastne potrebe uporabili v ze v naprej pripravljena stekelca.
Postopek izdelave pa smo vseeno izpeljali in tako pripravili stekelca za naslednjo skupino.
Stekelca smo najprej pol ure namakali v detergentu Kemex, ki stekelca dezifincira in
ov cisti. Naslednje pol ure smo jih spirali pod tekov co vodo in tako izprali vse ostanke
Kemexa. Pripravo smo nadaljevali s spiranjem v destilirani vodi in sicer dvakrat po
5 minut. Tako smo odstranili tudi vse ione in nev cistov ce, ki bi lahko ovirale nadaljne
postopek priprave preparatov. Tako pripravljena stekelca smo namov cili v raztopini
Poly-L-Lysine in nato suk sili na sobni temperaturi. Stekelca morajo biti pred nanak sanjem
vzorcev suk sena vsaj 2 uri.
2.2 METODE DIFERENCIALNIH BARVANJ
2.2.1 Barvanje s sudan v crno B
Vzorce, ki jih nameravamo uporabiti za barvanje je potrebno takoj po odvzemu fiksirati,
da preprev cimo razgradnjo biolok skih struktur. Nak si vzorci so bili v ze predhodno fiksirani

4
s formalinom. Pred delom je potrebno iz vzorca sprati fiksativ in ga dehidrirati,
da prisotnost vode ne moti postopka vklapljanja. Za dehidracijo nak sih vzorcev smo
uporabili nasiv ceno saharozo (2.3 M). Vzorce smo vklopili v komercialni zmrzovalni medij
tako, da smo iz aluminijaste folije oblikovali k skatlice, dno k skatlic prelili z vklopnim
medijem, v k skatlico dodali vzorec in nato vzorec prelili do vrha k skatlice z vklopnim
medijem. Tako prelite vzorce smo zamrznili in nato razrezali s kriotomom na 25 -- 30
mu m debele rezine.
Sudan v crno B je lizokromatsko barvilo, ki se uporablja za barvanje lipidov. Na vajah
smo barvali zamrznjene vzorce in hkrati pripravili tudi kontrolo. Kontrolna stekelca
z vzorci smo 1 uro namakali v mek sanici kloroforma in metanola ter jih nato sprali z
destilirano vodo. Na tak nav cin smo iz vzorcev odstranili vse lipide, nato pa postopek
nadaljevali po protokolu barvanja s sudan v crno B (Frederiks, 1977).
Protokol za barvanje s sudan v crno B se priv cne s spiranjem v 70 % alkoholu. Po spiranju
nadaljujemo z barvanjem v barvilu sudan v crno B. v Cas barvanja za optimalne rezultate
je tev zko dolov citi v naprej, zato se vzorce obiv cajno vodi v vev cih hkratnih serijah skozi
razliv cno trajanje namakanja v barvilu in rezultat sproti preverja. Na vajah smo jih
barvali 10 minut. Po barvanju smo odvev cno barvo sprali v 70 % etanolu in nadaljevali
s kontrastnim barvanjem v eozinu (Frederiks, 1977).
Barvanje z eozinom je kontrastno, saj eozin nespecifiv cno obarva citoplazmo in kolagen.
Tako so lipidna zrna obarvana s sudan v crno B lav zje vidna. Barvanje v eozinu traja 30
sekund, nakar ponovno speremo odvev cno barvo (Fischer et al., 2008).
Po konv canem barvanju vzorec prelijemo z v zelatino in prekrijemo s krovnim stekelcem.
Tako pripravljene vzorce lahko hranimo v hladilniku 30 dni.
2.2.2 Barvanje z DAPI
DAPI je barvanje, ki se specifiv cno vev ze na nukleinske kisline (A-T regije). Vzorec smo
prispevali sami in sicer z brisom ustne sluznice. Bris smo razmazali preko objektnega
stekelca. Nato smo na razmaz dodali kapljico DAPI in prekrili tako pripravljen preparat
s krovnim stekelcem. Ker je DAPI na svetlobi neobstojno barvilo, smo vzorce do
opazovanja zak sv citili pred svetlobo z ovojem aluminijaste folije. Vzorec smo opazovali
pod fluorescenv cnim mikroskopom (Chazotte, 2011).
2.2.3 Barvanje s hematoksilin-eozin
Vzorci, ki smo jih uporabili za barvanje s hematoksilin-eozinom so bili vklopljeni v
parafin. Vzorce smo tako rezali na mikrotomu in ne na kriotomu. Preizkuk sali smo

5
razliv cne debeline, a se je izkazalo, da je za nak sa barvanja bila najbolj ustrezna debelina
reza 7 mu m. Na posamezno objektno stekelce smo dali vev c rezin, tako da smo objektno
stekelce prekrili s kapljico vode, rezane rezine prenesli na kapljice, celotna objektna
stekelca pa nato na termo plok sv ce. Ob povik sani temperaturi se je parafin stalil in raztegnil
rezine, prav tako je izhlapel del vode. Preostanek vode smo odstranili z laboratorijskimi
robv cki, nato pa odstranili k se ostanke parafina in rehidrirali vzorec skozi alkoholno vrsto
od absolutnega etanola do 70 % etanola in vode.
Za prvi del barvanja smo uporabili Weigertov v zelezov hematoksilin in tako obarvali
jedra. Odvev cno barvilo smo po protokolu sprali z navadno vodo, razbarvali presev zek
obarvanja s solno kislim alkoholom in nazadnje sprali k se z destilirano vodo (Fischer
et al., 2008).
V drugem delu barvanja smo kontrast dosegli z 10 minutnim barvanjem v eozinu.
Po spiranju odvev cne barve z vodo, smo vzorce ponovno dehidrirali v narak sv cajov ci
dehidracijski etanolni vrsti. Po dehidraciji smo jih zbistrili s pripravkom ultraclear in
jih nato trajno fiksirali s smolo in krovnikom (Fischer et al., 2008).
2.2.4 Barvanje s trikromatskim barvanjem po Massonu
Prvi del trikromatskega barvanja po Massonu je enak prvemu delu barvanja s hematoksilin-
eozinom. Po barvanju s hematoksilinom smo barvanje 5 minut nadaljevali v kislem
fuksinu, ki plazmo obarva rdev ce. Po 5 minutah barvanja smo odvev cno barvo sprali z
vodo in vzorce za 5 minut prestavili v fosfomolibdensko kislino. Po 5 minutah smo
vzorce brez spiranja prenesli za 2 do 5 minut v metil modro, ki obarva vlakna. Po
barvanju z metil modrim smo vzorce sprali v destilirani vodi in jih prenesli za 2 minuti v
1 % ocetno kislino. Tudi zakljuv cek protokola trikromatskega barvanja je enak zakljuv cku
protokola barvanja s hematoksilin-eozinom -- dehidracija, zbistritev z ultraclear, trajno
fiksiranje s smolo in krovnikom (Foot, 1933).

6
3 REZULTATI
3.1 SUDAN v CRNO B
Slika 3.1: Jetra goveda (Bos taurus) -- KONTROLA | Strukture: A - septum, B - hepatocite, C -
sinusoide.

7
Slika 3.2: Jetra goveda (Bos taurus) -- SUDAN v CRNO B | Strukture: A - lipidne kaplje, B - hepatocite,
C - sinusoide.

8
Slika 3.3: Mik sica lososa (Salmo salar) -- KONTROLA | Strukture: A - mik siv cne fibrile.

9
Slika 3.4: Mik sica lososa (Salmo salar) -- SUDAN v CRNO B | Strukture: A - mik siv cne fibrile, B - lipidne
zaloge v mik sici.

10
3.2 DAPI

11
Slika 3.5: Mik sica lososa (Salmo salar) -- DAPI | A) Tkivo lososa v vidni svetlobi, tehnika DIC,
B) Fluorescenca DAPI v fluorescenv cni mikroskopiji, C) Rav cunalnik sko zdruv zeni sliki DIC in DAPI,
Strukture: 1 - mik siv cne fibrile, 2 - koncentrirana DNA (jedra).

12
Slika 3.6: Celice epitela v clovek ske (Homo sapiens sapiens) ustne sluznice I -- DAPI | A) Celice ustne
sluznice v vidni svetlobi, tehnika DIC, B) Fluorescenca DAPI v fluorescenv cni mikroskopiji, C) Ra-
v cunalnik sko zdruv zeni sliki DIC in DAPI, Strukture: 1 - celice ustne sluznice, 2 - koncentrirana DNA
(jedra).

13
Slika 3.7: Celice epitela v clovek ske (Homo sapiens sapiens) ustne sluznice II -- DAPI | A) Celice
ustne sluznice v vidni svetlobi, tehnika DIC, B) Fluorescenca DAPI v fluorescenv cni mikroskopiji, C)
Rav cunalnik sko zdruv zeni sliki DIC in DAPI, Strukture: 1 - vev cji kos tkiva ustne sluznice, 2 - koncentrirana
DNA (jedra).

14
3.3 HEMATOKSILIN-EOZIN
Slika 3.8: v Crevo prak siv ca (Sus scrofa domestica) -- HEMATOKSILIN-EOZIN | Strukture: A - mikrovili
prerezani v razliv cnih pozicijah.

15
Slika 3.9: v Crevo prak siv ca (Sus scrofa domestica) -- HEMATOKSILIN-EOZIN | Bazalna stran v crevesa,
strukture: A - v zila, B - krov zne mik sice, C - longitudinalne mik sice.

16
Slika 3.10: v Crevo prak siv ca (Sus scrofa domestica) -- HEMATOKSILIN-EOZIN | Strukture: A - krov zne
mik sice, B - v zila.

17
Slika 3.11: v Crevo prak siv ca (Sus scrofa domestica) -- HEMATOKSILIN-EOZIN | Strukture: A - limfativ cni
vozli, B - mik sice, C - ls temno obarvanimi jedri.

18
Slika 3.12: Rep podgane (Rattus sp.) -- HEMATOKSILIN-EOZIN | Strukture: A - dlaka, B - lojna
v zleza ob dlaki, C - dermis, D - epidermis, E - podkov zje.

19
Slika 3.13: Kov za mov cerila (Proteus anguinus) -- HEMATOKSILIN-EOZIN | Strukture: A - epidermis
(stratum corneum !?), B - dermis, C - v zile (C2 - korenine dlak !?), D - kompaktni dermis (hipodermis
!?), E - v zleza, F - izvodilo v zleze (dlake !?).

20
3.4 TRIKROMO BARVANJE PO MASSONU
Slika 3.14: Kov za mov cerila (Proteus anguinus) -- TRIKROMO BARVANJE PO MASSONU | Strukture:
neuporaben preparat zaradi artefaktov, ki so verjetno nastali v ze pri rezanju zaradi prenizke temperature.

21
Slika 3.15: Rep podgane (Rattus sp.) -- TRIKROMO BARVANJE PO MASSONU | Strukture: A -
dlaka, B - stratum corneum, C - epidermis, D - dermis.

22
obmov cje epidermisa, B - stratum corneum, C - stratum granulosum, D - dlaka, E - v zleza ob dlaki, F -
dermis.

23
epidermis, B - dlake, C - del mik sice najev zevalke, D - dermis.

24
v zila, B - dermis.

25
4 DISKUSIJA
Vsa barvanja so bila uspek sna in so znav cilno obarvala strukture. Pri barvanju s sudan
v crno B so lepo vidni temno obarvani lipidi (slika 3.2) in svetlo rdev ce/roza obarvana
citoplazma, kar je posledica kontrastnega barvanja z eozinom. Pri kontroli, iz katere
smo pred barvanjem izprali lipide, je citoplazma k se vedno obarvana znav cilno za eozin,
temno obarvane pike lipidov pa so odsotne, kar dokazuje, da sudan v crno B specifiv cno
barva le lipide (slika 3.1). Pri drugem vzorcu, tkivo lososa, ki smo ga pripravili po
enakem postopku se rezultati ponovijo. Kontrolni vorec prereza mik siv cnih fibril lososa, ki
je imel pred barvanje izprane lipide, je obarvan le za eozin znav cilno rov znato (slika 3.3),
na neizpranem vzorcu pa je prisotnost lipidov k se bolj ov citna (slika 3.4). Primerjalno
med obema vzorcema lahko vidimo tudi, da meso lososa vsebuje precej vev c mak sv cob, kot
jih goveja jetra. To niti ni presenetljivo, saj je velika vsebnost mak sv cob v mesu lososa
obiv cajna (Folkestad et al., 2008).
Pri barvanju hematoksilin-eozin, prvi znav cilno temno obarva jedra in drugi svetlo
rov znato citoplazmo, kolagen in mik sice. Na vseh uspelih vzorcih prevladuje rov znata
barva. Zelo neznav cilen je bil vzorec kov ze mov cerila (Proteus anguinus). Ob pregledu
vzorca smo pogrek sali znav cilno vev cplastno povrhnjico, velike in izrav zene mukozne v zleze
. . . Prav tako bi lahko dolov cene strukture vidne na sliki 3.13 predstavljale tkiva, ki jih
dvov zivke nimajo (A - stratum corneum, C2 - korenine dlak . . . ). Najverjetneje je pri
pripravi vzorcev prik slo do napake pri oznav cevanju in smo kot kov za mov cerila oznav cili
vzorec, ki to ni bil (Istenic in Bulog, 1984).
Tev zave z vzorcem kov ze mov cerila so se nadaljevale tudi pri trikromem barvanju po
Massonu. Priprava vzorca nam v zal ni uspela (slika 3.14). Vzorec je poln artefaktov, ki
so skoraj zagotovo nastali v ze med rezanjem na kriotomu. Pri rezanju je bil vzorec izredno
krhek in drobljiv in je v ze med samim rezom razpadal na drobne kok sv cke. Problemativ cna
je bila verjetno prenizka temperatura, saj so bili vzorci svev ze zamrznjeni in zaradi tega
verjetno prevev c trdi in krhki. Tev zavo smo poskuk sali rek siti z dvigom temperature v
kriotomu in vev canjem debeline rezine, a zaradi pomanjkanja v casa nismo mogli pov cakati,
da bi se vzorec povsem aklimatiziral.
Zelo zanimiva je primerjava dveh razliv cnih barvanj istega vzorca, ki je bil v nak sem
primeru rep podgane (Rattus sp.). v Ce primerjamo trikromo barvanje po Massonu (slike
3.15, 3.16, 3.17 in 3.18) s hematoksilin-eozin barvanjem (slika 3.12) je razvidno, da je
trikromo barvanje bolj nazorno in da barvno lov ci vev c razliv cnih tkiv. Npr. trikromo
barvanje obarva dermis modro pri hematoksilin-eozin pa je skoraj celotni preparat,
vkljuv cno z dermisom, svetlo rov znat.

26
LITERATURA
Chazotte B. 2011. Labeling nuclear DNA using DAPI. Cold Spring Harbor protocols
2011: pdb.prot5556 ISSN 1559-6095 doi:10.1101/pdb.prot5556
Chopra A., Shan L., Eckelman W. C., Leung K., Latterner M., Bryant S. H., Menkens
A. 2012. Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD): Evolution and
Progress. doi:10.1007/s11307-011-0521-3
Fischer A. H., Jacobson K. A., Rose J., Zeller R. 2008. Hematoxylin and eosin staining
of tissue and cell sections. CSH protocols 2008: pdb.prot4986 ISSN 1559-6095 doi:
10.1101/pdb.prot4986
Folkestad A., Wold J. P., Ro rvik K. A., Tschudi J., Haugholt K. H., Kolstad K., Mo rko re
T. 2008. Rapid and non-invasive measurements of fat and pigment concentrations
in live and slaughtered Atlantic salmon (Salmo salar L.). Aquaculture 280: 129--135
ISSN 00448486 doi:10.1016/j.aquaculture.2008.04.037
Foot N. C. 1933. The Masson Trichrome Staining Methods in Routine Laboratory Use.
doi:10.3109/10520293309116112
Frederiks W. M. 1977. Some aspects of the value of Sudan Black B in lipid histochemistry.
Histochemistry 54: 27--37 ISSN 0301-5564 doi:10.1007/BF00493326
Istenic L., Bulog B. 1984. Some evidence for the ampullary organs in the European
cave salamander Proteus anguinus (Urodela, Amphibia). Cell and tissue research 235:
393--402 ISSN 0302-766X
u Znidark siv c N. 2014. Lokalizacija celiv cnih struktur v biolok skih vzorcih z mikroskopskimi
tehnikami in diferencialno barvanje tkiv -- navodila za vajo Lokalizacija izbranih
komponent v biolok skem vzorcu

LOKALIZACIJA CELIČNIH STRUKTUR V BIOLOŠKIH VZORCIH Z MIKROSKOPSKIMI TEHNIKAMI IN DIFERENCIALNO BARVANJE TKIV

Recommended

Recommended

More Related Content

More from Nejc Draganjec

More from Nejc Draganjec (12)

LOKALIZACIJA CELIČNIH STRUKTUR V BIOLOŠKIH VZORCIH Z MIKROSKOPSKIMI TEHNIKAMI IN DIFERENCIALNO BARVANJE TKIV