Uploaded byMohammed Bahgat Mohammed Sofyan
DNA & RNA extraction
The document discusses DNA and RNA extraction procedures. It begins by describing how to extract DNA from a 200 microliter whole blood sample by adding 20 microliters of proteinase K to lyse cells, then 400 microliters of lysis solution. The mixture is incubated at 56°C for 10 minutes to lyse cellular proteins and membranes. Ethanol is then added to precipitate the DNA, which is purified using a spin column. The final DNA sample is stored at -20°C or -80°C. RNA extraction follows similar steps but uses enzymes that degrade RNA instead of DNA. The document also discusses reasons for extracting RNA such as detecting RNA viruses or measuring gene expression.
DNA & RNA extraction
- 1. DNA,RNA extraction BY dr: Mohammed BahgatMohammed Sofyan Assistant lecturer of medical biochemistry, Faculty of medicine, Al-Azhar university (Assiut branch) 1
- 2.
- 3.
- 4. صورة كل علىاضغط الشاش عرض وضع في ة قنواتنا على وادعمنا اإلنترنت على
- 5. على ملفي فيهنا أرفعها التي شرائحي ومذاكرة بالتعلم وأسعد وأرحب أسمح Slide share website وال مانع أيضا من نسخ شريحة او اثنين عند الضرورة ، وال مانع من شرح البورب وينت الخاصة بي للغير بشرط عدم إزالة اسمي من البوربوينت ، فال أسمح أبدا بإزال ة اسمي من على الباوربوينت ووضع اسمك بدال منه لتصبح وكأنك من صممتها فهذه سرقة ال أسمح بها وتضييع لحق من تعب في عملها . وفقكم هللا وإياي للتعلم ونفع اآلخرين I allow, welcome, and be happy to learn and study my slides that I upload here in my profile on Slide share website There is also no objection to copying one or two slides when necessary, and there is no objection to explaining my PowerPoint to others on the condition that my name is not removed from the PowerPoint. I never allow my name to be removed from PowerPoint and to replace it with yours, Make it look like you designed it. This is theft that I do not allow and a waste of the right of those who are tired in this work. May God bless you and me for learning and benefiting others 5
- 6. 1- Cell membraneand nuclear membrane lysing. 2- Protein removal. 3- RNA degradation. 4- DNA precipitation. 5-Concentration and purity measuring. 4
- 7. DNA extraction بسم هللا الرحمن الرحيم هتكلم اليوم إن شاء هللا عن DNA extraction بنجيب عينة الدم 200micron of whole blood ونحط عليه 20 micron proteinase K ده هيكسر كل بروتينات الخاليا 7
- 8. DNA extraction نعمل mix byvortex ثم نضع عليه 400 micron cell lysis solution هيكسر ال cell membrane وغيره نعمل mix by vortex نترك هذا الخليط 10 دقائق في درجة حرارة 56 يبقي كده كسرت البروتينات الموجودة داخل الخلية وك سرت جدار الخاليا بعد ذلك نضع 200 micron Ethanol to precipitate DNA DNA extraction 8
- 9. بعد ذلك ننقل هذا الخليط في spin column ونعمل centrifugation بمعدل 7000 rpm لمدة دقيقة كل البروتينات والدهون وأي شيء غير ال DNA هيتصفي في األنبوبة أسفل ال spincolumn وال DNA هيمسك في silica اللي داخل ال spin column يبقي كده تخلصنا من كل شيء باستثناء ال DNA واشياء صغيرة عالقة به ونرمي ما جمع في tube التي باألسفل DNA extraction 9
- 10. DNA extraction نضع ذلكبعد • 500 micron of wash I بال عالق أي نشيل علشان DNA ونعمل centrifugation بمعدل 8000 rpm في جمع ما ونرمي دقيقة لمدة tube نضع ذلك بعد • 500 micron of wash II بال عالق أي نشيل علشان DNA ونعمل centrifugation بمعدل 20000 rpm لمدة 3 في جمع ما ونرمي دقائق tube ال أن من للتأكد دي الخطوة نكرر ممكن silica شيء أي تحمل تعد لم ال سوي DNA 10
- 11. DNA extraction بعد ذلك نضع 200 micronof ellution فى منتصف األنبوبة لكي يمتز ا ل DNA اللي موجود علي silica وينزل في ال tube التي باألسفل ونعمل centrifugation بمعدل 10000 rpm لمدة دقيقتين هينزل في أسفل األنبوبة ال DNA أحتفظ بيه عند درجة - 20 لمدة شهور ودرجة - 80 لمدة سنين لحين استخدامه . 11
- 12. بعد كده علشان نتأكد من إن Purity of DNA بنقيس ال absorptionin wl 260 and 280 by nanodrop ونقسمهم علي بعض لو طلع بين 1.8 - 2.1 يبقي كده احنا ماشيين صح . وممكن نشوف احنا ماشيين صح وال غلط عن طريق ال electrophoresis أالقي sharp band في مكان انا متوقعه ومفيش أي bands أخري nonspecific كده أعرف اني ماشي صح . وممكن نفيس ال concentration of DNA 12
- 13.
- 14. DNA analysis byagarose gel electrophoresis. 14
- 15. RNA extraction 1 _ ال خطوتيلعمل داعي فال السيروم في فيروس بفصل أنا لو طب Proteinase K and cell lysis . ٢ _ أفصل عاوز لو طبعا RNA أحط ما بدل بس الكالم نفس هو RNAs ال يكسر RNA أحط DNAs ال يكسر DNA وال RNA هو كما يظل . ٣ _ بستخلص أنا لو RNA منه أجيب هضطر cDNA ال جهاز ألن PCR ال علي إال يعمل ال DNA يسمي مشهور بإنزيم وذلك Reverse Transcriptase If RNA is extracted, a reverse transcription step is required to form cDNA before amplification of DNA by PCR is possible. 15
- 16. RNA extraction ال بستخلصوليه امتي طب المهم السؤال RNA ؟ حالتين في : 1- detection of RNA viruses as HCV,HIV 2- detect gene expression ل اترجم الجين اشوف عاوز يعني mRNA بروتين وهيطلع شغال ومش موجود هوه وال ،ويشتغل Not expressed. 16
- 17. DNA,RNA extraction • 20µL proteinase K to 200 µl whole blood, Mix by vortex • Add 400 µL of lysis solution , mix by vortex to obtain uniform suspension incubate at 56 for 10 min • Add 200µl of ethanol (96-100%) and mix. • Transfere the prepared mixture to spin column . Centrifuge for 1 min at 8000 rpm. • Discard the collection tube containing the flow throw solution • Place column into a new 2 ml collection tube • Add 500 µl of wash buffer I and centrifuge for 1 min at 8000 rpm Discard the collection tube containing the flow throw solution place the column back into the collection tube • Add 500 µl of wash buffer II and centrifuge for 3 min at 14 000 rpm Discard the collection tube containing the flow throw solution place the column back into the collection tube. 17
- 18. DNA,RNA extraction • Emptythe collection tube . Place the purification column back into the tube and re-spin the column for one min at maximum speed <14.000 rpm Discard the collection tube containing the flow throw solution • Place column into a new 1.5 ml collection tube • Add 200 µl of elution buffer to center of the column membrane to elute genomic DNA . Incubate 2 min at room temperature and centrifuge for I min at 10.000 rpm • Discard the prification column to be used immediately or stored at -20. 18
- 19.
- 20. REFERENCES : • _https://labtestsonline.org • _ https://www.medscape.com • _ https://www.wikipedia.org • _ https ps://www.labcorp.com • _ https://www.uptodate.com • _ https://www.ncbi.nlm.nih.gov Home - PubMed – NCBI • _TIETZ TEXTBOOK OF CLINICAL CHEMISTRY AND MOLECULAR DIAGNOSTICS, SIXTH EDITION 2018. • _Essential of clinical pathology book; 1st edition; Shirish M Kawthalkar; 2010. • _Essential of biochemistry book ;1st edition; 2012. • _ ABC of clinical hematology ; 4th edition ; Drew Provan; 2018. • _ Harper's illustrated biochemistry 30th edition 2015. • _ Lippincott's illustrated review of biochemistry sixth edition 2014. • _ Lecturea Notes Clinical Biochemistry, 9th Edition Walker, Simon, 2103. • _Some audios and videos from Well-known, trusted professors who study from accredited books. 20
- 21. اليوتيوب علي البحثأو ،اليوتيوب علي قناتي دي د باسم . سفيان بهجت محمد ، وتشتركو تتابعوني ياريت حتى بالقناة ا هللا شاء إن نستمر https://www.youtube.com/channel/UCaYs1d8s0ntZvteHS3mMmGA ب الفيس في البحث أو ،انضمامكم يشرفنا الفيسبوك علي بتاعتي الصفحة دي DMBMS2018 ، حتى تتابعوني ياريت هللا شاء إن نستمر https://www.facebook.com/DMBMS2018/ باسم التلجرام علي قناتي ودي ِ للناس أنفعهم الناس خير 📚 هللا شاء إن نستمر حتى تتابعوني ِريتاي https://t.me/DMBMS2020 على بروفايلي لينكيدإن وتعملولي تتابعوني ياريت endorsement مهاراتي على https://www.linkedin.com/in/mohammed-bahgat-sofyan-8ba012142/ موقع على بروفايلي وده SlideShare تتابعونا ياريت https://www.slideshare.net/MohammedBahgatMohamm1 وده بروفايلي الشخصي الفيسبوك علي https://www.facebook.com/mohammed.bahgat.165 الفيسبوك على بنا الخاص اللوجوا وده # دمحمد _ بهجت _ سفيان _ medical_biochimestry 21
- 22. OUR PAGES, CHANNELS AND GROUPSON THE INTERNET ونستفي عليهم البوستات كل نضع هللا شاء ان جميعا د انضمامكم يشرفنا وطبعا • إن شاء هللا يادكاترة الصفحة دي والقناة دي هتفيدكم ،جدا مهتمية بالتحاليل الطبية هتف يد كل التخصصات الطبية ان شاء هللا وعليها برده بوستات دينية وأدبية يارب ينفع بيها ي ارب ويجعلها خالصة لوجهه . https://www.youtube.com/channel/UCaYs1d8s0ntZvteHS3mMmGA • د باسم اليوتيوب علي البحث أو ،اليوتيوب علي قناتي . سفيان بهجت محمد . • https://www.facebook.com/DMBMS2018/ • ب الفيس في البحث أو ،انضمامكم يشرفنا الفيسبوك علي بتاعتي الصفحة دي DMBMS2018 • https://t.me/DMBMS2020 • للناس أنفعهم الناس خير باسم التلجرام علي قناتي ودي 📚 • الدخو يرجي جروبين ،للناس أنفعهم الناس خير باسم الواتس علي بي الخاص الجروب وده علي ل واحد المحتوي ألن فقط واحد • https://chat.whatsapp.com/9vsZpHhVScfAe43xm8vBzm • https://chat.whatsapp.com/DPtwIYJlBJo4cTZnZ0OPir • الفيسبوك علي الشخصي بروفايلي وده • https://www.facebook.com/mohammed.bahgat.165 . • الفيسبوك على بنا الخاص اللوجوا وده # دمحمد _ بهجت _ سفيان _ medical_biochimestry 22
- 23. T H AN K Y O U M E E T O N T H E B E S T L A T E R , G O D W I L L I N G 23