Analytical chemistry HPLC

1. 1

2. ‫قدس‬ ‫شهر‬ ‫واحد‬ ‫اسالمی‬ ‫آزاد‬ ‫دانشگاه‬
‫موضوع‬:HPLC
‫آورنده‬ ‫گرد‬:‫کاوه‬ ‫سارا‬
‫مربوطه‬ ‫استاد‬:‫فلکی‬ ‫دکتر‬ ‫خانم‬
‫درس‬:‫پیشرفته‬ ‫تجزیه‬ ‫شیمی‬
‫پاییز‬95
2

3. ‫کروماتوگرافی‬ ‫تاریخچه‬
3

4. ‫کروماتوگر‬‫ا‬‫فی‬
4

5. ‫متحرک‬ ‫فاز‬ ‫و‬ ‫ساکن‬ ‫فاز‬
‫مورد‬ ‫در‬‫قطبیت‬‫های‬‫فاز‬‫یک‬ ‫متحرک‬ ‫و‬ ‫ساکن‬
‫دارد‬ ‫وجود‬ ‫کلی‬ ‫قاعده‬.،‫قاعده‬ ‫این‬ ‫طبق‬
‫قطبیت‬‫نزدیک‬ ‫باید‬ ‫متحرک‬ ‫فاز‬ ‫و‬ ‫شونده‬ ‫حل‬
‫داشته‬ ‫اختالف‬ ‫ساکن‬ ‫فاز‬ ‫با‬ ‫ولی‬ ،‫باشد‬ ‫هم‬ ‫به‬
‫باشد‬.
‫آنالیت‬‫شود‬ ‫حل‬ ‫متحرک‬ ‫فاز‬ ‫در‬ ‫بتواند‬ ‫باید‬
‫لحاظ‬ ‫از‬ ‫ولی‬ ،‫قطبیت‬‫ستون‬ ‫با‬ ‫باید‬
5

6. ‫باال‬ ‫کارایی‬ ‫با‬ ‫مایع‬ ‫کروماتوگرافی‬
HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY
(HPLC)
6

7. HPLC
‫کروماتوگرافی‬‫مایع‬‫با‬‫کارایی‬‫باال‬‫یکی‬‫از‬
‫پرکاربردترین‬‫های‬‫روش‬‫کروماتوگرافی‬‫است‬.‫فرآیند‬
‫کروماتوگرافی‬‫عنوان‬‫به‬‫یک‬‫روش‬‫جداسازی‬‫که‬‫شامل‬
‫انتقال‬‫جرم‬‫بین‬‫یک‬‫فاز‬‫ساکن‬‫و‬‫یک‬‫فاز‬‫متحرک‬
،‫است‬‫تعریف‬‫شود‬‫می‬.‫روش‬HPLC‫با‬‫گیری‬‫بهره‬‫از‬‫یک‬
‫فاز‬‫متحرک‬،‫مایع‬‫ترکیبات‬‫یک‬‫مخلوط‬‫را‬‫روی‬‫فاز‬
‫ساکن‬‫جدا‬‫کند‬‫می‬.‫فاز‬‫ساکن‬‫تواند‬‫می‬‫مایع‬‫یا‬‫جامد‬
‫باشد‬.‫ترکیبات‬‫ابتدا‬‫در‬‫یک‬‫حالل‬‫حل‬‫شوند‬‫می‬.‫سپس‬
‫درون‬‫یک‬‫ستون‬‫کروماتوگرافی‬‫تحت‬‫فشار‬‫باال‬‫جریان‬
‫یابند‬‫می‬.‫در‬،‫ستون‬‫ترکیبات‬‫مخلوط‬‫از‬‫هم‬‫جدا‬
7

8. ‫در‬ ‫متحرک‬ ‫فاز‬ ‫خصوصیات‬HPLC
•‫باال‬ ‫خلوص‬
•‫ستون‬ ‫از‬ ‫باالتر‬ ‫جوش‬ ‫نقطه‬
•‫کم‬ ‫پذیری‬ ‫واکنش‬
•‫ساز‬ ‫آشکار‬ ‫با‬ ‫تطابق‬ ‫قابلیت‬
8

9. CHROMATO-GRAPHY / -GRAPH / -GRAM /
-GRAPHER
9

10. ‫های‬ ‫حالت‬‫کروماتوگرافی‬
Modes of Chromatography
‫فاز‬‫نرمال‬
–‫فاز‬‫ساکن‬‫قطبی‬‫و‬‫حالل‬‫غیر‬‫قطبی‬
‫فاز‬‫معکوس‬
–‫فاز‬‫ساکن‬‫غیر‬‫قطبی‬‫و‬‫حالل‬‫های‬‫قطبی‬‫است‬
10

11. ‫نرمال‬ ‫فاز‬ ‫کروماتوگرافی‬
‫در‬‫کروماتوگرافی‬‫فاز‬‫نرمال‬‫تفاوت‬‫قدرت‬
‫برهم‬‫کنش‬‫های‬‫قطبی‬‫آنالیت‬‫ها‬‫در‬‫یک‬‫مخلوط‬
‫با‬‫فاز‬‫ساکن‬‫معیار‬‫جداسازی‬‫است‬.
‫مواد‬‫پرکننده‬‫ستون‬‫رایج‬‫در‬‫کروماتوگرافی‬
‫فاز‬،‫نرمال‬‫اکسیدهای‬‫متخلخلی‬‫مانند‬
‫سیلیکا‬‫و‬‫یا‬‫آلومینا‬‫هستند‬.
11

12. ‫معکوس‬ ‫فاز‬ ‫کروماتوگرافی‬
‫بر‬‫خالف‬‫کروماتوگرافی‬‫فاز‬،‫نرمال‬‫در‬
‫کروماتوگرافی‬‫فاز‬‫معکوس‬‫برهم‬‫کنش‬‫های‬
‫واندروالس‬‫یا‬‫آب‬‫گریز‬‫نیروهای‬‫عمده‬
‫هستند‬.
‫بیشتر‬‫مواد‬‫پرکننده‬‫ستون‬‫که‬‫در‬
‫کروماتوگرافی‬‫فاز‬‫معکوس‬‫استفاده‬‫می‬،‫شوند‬
‫سیلیکاهای‬‫متخلخل‬‫اصالح‬‫شده‬‫شیمیایی‬
‫هستند‬.
12

13. Reversed Phase Chromatography
 Stationary phase: Low polarity
Octadecyl group-bonded silical gel (ODS)
 Mobile phase: High polarity
Water, methanol, acetonitrile
Salt is sometimes added.
13

14. Common Reverse Phase Solvents
•Methanol CH3OH
•Acetonitrile CH3CN
•Tetrahydrofuran
• Water H2O
14
O

15. ‫مختلف‬ ‫قسمتهای‬ ‫و‬ ‫اجزاء‬
‫دستگاه‬HPLC
•‫مخازن‬‫حالل‬Solvents
•‫موتور‬‫یا‬‫پمپ‬Pumps
•‫تزریق‬‫کننده‬Injector
•‫ستون‬Column
•‫آشکارساز‬Detectors
15

16. ‫دستگاه‬HPLC
‫دستگاه‬HPLC‫دارای‬‫یک‬‫پمپ‬‫تزریق‬،‫کننده‬،‫ستون‬HPLC‫دستگاه‬
‫آشکارساز‬‫و‬‫سیستم‬‫داده‬‫ها‬‫است‬.‫قلب‬،‫دستگاه‬‫ستون‬‫آن‬‫است؛‬
‫جایی‬‫که‬‫جداسازی‬‫اتفاق‬‫می‬‫افتد‬.‫برای‬‫عبور‬‫فاز‬‫متحرک‬‫از‬
‫میان‬‫ذره‬‫های‬‫متخلخل‬‫میکرومتری‬‫فاز‬‫ساکن‬،‫ستون‬‫یک‬‫پمپ‬‫با‬
‫فشار‬‫باال‬‫الزم‬‫است‬.‫فرآیند‬‫کروماتوگرافی‬‫با‬‫تزریق‬‫محلول‬‫به‬
‫ابتدای‬‫ستون‬‫شروع‬‫می‬‫شود‬.‫جداسازی‬‫ترکیبات‬‫زمانی‬‫اتفاق‬‫می‬
‫افتد‬‫که‬‫مادة‬‫مورد‬‫تجزیه‬‫و‬‫فاز‬‫متحرک‬‫به‬‫داخل‬‫ستون‬‫پمپ‬
‫شوند‬.‫سرانجام‬‫هر‬‫ترکیب‬‫که‬‫درون‬‫ستون‬‫شسته‬‫می‬،‫شود‬‫به‬‫صورت‬
‫یک‬‫پیک‬‫روی‬‫آشکارساز‬‫ظاهر‬‫می‬‫شود‬.‫تشخیص‬‫ترکیبات‬‫شسته‬‫شده‬
16

17. ‫حالل‬ ‫مخازن‬:
‫شستشو‬ ‫حاللهای‬ ‫یا‬ ‫و‬ ‫متحرک‬ ‫فاز‬
‫شده‬ ‫ریخته‬ ‫ستون‬ ‫دهنده‬‫است‬.
17

18. ‫ها‬ ‫حالل‬ ‫ویژگی‬
Solvents
‫ویسکوزیته‬‫پایین‬
‫عاری‬‫از‬‫ذرات‬‫و‬‫هوای‬‫محلول‬
18

19. ‫حالل‬ ‫سیستم‬ ‫انواع‬
Isocrating elution
‫در‬‫ایزوکراتیک‬‫ترکیب‬‫حالل‬‫ها‬‫در‬‫طول‬‫شویش‬‫ثابت‬‫است‬‫و‬
‫فقط‬‫یک‬‫پمپ‬‫کار‬‫می‬‫کند‬.
Gradient elution
‫در‬‫شویش‬‫گرادیانت‬(‫شویش‬‫شیبی‬)‫بیش‬‫از‬‫یک‬‫حالل‬
‫استفاده‬‫شده‬‫و‬‫ترکیب‬‫حالل‬‫ها‬‫مطابق‬‫برنامه‬‫شویش‬
‫در‬‫طول‬‫زمان‬‫آنالیز‬‫تغییر‬‫می‬‫کند‬
• 19

20. ‫یا‬ ‫موتور‬‫پمپ‬
Pumps
•‫انتقال‬‫حالل‬‫و‬‫همچنین‬‫نمونه‬‫در‬‫فضای‬‫نسبتا‬‫طویل‬
‫ستون‬‫نیاز‬‫به‬‫ایجاد‬‫فشاری‬‫در‬‫سیستم‬‫است‬(‫زیرا‬
‫سرعت‬‫جریان‬‫آهسته‬‫است‬)‫که‬‫برای‬‫ایجاد‬‫آن‬‫حداقل‬
‫از‬‫یک‬‫پمپ‬‫یا‬‫موتور‬‫استفاده‬‫می‬‫شود‬.
•‫کروماتوگراف‬‫با‬‫سرعت‬‫جریان‬،‫خاص‬‫در‬‫میلی‬‫لیتر‬
‫در‬‫هر‬‫دقیقه‬(‫میلی‬‫لیتر‬/‫دقیقه‬)‫بیان‬‫شده‬
•‫سرعت‬‫جریان‬(flow rate(‫فاز‬‫متحرک‬‫در‬HPLC‫در‬
‫محدوده‬1-‫تا‬2‫میلی‬‫لیتر‬/‫دقیقه‬‫می‬‫باشد‬.
•‫پمپ‬‫های‬‫معمولی‬‫می‬‫تواند‬‫فشار‬‫در‬‫محدوده‬
PSI6000-9000‫برسد‬.
20

21. ‫ها‬ ‫پمپ‬ ‫انواع‬
•‫پیستونی‬
•‫جابجایی‬‫یا‬‫سرنگی‬
•‫بادی‬
‫پمپ‬‫های‬‫پیستونی‬‫متدوالترند‬‫و‬‫مانند‬‫پمپهای‬‫سرنگی‬
‫مستقل‬‫از‬‫گرانروی‬‫حالل‬‫و‬‫افت‬‫فشار‬‫در‬‫ستون‬‫هستند‬
‫اما‬‫پمپهای‬‫بادی‬‫ساده‬‫و‬‫ارزان‬‫هستند‬‫و‬‫این‬‫عیب‬‫را‬
‫دارند‬‫که‬‫به‬‫ویسکوزیته‬‫حالل‬‫وابسته‬‫بوده‬‫و‬‫دارای‬
‫افت‬‫فشار‬‫در‬‫ستون‬‫می‬‫شوند‬‫بنابراین‬‫در‬‫شویش‬
‫گرادیانی‬‫نمی‬‫توان‬‫از‬‫پمپ‬‫بادی‬‫استفاده‬‫کرد‬.
21

22. ‫کننده‬ ‫تزریق‬(INJECTOR):
•‫دستی‬
•‫خودکار‬
22

23. 23

24. ‫ستون‬‫ها‬
Columns
‫به‬‫عنوان‬"‫قلب‬‫کروماتوگراف‬"‫فاز‬‫ثابت‬
‫ستون‬‫را‬‫ازاجزای‬‫نمونه‬‫با‬‫استفاده‬‫از‬
‫پارامترهای‬‫مختلف‬‫فیزیکی‬‫و‬‫شیمیایی‬‫جدا‬
‫می‬‫کند‬.‫کار‬‫این‬‫ستون‬‫نیز‬‫به‬‫اندازه‬‫ذرات‬
‫داخل‬‫ستون‬‫بستگی‬‫دارد‬.‫هرچه‬‫اندازه‬‫ذرات‬
‫تر‬‫کوچک‬،‫باشد‬‫کیفیت‬HPLC‫پیشتر‬‫شود‬‫می‬.
24

25. ‫آشکارساز‬
DETECTOR
‫شود‬ ‫می‬ ‫انتخاب‬ ‫آنالیت‬ ‫نوع‬ ‫اساس‬ ‫بر‬.
‫های‬ ‫ویژگی‬‫ساز‬ ‫آشکار‬
‫حساسیت‬‫باال‬
‫غیرتخریبی‬‫بودن‬(Nondestructive)‫روند‬ ‫طول‬ ‫در‬
‫نکند‬ ‫تخریب‬ ‫را‬ ‫نمونه‬ ‫شناسایی‬.
‫پاسخ‬‫وسیع‬ ‫دامنه‬ ‫در‬ ‫غلظت‬ ‫به‬ ‫خطی‬(‫سهولت‬ ‫برای‬
‫محاسبات‬ ‫در‬)
25

26. ‫ازآشکارسازهای‬ ‫تعدادی‬‫م‬‫رسوم‬
• Ultraviolet absorption (UV)
• Fluorescence
• Refractive Index (RI)
• Electrochemical (EC)
• Mass Spectrometric
26

27. ‫از‬ ‫حاصل‬ ‫اطالعات‬‫کروماتوگرام‬
‫کیفی‬:
‫تشخیص‬‫و‬‫شناسایی‬‫نوع‬‫ترکیبات‬
‫کمی‬:
‫تعیین‬‫کمی‬‫مقدار‬‫آنالیت‬
27

28. 28

29. ‫نمونه‬ ‫یک‬‫کروماتوگرام‬
29

30. ‫کاربردها‬:
•‫جداسازی‬،‫خالص‬‫سازی‬‫و‬‫شناسائی‬‫پروتئین‬‫ها‬‫و‬
‫ترکیبات‬‫آلی‬‫بویژه‬‫ترکیبات‬‫داروئی‬.‫همچنین‬‫در‬
‫برخی‬‫از‬‫آزمایش‬‫های‬‫مربوط‬‫به‬‫تعیین‬‫غلظت‬
‫داروها‬‫مورد‬‫استفاده‬‫قرار‬‫می‬‫گیرد‬
•‫در‬‫تحقیقات‬‫پروتومیک‬(‫تحقیقاتی‬‫که‬‫برروی‬
‫پروتئین‬‫ها‬‫انجام‬‫می‬‫شود‬)‫،آنالیز‬‫و‬‫هضم‬
‫پروتئین‬
•‫تعیین‬‫ساختار‬‫پلیمرها‬
•‫مقایسه‬‫ساختارهای‬‫پروتئین‬‫های‬‫مختلف‬
30

31. HPLC‫ترکیبات‬ ‫جداسازی‬ ‫برای‬ ‫بهینه‬
‫و‬ ‫شیمیایی‬‫بیولوژیکی‬
‫فرار‬ ‫غیر‬ ‫که‬‫هستند‬،‫دارد‬ ‫کاربرد‬ ‫ترکیبات‬‫غیر‬‫فرار‬‫معمول‬‫عبارتند‬‫از‬:
‫داروها‬‫مانند‬‫آسپرین‬،،‫ایبوپروفن‬‫یا‬
‫استامینوفن‬
‫نمک‬‫مانند‬‫کلرید‬‫سدیم‬‫و‬‫پتاسیم‬‫فسفات‬
‫پروتئین‬‫مانند‬‫تخم‬‫مرغ‬‫یا‬‫پروتئین‬‫خون‬
‫مواد‬‫شیمیایی‬‫آلی‬‫مانند‬‫پلیمرها‬(‫به‬‫عنوان‬
‫مثال‬‫پلی‬‫استایرن‬،‫پلی‬‫اتیلن‬)
‫هیدروکربن‬‫های‬‫سنگین‬‫مثل‬‫آسفالت‬‫و‬‫یا‬‫روغن‬
‫موتور‬
31

32. ‫مزیت‬‫های‬‫روش‬‫کروماتوگرافی‬HPLC
•‫اندازه‬‫گیری‬‫کمی‬‫ان‬‫دقیق‬‫است‬.
•‫هایی‬‫جداسازی‬‫را‬‫که‬‫به‬‫های‬‫روش‬‫دیگر‬‫خیلی‬‫مشکل‬
‫باشند‬‫می‬‫انجام‬‫داد‬.
•‫ی‬‫ک‬‫جداسازی‬‫مواد‬‫کروماتوگرافی‬‫تواند‬‫می‬‫در‬‫عرض‬
‫چند‬‫دقیقه‬‫یا‬‫چند‬‫ساعت‬‫انجام‬‫گیرد‬.
•‫تنها‬‫مقدار‬‫بسیار‬‫کمی‬‫از‬‫مخلوط‬‫برای‬‫تجزیه‬‫الزم‬
‫است‬.
•‫های‬‫روش‬‫کروماتوگرافی‬‫ساده‬‫سریع‬‫و‬‫وسایل‬‫مورد‬
‫لزوم‬‫آنها‬‫ارزان‬‫هستند‬.
•HPLC‫تکامل‬‫یافته‬‫ترین‬‫شکل‬
32

33. 33