1. Đề tài:
NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY XOAN TA
(MELIA AZEDARACH L.) THÔNG QUA PHÔI SOMA TỪ
THÂN MẦM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN
Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giang, Nông Văn Hải, Chu Hoàng Hà
BÁO CÁO MÔN
NUÔI CẤY MÔ VÀ CHỌN GIỐNG THỰC VẬT
GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thanh Hiền
Lớp: 10060302
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 7 tháng 4 năm 2014
SV thực hiện:
1) Nguyễn Triết Lãm - MSSV: 61003212
2) Nguyễn Hoàng Lưu Phúc - MSSV: 61003232
3) Bùi Đức Phúc - MSSV: 61103288
4) Tạ Thị Thùy Dung - MSSV: 61103246
2. Bảng đánh giá:
TT Thành phần Điểm
1 Nội dung
2 Hình thức trình bày slide
3 Thuyết trình
4 Trả lời câu hỏi
5 Teamwork
Tổng
3. Nội dung chính
Chương 1: Tổng Quan
Chương 2: QT
nhân giống phôi
soma
Chương 3: Kết
quả và thảo
luận
Phụ lục
4. Chương 1:
Tổng quan
- Đặc điểm cây Xoan Ta?
- Vùng phân bố?
- Ứng dụng của cây Xoan ta.
- Vì sao phải nhân giống cây
Xoan Ta?
6. 1. Giới thiệu:
• Coy Xoan Ta có nguồn gốc từ nam châu
Á.
• Ngoài việc sử dụng gỗ để trang trí dịch
chiết từ lá thân hoa quả có đặc tính như
thuốc trừ sâu .
• Dịch chiết từ lá có khả năng ức chế sự tái
bản của tế bào vi khuẩn, vius gây bệnh ở
người và động vật (virus Tacaribe gây
bệnh viêm não ở chuột).
8. 2. Phân bố & đặc điểm:
• Cây xoan ta phân bố chủ yếu ở Việt Nam, Lào, TQ.
• Ở nước ta: được trồng thành rừng hoặc phân tán hầu hết ở các tỉnh và
là một cậy trồng quan trọng trong chiến lược phát triển lâm nghiệp đất
nước. Nó có mặt ở 6 trên 9 vùng sinh thái lâm nghiệp.
9. 2. Phân bố và đăc điểm:
• Đây là loài cây gỗ lớn có thể cao đến 30m
đường kính lớn gần 100cm.
• Gỗ xoan có lõi màu hồng hay màu nâu nhạt,
dác xám trắng gỗ nhẹ, có vân thớ đẹp nếu
được ngâm tẩm thì đây là loại gỗ bền khó bị
mối mọt, cho nên gỗ xoan thường được dùng
làm xây dựng trang trí nội thất và điêu khắc.
• Nhưng khi mới khai thác thì đây là loại gỗ mềm
khó sử dụng.
10. Chương 1: Tổng quan
3. Vì sao phải nhân
giống cây Xoan Ta?
11. 3. Vì sao phải nhân giống cây Xoan Ta?
a. Nhu cầu sử dụng:
• Tuy phạm vi thích nghi
rộng, dễ trồng, yêu cầu dinh
dưỡng đất thấp, sản lượng
gỗ chất lượng cao, nhanh
nhưng do nhu cầu SD làm
đồ trang trí, chất đốt,… nên
sản lượng bị thu hẹp.
b. Điều kiện sinh lý:
• Do hạt giống cây Xoan Ta là
hạt hai lá mầm, khó mọc nếu
nên cần có các kỹ thuật nhân
giống phù hợp để cung cấp
đủ lượng cây giống cho thị
trường
12. Chương 2: QT
nhân giống
phôi soma
- Quy trình nhân giống như thế nào?
- Thành phần môi trường dinh
dưỡng?
- Điều kiện tối ưu cho nuôi cấy.
13. Chương 2: QT nhân giống phôi soma
1. Nguyên liệu
TV
2. Khử trùng hạt
và chuẩn bị
nguyên liệu tạo
phôi soma
3. Cảm ứng tạo
mô sẹo
4. Cảm ứng tạo
phôi soma
5. Phôi soma
nảy mầm
6. Tạo rễ và ra
cây
Sơ đồ quy trình nhân giống phôi soma cây Xoan Ta.
14. Chương 2: QT nhân giống phôi soma
1. Nguyên liệu TV
15. 1. Nguyên liệu TV
• Quả Xoan Ta được chọn lọc và thu hái từ
những cây trội (chống chịu hạn, năng suất
cao về khối lượng gỗ,…) sau đó loại bỏ
phần thịt quả và tách lấy hạt làm vật liệu
nuôi cấy.
• Thu hái là khâu quan trọng nhất và có ý
nghĩa quyết định đến lựa chọn được hạt
giống tốt. Thời gian thu hái tốt nhất là vào
giai đoạn quả chín sinh lý từ tháng 12 đến
tháng 2 năm sau.
16. Chương 2: QT nhân giống phôi soma
2. Khử trùng hạt và chuẩn bị
nguyên liệu tạo phôi soma
17. Sát khuẩn bề mặt hạt bằng ethanol 70% trong 3
phút.
Khử trùng bằng javen 100% và chuyển sang
javen 50% trong 5 phút (lắc nhẹ).
Loại bỏ javen và rửa sạch bằng nước cất vô
trùng 10 lần.
Sau khi đã khử trùng, cấy hạt trên môi trường
MS bổ sung 3% Saccharose với mật độ 15 hạt
trên 1 bình tam giác 250ml.
2. Khử trùng hạt và chuẩn bị nguyên
liệu tạo phôi soma
18. Chương 2: QT nhân giống phôi soma
3. Cảm ứng tạo mô sẹo
19. 3. Cảm ứng tạo mô sẹo
Hạt nảy
mầm sau 2
tuần nuôi
cấy trên môi
trường MS.
Cắt thân
mầm thành
đoạn có kích
thước 0,5
cm.
Cấy mẫu cắt
lên môi
trường CL
(Bảng 1).
Nuôi cấy
trong
khoảng 4
tuần.
20. Chương 2: QT nhân giống phôi soma
4. Cảm ứng tạo phôi
soma
21. 4. Cảm ứng tạo phôi soma
Cụm mô sẹo
được tách bỏ
những thân cũ.
Cấy truyền sang
môi trường SE
(Bảng 1).
Nuôi cấy trong
6 tuần.
23. 5. Phôi soma nảy mầm
Cụm phôi đã
nảy mầm.
Cấy truyền sang
môi trường RE
(Bảng 1).
Nuôi cấy
trong 6
tuần.
24. Chương 2: QT nhân giống phôi soma
6. Tạo rễ và ra cây
25. Chồi đạt chiều dài
từ
0,7 – 1,5 cm.
Cấy chuyền sang
môi trường R
(Bảng 1) trong 4
tuần.
Cây có bộ rễ hoàn
chỉnh được chuyển
ra nhà lưới.
Trồng trên giá thể:
đât cát pha 60%
cộng, trấu hun
40%.
Trong 2 tuần đâu
tránh ánh sáng
chiếu trực xạ.
Cây đủ điều kiện
xuất bán cây giống.
6. Tạo rễ và ra cây
26. Chương 3:
Kết quả và
thảo luận
- Đặc điểm cây Xoan Ta?
- Vùng phân bố?
- Ứng dụng của cây Xoan ta.
27. Chương 3: Kết quả và thảo luận
1. Khả năng cảm ứng
mô sẹo từ thân mầm
28. 1. Khả năng cảm ứng mô sẹo từ thân
mầm
• Trong nghiên cứu này các nồng độ từ 5 - 10 mg/L NAA và 1 mg/L BAP (bảng 2) được
sử dụng tạo mô sẹo từ thân mầm. Kết quả hầu hết các nồng độ có khả năng tạo mô
sẹo tuy nhiên chỉ ở nồng độ 3 mg/L NAA, 1mg/L BAP mô sẹo phát triển tốt nhất (tỷ
lệ tạo mô sẹo 92,2%) (Bảng 2). Ở nồng độ 2,4 mg/L NAA mặc dù mô sẹo vẫn phát
triển, tuy nhiên tỷ lệ tạo mô sẹo và chất lượng mô sẹo thấp hơn.
• Ở nồng độ 2,2 mg/L NAA khi kéo dài thời gian tạo mô sẹo xuất hiên hiên tượng mô
sẹo khô và chết dần thời gian tạo mô sẹo thích hợp nhất là 4 tuần. Ở các mốc thời
gian sớm hơn 4 tuần thì mô sẹo phát triển chưa đầy đủ và khi kéo dài hơn 4 tuần thì
mô sẹo bắt đầu khô và chết.
29. • Điều này có thể giải thích là do ảnh hưởng của các hợp chất thứ cấp
tiết ra từ mẫu cấy. Một yếu tố ảnh hưởng khá quan trọng đến khả năng
tạo mô sẹo là tuổi cây. Nếu dùng thân quá già thì tỷ lệ tạo mô sẹo thấp.
Tuổi cây sử dụng tạo mô sẹo tốt nhất là khoảng 15 đến 20 ngày sau
khi đặt hạt trên môi trường nảy mầm.
1. Khả năng cảm ứng mô sẹo từ thân
mầm
30. Chương 3: Kết quả và thảo luận
2. Khả năng cảm ứng
phôi từ mô sẹo
31. • Sau khi nuôi trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo 4 tuần, các cụm mô
sẹo được chuyển sang môi trường SE. Sau 3 tuần nuôi cấy đã xuất hiện
các phôi đầu tiên. Tuy nhiên số lượng phôi và chất lượng phôi thay đổi
phụ thuộc vào nồng độ BAP. Ở nồng độ 7 mg/L mặc dù phôi vẫn xuất
hiện, nhưng số lượng ít. Ở nồng độ 9 mg/L thì số lượng phôi xuất hiện
cũng tương đối nhiều (9,3 phôi/cụm mô sẹo), nhưng nếu duy trì trên
môi trường nuôi cấy thì phôi bắt đầu thay đổi từ màu vàng ngà sang
màu trắng. Ở nồng độ 11 mg/L NAA phôi phát triển tốt nhất cả về số
lượng lẫn chất lượng, số phôi soma tạo được cao nhất là 12,7 phôi trên
đoạn thân mầm ban đầu.
2. Khả năng cảm ứng phôi từ mô sẹo
32. Chương 3: Kết quả và thảo luận
3. Khả năng nảy mầm
của phôi
33. • Sau thời gian nuôi cấy trên môi trường SE3 (Bảng 3) ít nhất 4
tuần, các phôi hình thành và chuyển sang giai đoạn phôi chín.
Các cụm phôi chín này được chuyển sang môi trường có nồng độ
BAP thấp (1 mg/L BAP) để nảy mầm tạo thành cây hoàn chỉnh.
Giai đoạn này có ý nghĩa quan trọng với thí nghiệm, vì nếu số
lượng phôi tạo ra nhiều nhưng không nảy mầm được thì cùng
không thể có ý nghĩa. Tỷ lệ phôi nảy mầm càng cao thì xác suất
chọn được cây biến nạp càng lớn. Kết quả có khoảng 70% số
phôi có khả năng nảy mầm, tỷ lệ này rất có ý nghĩa cho các thí
nghiệm chuyển gen vào cây xoan ta.
3. Khả năng nảy mầm của phôi
35. • Theo Thakur và đồng tác giả năm (2004), môi trường MS bổ
sung thêm IBA ở nồng độ cao vào giai đoạn tiền cảm ứng ra
rễ sẽ tăng cường khả năng tạo rễ cây. Các chồi đạt chiều dài
từ 0,7 đến 1,5 cm, giai đoạn đầu được cấy lên môi trường
tiền cảm ứng tạo rễ MS bổ sung 3 mg/L IBA + 3%
saccharose, nuôi trong thời gian 3 ngày và sau đó cấy chuyền
sang môi trường MS có chứa 1% saccharose không chứa
chất điều hòa sinh trưởng nuôi tiếp trong thời gian 4 tuần.
Kết quả thu được cho thấy tỷ chồi ra rễ đạt 100%.
4. Khả năng tạo rễ
36. Chương 3: Kết quả và thảo luận
5. Khả năng sống sót khi
đưa cây ra vườn ươm
37. • Cây con có bộ rễ phát triển được chuyển ra trồng trên giá thể
trấu hun pha cát với tỷ lệ 4:6. Trong 2 tuần đầu cây được
nuôi trrong phòng nuôi cấy với nhiệt độ 27oC, cường độ
chiếu sang 1000 – 1500 lux, thời gian chiếu sang 12h/ngày.
Sau 2 tuần đầu cây mô được đưa ra trồng trong nhà lưới,
tuần đầu tránh ánh sang chiếu trực xạ và chăm sóc cây mô
như cây hom. Tỷ lệ cây mô sống sót trên giá thể trấu hun cát
pha đạt 100%.
5. Khả năng sống sót khi đưa cây ra
vườn ươm
39. Bảng 1: Thành phần các loại môi trường nuôi cấy.
Môi trường Ký hiệu Thành phần
Nảy mầm G MS + 30g Saccharose + 7g Agar
Cảm ứng mô sẹo CL MS + BAP(1 mg/L) + NAA (từ 1 đến 5 mg)
Cảm ứng tạo phôi SE MS + BAP(từ 7 đến 15mg/L) + 60g Saccharose + 7g agar
Phôi soma nảy mầm RE MS + 1mg/L BAP + 30g Saccharose + 7g Agar
Ra rễ R MS + 1mg/L BAP + 30g Saccharose
MS + 10g Saccharose
Phụ lục 1
40. Bảng 2: Kết quả tạo mô sẹo.
Môi trường NAA(mg/L) BAP(mg/L) Thân mầm Tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo
CL1 1 1 95 72,6
CL2 2 1 110 75,5
CL3 3 1 90 92,2
CL4 4 1 115 77,4
CL5 5 1 123 74,0
Phụ lục 2
41. Bảng 3: Tỷ lệ % cụm mô sẹo cảm ứng phôi
soma và số phôi soma trung bình/cụm mô sẹo.
Môi trường BAP(mg/L) Cụm mô sẹo
Tỷ lệ cảm ứng
phôi soma (%)
Số phôi soma
TB/cụm mô sẹo
nuôi cấy
SE1 7 56 78,6 4,7
SE2 9 56 87,5 9,3
SE3 11 60 95,0 12,7
SE4 13 52 82,7 7,3
SE5 15 65 78,5 5,7
Phụ lục 3
42. Phục lục 4
• Các môi trường được sử dụng được điều chỉnh pH = 5,8 và
bổ sung thêm 7 g/L agar.
• Khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1,5 atm trong 15 phút.
Nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 2oC, cường độ ánh sang 3000 lux
với thời gian chiếu sáng 16h/ngày.
43. Tài liệu tham khảo
[1]. Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giang,
Nông Văn Hải, Chu Hoàng Hà, Nghiên cứu hệ thông tái
sinh cây Xoan Ta ( Melia azedarach L.) thông qua phôi
soma từ thân mầm phục vụ chuyển gen, Tạp chí công
nghệ sinh học, số 6, 2008.
[2]. Đoàn Thị Hoa, Đỗ Phương Chi, Đặng Thị Thu
Huyền, Nghiên cứu hạt giống và nhân giống cây Xoan
Ta Ta ( Melia azedarach L.) bằng hạt tại tỉnh Hòa Bình,
Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp Việt Nam,
số 8, 2008.
