Malattie multifattoriali

1. Caratteri Quantitativi o “continui”
Caratteri Semiquantitativi o “discontinui”
Caratteri Autosomici Dominanti
Caratteri Autosomici Recessivi
Caratteri legati al Cromosoma X
Caratteri Monofattoriali o “mendeliani”
Caratteri Multifattoriali

2. Sono causate dall’azione di due o più geni e dalla loro interazione con l’ambiente
Hanno frequenza superiore ad un’affetto ogni mille individui
MALATTIE POLIGENICHE

3. 100% AMBIENTE 100% GENI
Paraparesi spastica
Fibrosi cistica
Distrofia Muscolare di
Duchenne
Raffreddore
TBC
Traumi
Autismo
Asma Obesità
Diabete Cancro
(malattie poligeniche o
complesse)

7. Importanza di fattori genetici:
STUDI DI RICORRENZA FAMILIARE: RISCHIO RELATIVO R
Esprime il grado di aggregazione familiare di un carattere
s = rischio nei fratelli/sorelle di un affetto
rischio nella popolazione generale
CONCORDANZA IN GEMELLI MONOZIGOTICI/DIZIGOTICI
Permettono di stabilire se l’aggregazione familiare e’ dovuta all’ambiente familiare in comune
oppure a fattori genetici
MZ = 100% geni in comune
DZ = 50% geni in comune
Una maggiore concordanza in gemelli MZ e’ indice di fattori genetici. Tuttavia:
• Tendenza a trattare i gemelli MZ in modo piu’ simile dei DZ
• Differenze genetiche fra gemelli MZ (geni sistema immunitario, mutazioni somatiche,
pattern inattivazione X)
STUDIO DI INDIVIDUI ADOTTATI
Altro metodo per individuare il contributo di fattori ambientali ed effetti genetici

8. Studi di gemelli
•grossa disparità fra i tassi di
concordanza dei gem. MZ e DZ:
importanza di fattori genetici
•Concordanza molto bassa nei DZ:
azione epistatica di più geni
•Concordanza per un più ampio
spettro di disturbi socio-cognitivi
in forma meno grave che
nell’autismo: “broader phenotype”
•Eterogeneità clinica
Bailey et al, 1995
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
MZ (n=25) DZ (n=20)
Concordance
rate
Cognitive disorder
Social disorder
Social and cognitive
disorder
Autism
(same sex)

9. Studi di ricorrenza familiare
•Frequenza nei fratelli di probandi ≈ 3%
(~ 6% per PDD)
•Maggiore rischio di ricorrenza rispetto
alla prevalenza nella popolazione
• s = 10-50
•“broader phenotype”
•Relazione diretta fra gravità
dell’autismo e broader phenotype nei
familiari
Bolton et al, 1994
0
5
10
15
20
25
AUTISM DOWN'S
%
in
siblings
of
proband
Any one of three key
aereas
Any two of the three key
areas
Communication and social
deficit
Asperger's/PDD
Autism

10. Linkage Analysis
Sib-Pairs Analysis
• lod score computation: powerful
and accurate
• recombinant : positional cloning
• large families
• assumed mode of inheritance
•parents not necessary
• model-free
• false-positives
• large number of sib-pairs
• weaker results and imprecise
localisation
• no recombinant

11. Analisi di LINKAGE “tradizionale”
(Metodi “parametrici” )
D
1
+
1
+
2
+
2
D
1
+
2
+
3
+
4
D
2
+
4
+
2
+
4
+
1
+
3
D
1
+
3
NR R R
NR
• Dipende dalla specificazione di un modello di ereditarietà
• Si contano gli eventi di ricombinazione fra due loci
• Test: frazione di ricombinazione () < 0.5

12. Mutazioni e polimorfismi
actcgggctaaactttcggggcccaaactacgactagctagctactagctagctaacttcggatcggatcggatcggatc
actcgggctaaactttcggggccTaaactacgactagctagctactagctagctaacttcggatcggatcggatcggatc
actcgAgctaaactttcggggcccaaactacgactagctaCctactagctagctaacttcggatcggatcggatcggatc
Polimorfismi varianti di 1 tratto di DNA presenti nella popolazione con frequenze non
trascurabili (>1%). In genere non patogeniche
DNA
proteina
Mutazioni varianti rare di 1 tratto di DNA che hanno un effetto sul fenotipo
STOP

13. ...CCATTGACTT...
...CCTTTGACTT...
Example of a given sequence of
bases in a fragment of DNA:
Some people have a different
base at a given location
This is a Single Nucleotide
Polymorphism or SNP
What is a SNP?

14. Human DNA
A SNP MAP
Human
DNA
Location of SNPs
(where there are single base differences between individuals)
What is a SNP Map?
 3 billion nucleotide base pairs
 99.9 are % the same for everyone
 3 million SNPs in a population

15. How will a SNP Map be used?
Discovery of New and Better Medicines
Locating versions of genes that alter the risk of disease
A T C C
G
A G
T C T A
A
G G
T G
Matched population without disease Population with disease
C
G
T
G
T A A C
T C T A
G G
T G
C
G
T C T A
G
G G
T G
Search for susceptibility genes
T A A T C
SNP
Profile

16. How will a SNP Map be used?
Getting the Right Medicine to the Right Patient
A T C C
G
A G
T C T A
A
G G
T G
Patients who respond
without a serious side effect
Patients who respond but
experienced a serious side effect
Diagnostic
Right Medicine
Right Patient
G
T
G
T A A C
T C T A
G G
T G
C
SNP
Profile

17. Basic techniques to search for functional
polymorphism in the human genome
• Association
– typically compares the allele frequency of a given SNP in two
matched groups ("cases" & "controls")
– high power if functional SNP directly tested.
– low power if multiple rare SNPs affect the same gene.
– very variable power if based on LD (depends on regions and SNPs)
– Soon, but not yet, genome wide search possible in the West
European population but … extremely expensive => Perlegen 1.7
million SNP with MAF > 0.1
– Presently requires candidate chromosomal regions and/or some
good functional hypotheses pointing to functional candidate genes

18. Association studies
(case control studies)
Affected individuals Control individuals

19. Biased Association Studies
(stratification of population)
Crohn’s disease group
(more Caucasians)
(less Africans)
Control individuals
Alleles that are more frequent in the caucasian population
will be more frequent in the Crohn’s disease group
Prevalence of Crohn Disease
in American Veterans
Africans Asians Causasians
0
20
40
60
80
100
120
Africans Asians Causasians

20. Caratteri genetici complessi
SUSCEPTIBILITY ALLELES
Numero di Fattori di Rischio
Frequenza
Valore soglia
•Il carattere è influenzato da un certo numero di fattori di rischio
•Individualmente ciascun fatt. di rischio ha un effetto moderato. La piena manifestazione
del carattere è la risultante dell’azione combinata dei vari fattori di rischio

21. Caratteri genetici complessi
Eterogeneità
A B C
Fenotipo

22. Come identificare i geni?
• Screening dell’intero genoma umano analizzando un elevato numero
di famiglie con almeno 2 individui affetti (multiplex) con metodi di
LINKAGE non parametrici
• ASSOCIAZIONE ALLELICA (linkage disequilibrium mapping)
• Geni CANDIDATI
• Anomalie citogenetiche

23. GENOME WIDE SCAN
Marcatori polimorfici
distribuiti su tutto il genoma

24. A,C B,D A,C E,G F,G F,H
A,B C,D E,F G,H
A,D A,H E,D
A,E D,H
Metodi di linkage ‘Non-parametrici’
2 alleli in comune
25%
40%
1 allele in comune
50%
55%
0 alleli in comune
25%
5%
Regione qualsiasi
Regione vicina ad un
gene di “suscettibilità”
Si basano sulla condivisione di alleli di un marcatore da parte di
individui affetti all’interno di una stessa famiglia
Famiglie con almeno
2 fratelli affetti

25. Problemi negli studi di linkage di malattie complesse
• Difficile stabilire la soglia di significatività
MLS > 3.6?
• Replicazione indipendente dei risultati positivi
Per replicare un risultato positivo è necessario un
campione di famiglie di dimensioni molto maggiori
rispetto al campione originario
• Picchi di linkage molto larghi ed imprecisi rispetto alla
posizione del locus malattia

26. Dagli studi di linkage all’identificazione dei geni di suscettibiltà…
Esame più in dettaglio delle regioni cromosomiche identificate:
sono molto ampie e contengono centinaia di geni: ciascuno di essi potrebbe essere il
responsabile
Aumentare il numero di famiglie studiate
Analisi combinata dei dati di diversi gruppi di ricerca
Studio di individui affetti con anomalie cromosomiche che coinvolgono queste
regioni
Studio di geni candidati
Studi di associazione allelica / Linkage disequilibrium
mapping

27. Studi di associazione allelica
Casi-controlli
Studio se un particolare allele è più
frequente nei casi rispetto ai
controlli, scelti dalla stessa
popolazione
Alleli dei genitori:
Trasmessi -> A C
Non trasmessi -> B D
A B C D
A C
Transmission Disequilibrium Test
TDT
Studio se un particolare allele è
trasmesso dai genitori al figlio
affetto più frequentemente del 50%

28. Mendel’s law :
Each parental allele carried by an autosome
has an equal probability (i.e. 0.5)
to be transmitted to an offspring
a/b c/d
a/c

29. Frequency of transmission of allele a :
Fa = 6/12= 0.5
Transmission of an autosomic multiallelic polymorphism
in trios
a/b c/d
a/c
a/d b/d
a/d
b/b a/d
b/a
c/b c/a
c/c
a/b c/d
b/c
a/c c/d
c/d
b/c c/d
c/d
a/d a/d
a/c
a/b a/d
c/d
a/b a/d
a/a

30. Allele a is transmitted with a frequency :
Fa = 10/12= 0.83 (p < 0.038)
Transmission disequilibrium in affected offsprings
a/b c/d
a/c
a/d b/d
a/d
b/b a/d
b/a
c/b c/a
c/a
a/a c/d
a/c
a/c a/c
a/c
a/c c/d
c/d
a/d a/d
a/a
c/b a/d
c/a
a/b a/d
a/a
Phenocopy

31. Cause di associazione allelica
1. Effetto diretto della variante
genetica sul fenotipo
2. Linkage disequilibrium
(dovuto alla vicinanza di due
loci sul cromosoma)
3. Associazioni “spurie” dovute a
diversi eventi: per es.
presenza di stratificazione
nella popolazione
Linkage Associazione
marcatore
Allele di
suscettibilità

32. Linkage Disequilibrium
LD = associazione non casuale degli alleli appartenenti a
due loci vicini fra loro sul cromosoma
A
B
a
b
A
b
a
B
D = f(AB) - f(A) x f(B) D’ = |D |
Dmax

33. Linkage disequilibrium mapping
M=allele di un
marker sullo
stesso aplotipo
dell’allele mutato*
~15 kb
Le varianti in una determinata regione genica possono
essere non indipendenti: sono in linkage disequilibrium
Markers che sono fisicamente vicini tendono a rimanere associati (i.e.
non ricombinano) con la mutazione ancestrale

34. Linkage Disequilibrium
N
F1
E1
D1
C1
B1
A1
G1
H1
I1
J1
K1
Mutazione
N -> D
D
F1
E1
D1
C1
B1
A1
G1
H1
I1
J1
K1
D
F1
E1
D1
C2
B2
A2
G1
H1
I2
J2
K2
D
F1
E1
D1
C1
B1
A1
G1
H1
I1
J1
K1
10
generaz.
90
generaz.
In una popolazione il LD decresce in funzione del num di generazioni (t) e della
frazione di ricombinazione (r)
Pattern di LD lungo il genoma è variabile e complesso e influenzato da un
insieme di fattori demografici, molecolari ed evolutivi. Ancora oggetto di studio

35. Struttura degli Haplotype blocks
•Diversi studi hanno mostrato che una gran parte del genoma e’ strutturato in blocchi di elevato LD, detti “haplotype
blocks”, separati da segmenti a basso LD.
• All’interno di un blocco, le varianti sono fortmeente correlate fra loro e la maggior parte di variabilita’ genetica in una
popolazione e’ dovuta ad un numero ristretto di combinazioni alleliche (aplotipo)

36. Genotipo vs. aplotipo
 genotipo
» la struttura genetica di un organismo, distinta dalla
struttura fisica (il suo fenotipo).
» Esempio 1: genotipo a 1 locus (SNP: AA Aa aa)
» Esempio 2: genotipo multilocus (4 loci)
d
D
C
C
B
b
A
A
A
A

37. Genotipo vs. aplotipo
 Aplotipo
» Il complesso di genotipi per un numero di
loci fisicamente vicini su un singolo
cromosoma (o gamete)
d
C
B
A

38. Stima degli aplotipi
 Scopi
» Stima della frequenza degli aplotipi in un
una popolazione (ex casi vs controlli)
» Stima delle coppie di aplotipi (i piu
probabili) in un individuo

39. Stima degli aplotipi
 campione
» Individui indipendenti (non
imparentati)
– Excoffier and Saltkin
(Mol Biol Evol, 1995)
» Famiglie nucleari
– Rhode and Fürst (Hum
Mutation, 2001)
» Pedigree estesi
– Qian and Beckmann
(Am J Hum Genet,
2002)
 Programmi (e.g.)
» HAPLO
» GENHUNTER
» SIMWALK2
» VITESSE
» MRH (Minimal Recombinant
Haplotypes)
» MERLIN

40. Il concetto di tagSNP

41. “ To develop a haplotype map of the human genome, describing the
common patterns of human DNA sequence variation. The HapMap is
expected to be a key resource for researchers to use to find genes
affecting health, disease, and responses to drugs and environmental
factors”

42. SNP coverage lungo i cromosomi

43. Esempio: struttura degli haplotype blocks nel gene della beta globina

44. To localize by association methods (i.e. LD mapping) a functional SNP, the typed
marker SNP should be in linkage disequilibrium with the functional SNP.
Functional SNP
Marker SNP
The distance over which useful linkage disequilibrium takes place is unpredictable.
It may vary from a few base pairs to over several hundred Kb.
To perform a comprehensive genome wide screen in the West European population,
the typing of well over 100 000 SNPs will be required

45. The search for susceptibility genes…