1. СЕМИНАР:
Секвенирование следующего поколения
(NGS), как инструмент клинической
генодиагностики
Павлов Александр
Руководитель Лаборатории молекулярной диагностики
Sequoia genetics, ГК Алкор био
apavlov@sequoiag.com
Томск
5 февраля 2013 г.
2. ТЕМЫ
1) Метод NGS – технологическая платформа для
высокопроизводительного секвенирования;
2) Таргетное обогащение образцов – фокусирование
исследований на целевых регионах генома;
3) Анализ данных NGS – прикладная
биоинформатика;
4) NGS в клинической практике – возможности и
ограничения;
5) Проект «Неонатальная NGS-генодиагностика» -
текущее состояние дел, возможности для
коллаборации.
2
7. 7
Приготовление библиотек
1
М
е
т
о
д
N
G
S
Источники ДНК для приготовления библиотек:
• геномная ДНК (Whole genome);
• часть геномной ДНК (Targeted Enrichment);
• набор ПЦР-продуктов (ампликонов);
• кДНК (RNA-Seq);
• иммунопреципитированный хроматин (ChIP-Seq) и т.д.
9. 9
Полупроводниковое секвенирование
1
М
е
т
о
д
N
G
S - Нуклеотиды последовательно подаются на чип один за другим
- Встраивание длится несколько секунд, прямая детекция реакции полимеризации в
режиме реального времени
Rothberg J.M. et al Nature doi:10.1038/nature10242
Sensor Plate
Silicon Substrate
Drain Source
Bulk
dNTP
To column
receiver
∆ pH
∆ Q
∆ V
Sensing Layer
H+
10. 10
Генерирование сиквенсов
1
М
е
т
о
д
N
G
S
GTAGCGGGCACTCCACCGTGGCGTCATCTTCCAGATACCCTTCTGACATT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTAGCGGGCACTCCACCGTGGCGTCATCTTCCAGATACCCTTCTGACATT
10 20 30 40 50
GACGCATTACCATGGCTGCAACGATCGTTAATGGCATAAAACTCGCCGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GACGCATTACCATGGCTGCAACGATCGTTAATGGCATAAAACTCGCCGCC
60 70 80 90 100
AACGTTGAACAGGGCGATGACGGGCGAGGTATCGATCCGGAGAGCCTCAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AACGTTGAACAGGGCGATGACGGGCGAGGTATCGATCCGGAGAGCCTCAC
110 120 130 140 150
CCTCCGGCACATCCGCAACGGGACACGCATAAATTCGATTCATCAGAACA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCTCCGGCACATCCGCAACGGGACACGCATAAATTCGATTCATCAGAACA
160 170 180 190 200
GTACACTCAGGTTATGGGAAGTGATTACC
|||||||||||||||||||||||||||||
GTACACTCAGGTTATGGGAAGTGATTACC
210 220
11. 11
Способы таргентного обогащения образцов
2
Т
а
р
г
е
т
н
о
е
о
б
о
г
а
щ
е
н
и
е
Геномная ДНК
Фрагментация
Обогащение гибридицацией Обогащение амплификацией
12. 12
Custom AmpliSeq. Неонатальная панель
2
Т
а
р
г
е
т
н
о
е
о
б
о
г
а
щ
е
н
и
е
- 2 ПЦР на один образец
- 192 пары праймеров
- Амплификация 20,73 kb
- 20 нг ДНК на анализ
21. 21
Клиническая диагностика на базе NGS
4
N
G
S
в
к
л
и
н
и
к
е
Перспективы внедрения тест-систем на
платформе NGS
Предпосылки:
1) Объектом исследования становятся регионы генома, а
не точечные мутации
2) Спектр исследуемых вариантов крайне широк и
ограничен дизайном пробоподготовки и задачами
3) Единый аппаратно-программный комплекс для
тестирования практически любых генетических
маркеров. Хорошо масштабируется.
22. 22
Клиническая диагностика на базе NGS
4
N
G
S
в
к
л
и
н
и
к
е
В настоящий момент НЕ существует
диагностических тест-систем на платформе NGS
Предпосылки:
1) Новизна технологической платформы
2) Необходимость разработки комплексного решения,
где конечным пользователем оставался бы клиницист
3) Проблемы выбора исследуемых маркеров
4) Сложность интерпретации массива данных
5) Отсутствие рекомендаций по проведению
клинических испытаний
6) Высокая стоимость пуска системы
7) Изменение принятых схем диагностики
8) Невозможность интерпретации сопутствующих
данных о найденных полиморфизма
23. 23
Базы данных генетических вариантов
4
N
G
S
в
к
л
и
н
и
к
е
Общие
- много избыточной и вырожденной информации
- сложно выделить значимую информацию
- часто обновляются
Специализированные
- проще выделить значимую информацию
- нестандартизованная структура данных
- обновляются нерегулярно
25. Disease Frequency Gene
Cystic fibrosis 1 : (3-9) 000 CFTR
Phenylketonuria 1 : 10 000 PAH
Galactosemia 1 : 20 000 GALT
Congenital adrenal hyperplasia 1 : (7-12) 000 CYP21A2
Congenital hypothyroidism 1 : 5 500 Multifactorial disorder
Заболевание Частота Ген
Муковисцидоз 1 : (4-11) 000 CFTR
Фенилкетонурия 1 : 10 000 PAH
Галактоземия 1 : 20 000 GALT
Адреногенитальный синдром 1 : (7-12) 000 CYP21A2
Врожденный гипотиреоз 1 : 5 500 Мультифакторное
НЕОНАТАЛЬНАЯ ПАНЕЛЬ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Особенности:
- Наследственные заболевания;
- Высокая частота в популяции;
- Тяжелый фенотип;
- Необходимость ранней диагностики;
- Преимущественно моногенные;
- Скрининговая диагностика по биохимическим маркерам;
- Есть вероятность ложно-положительных результатов;
- Генетическое тестирование желательно для подтверждения диагноза.
Суммарное количество
рекомендованных к
тестированию мутаций более 70
Экзоны ≈ 20kb
25
5
Н
е
о
н
а
т
а
л
ь
н
а
я
п
а
н
е
л
ь
26. • NGS ресеквенирование целевых участков генома
• Таргетное обогащение интересующих фрагментов
• Молекулярное баркодирование образцов
• Высокая степень автоматизации в проведении
анализа и обработки данных
• Клиническая верификация и валидация
ПОДХОД
26
5
Н
е
о
н
а
т
а
л
ь
н
а
я
п
а
н
е
л
ь
28. АВТОМАТИЗАЦИЯ СОЗДАНИЯ БИБЛИОТЕК
28
TECAN Freedom EVO 150
- Сокращение вовлеченности лаборанта с 7 часов до 40 минут;
- Снижение вероятности ошибки;
- Повышение производительности и воспроизводимости анализа.
5
Н
е
о
н
а
т
а
л
ь
н
а
я
п
а
н
е
л
ь
29. 29
КЛЮЧЕВЫЕ ОСОБЕННОСТИ РЕШЕНИЯ
• Параллельное секвенирование экзонных регионов пяти
генов;
• Идентификация 240 клинически значимых мутаций, более
1000 мутаций из dbSNP, поиск новых вариантов;
• Таргетное обогащение основанное на мультиплексной
ПЦР - Ion AmpliSeq(два пула праймеров, 172 ампликона);
• Молекулярное баркодирование образцов (до 48
образцов);
• Глубокая автоматизация при создании библиотек;
• Специализированное программное обеспечение для
врачей-генетиков для аннотации результатов
секвенирования и формирования протокола, включающее
базу мутаций (ссылка).
• Полная верификация и валидация тест-ситемы.
5
Н
е
о
н
а
т
а
л
ь
н
а
я
п
а
н
е
л
ь
30. ВЕРИФИКАЦИЯ, ВАЛИДАЦИЯ
1. Разработка на выборке из не менее 200 клинических
образцов и 300 образцов «дикого типа»
2. Верификация «регионов интереса» секвенированием
по Сангеру (около 50 % сиквенса для 100 образцов)
3. Анализ результатов, статистическая оценка
4. Установление аналитических и диагностических
свойств
5. Валидация в 4 лабораториях в Европе
6. Установление диагностических свойств
7. Клиническая апробация РФ и Европа
8. Получение CE-mark и РУ.
30
5
Н
е
о
н
а
т
а
л
ь
н
а
я
п
а
н
е
л
ь
31. Профильные организации и специалисты
приглашаются для участия в
валидации и апробации решения
СПАСИБО
31
