MVDr. Petra Přinosilová, Ph.D.

1. Asistované reprodukce psů
ve veterinární praxi
zaměřeno na semeno
MVDr. Petra Přinosilová, Ph.D.
Laboratoř spermatologie a andrologie
VÚVeL
www.frozendogs.com
15.10.2016

2. 1. Odběr a vyšetření ejakulátu za účelem dalšího
zpracování (průběh odběru, kvalita semene, co když
zjistím problém? - příčiny, řešení)
2. Herpersviróza, brucelóza psů
3. Konzervace semene (chlazené vs. mrazené sperma,
uskladnění semene, nadvarletní spermie)
4. Parametry a výroba inseminační dávky
5. Transport semene (export, import po světě, časování
odběru, volba kontejneru)

3. Odběr semene
1. Vhodnost/nevhodnost psa pro odběr za účelem konzervace semene
(věk, zdravotní stav, předchozí léčba)
2. Vyšetření plemeníka, příprava na odběr
3. Odběr a vyšetření ejakulátu (přítomnost feny, chování majitele, frakce
ejakulátu)
4. Jaké problémy mohou při odběru nastat (s erekcí, s ejakulací,
kompletnost odběru) - správná manipulace při stimulaci k erekci a
ejakulaci, bolest, psychika, androgenní insuficience, nezkušený/moc
zkušený, fimóza předkožky, návrat penisu do předkožky)

4. Vyšetření kvality spermatu
• objem, barva, konzistence, cizí příměsi (krev, hnis), pH
• počet spermií (objem semene x koncentrace spermií)
• pohyblivost spermií
• membránová integrita
• morfologický obraz
• akrozomální integrita
• cytologie (leukocyty, zárodečné buňky)
• mikrobiologické vyšetření
• integrita chromatinu ve spermiích
• využití automatických analyzátorů - CASA
• biochemická analýza (ROS; obsah a zastoupení fruktózy,
aminokyselin, proteinů, enzymů - ALP)

5. Délka spermie
býk 70µm
kanec 48µm
hřebec 58µm
pes 68µm
kohout 118µm
Spermie
• Hlavička:
• jádro (chromatin),
• akrosom (acrosin a hyaluronidasa),
• postakrosomální region.
• Krček
• Spojovací část
• Hlavní část bičíku
• Terminální část bičíku

6. Morfologický obraz ejakulátu psa
primární vs. sekundární defekty

9. CASA
* Rapid progressive motility
* Slow progressive motility
* Non-progressive motility
* Immotile

10. Objem semene zastoupení jednotlivých frakcí a velikost
plemene (0,1 až 30 ml)
Konzistence zastoupení frakcí (vodnatá, mléčná až
smetanovitá)
Zápach typický
Barva bílá, šedobílá
pH 5,9 – 6,8 (dle zastoupení frakcí)
počet spermií min. 22 mil/kg psa
pohyblivost spermií min. 70 %
Zastoupení normálních spermií min. 70 (80) %
Spermiogram psa - referenční hodnoty

11. Narušená kvalita ejakulátu - příčiny
• narušení zdravotního stavu
• příliš mladý pes, příliš starý pes
• přetěžování plemeníka (jak chovatelské, tak fyzické)
• toxiny, medikace (gestageny, kortikoidy, ranital, antimykotika)
• endokrinní příčina (hypothyreóza, hyperadrenokorticismus, DM)
• přehřátí, stres (cestování, vet. zákroky, výstavy...), obesita (intraskrotální tuk)
• neoplazie varlat (seminom; Sertoliho tumor a nádor Leydig. buněk – hormonální
změny), nadvarlat, penisu
• skrotální kýla
• trauma pohlavních orgánů
• infekční záněty reprodukčního systému (bakteriální, virové, mykoplasmata)
• autoimunitní zánět varlat (po narušení hematotestikulární bariéry díky traumatu
či zánětu) – vytvoření protilátek proti spermiím, destrukce spermatogenetické
tkáně
• degenerativní změny varlat, nadvarlat, většinou po chronickém zánětu
• nemoci prostaty (BHP, prostatitida, cysty, nádory)
• retrográdní ejakulace

12. Diagnostický postup při narušené kvalitě ejakulátu
• podrobná anamnéza (výsledek krytí, nemoci, léčba, aplikace, krmení,
umístění psa, intenzita fyzického a chovatelského využívání, přehřátí)
• celkové klinické a speciální andrologické vyšetření
• vyloučit yatrogenní příčiny – nekompletní odběr (hodnoty ALP, nový odběr s
háravou fenou), kontakt semene s nevhodnými materiály
• mikrobiol. vyšetření ejakulátu (aerobní bakteriol. kultivace, Mycoplasma
canis), serologie Brucela canis
• UTZ varlat a prostaty
• stanovení hladin testosteronu, LH, FSH, estrogeny – vylučování T, LH a
FSH je epizodické – stimulační test
• hematologický a biochemický rozbor krve (hypothyreóza, celkové narušení
zdrav. stavu)
• vyloučení retrográdní ejakulace (spermie v moči)
• genetické metody: analýza chromozomů
• biopsie varlat

13. Léčba narušené kvality ejakulátu
• dle zjištěné příčiny
• podpůrná léčba: vitamíny (E – přírodní zdroj jsou např. obilné
klíčky, vit. A, C) , stopové prvky (selen, zinek), aminokyseliny
(arginin), omega 3 mastné kyseliny – zdroj např. rybí tuk či lněné
semeno, kotvičník zemní, mořské řasy min. 1 měsíc. Pozor na
předávkování při kombinace různých přípravků.
• hormonální léčba (GnRH, hCG, PMSG (FSH-like activity),
testosteron, aromatázové inhibitory) – ne dlouhodobě (protilátky)
• dle charakteru problému omezení pohlavní činnosti nebo naopak
pravidelné odběry semene
• kontrolní odběr ejakulátu cca za 3 až 5 měsíců

14. Herpervirus canis (CHV-1)
 Problémy se zabřezáváním, málopočetné vrhy, potraty, úmrtí štěňat po
porodu
• Podstata choroby (podobně jako herpesvirus labialis u lidi) - celoživotní
infekce, po primární infekci organismus vytvoří protilátky, které
přetrvávají v organismu určitou dobu, ale ne natrvalo. Může dojít znovu
k nakažení nebo znovupropuknutí nemoci. Virus perzistuje v nervových
gangliích a při oslabení, STRESu (třeba i transportním za krytím),
léčbě imunosupresivy může dojít opět k virémie a šíření viru). Fatální
je pro štěňata v děloze (vstřebání zárodků a potrat či porod mumifikátů)
a po porodu (mohou se nakazit od matky, ale i od ostatních jedinců v
chovu). Dospělí jedinci jsou většinou zcela bez příznaků (ojediněle
vesikuly na genitáliích, respirační příznaky - kašel), přenos oronazálně
jakýmikoli sekrety, nejen pohlavní cestou! Přenos konzervovaným
semenem???
• Má-li fena během březosti vysoký titr protilátek, jsou březost a
štěňata chráněna. V nebezpečí jsou feny v inkriminovanou dobu (před
krytím, během březosti až 3t po) bez protilátek.

15. • Diagnostika: přímý průkaz viru vyšetřením mrtvých plodů a štěňat a
typické hemorag. změny na ledvinách a játrech. Dospělci: přímý průkaz
viru z oronazálních a pohlavních sekretů (PCR). Detekce protilátek v krvi
(jejich hladina v krvi se mění a nastupuje až s časovým odstupem po
virémii! – 2 až 3 t; význam sérokonverze – 2x krev v rozmezí 2t u fen,
které vstřebaly či potratily).
• Prevence – vakcinace feny – vakcina navodí protilátky, které chrání
štěňata proti infekci jak v děloze, tak i prostřednictvím kolostra po
porodu. Eurican Herpes 205 (substance herpesvirového antigenu),
první subkutánní aplikace během hárání nebo 7 až 10 dní po krytí, druhá
aplikace 1 až 2 týdny před porodem). Zvážit situace v chovu (výskyt AB
u jednotlivých fen) - separace negativní feny min. 3t před krytím, po
celou březost a až min. 3t po porodu od ostatních.
• Terapie štěňat: zavčas, zvýšení teploty (virus nejraději vegetuje při
teplotách kolem 35°C), aplikace séra s protilátkami – neexistuje
komerčně.

16. Brucelóza psů – B. canis
• ČR prostá, ale riziko přenosu ze zahraničí.
• Infikovaná zvířata šíří infekci semenem, močí, sekrety (sliny, nosní
sekrety).
• Přenos inhalací, pozřením, pohlavním stykem, semenem.
• Velká afinita k pohlavnímu aparátu: u psů záněty varlat a
nadvarlat, infertilita, dermatitida šourku. U fen pozdní potraty. Dále
meningitida, lymfadenitida, uveitida, záněty levin, osteomyelitida,
záněty kůže.
• Terapie antibiotiky nezajistí vymýcení mikroorganismu z těla,
infikované zvíře nutno oddělit od ostatních a vykastrovat.
• Riziko přenosu na člověka (zoonóza, hl. lidé s imunosupresí,
těhotné a děti - horečka, lymfadenitida, zvětšená slezina…).
• Serologické vyšetření krve na SVÚ Praha, Olomouc aglutinačním
testem.

17. Konzervace semene
• chlazené
• mrazené
 snížení metabolismu spermií a
navození anabiózy - stavu podobnému
tomu, při němž jsou spermie uchovány
v nadvarleti
 cíl: prodloužení životaschopnosti a
fertilizační schopnosti spermií

18. Výhody používání konzervovaného
semene v plemenitbě
• možnost uchovat fertilizační schopnost spermií po delší dobu
(chlazené vs. mrazené semeno)
• zamrazené semeno lze skladovat neomezeně dlouho a použít i po
smrti dárce
• snížení rizika transferu pohlavně přenosných nemocí
• možnost získat genetický materiál samců z celého světa bez
nutnosti přepravy zvířat
• deponování (inseminace) semene o zkontrolované kvalitě spermií
• možnost získat z jednoho odběru semene více inseminačních dávek
• možnost inseminace zvířat, která by se ze zdravotních důvodů
nemohla reprodukovat (fyzické či psychické poruchy)
• spermie lze získat i z několik hodin mrtvého zvířete (odběr z
nadvarlat)

19. Mrazené Chlazené semeno
• časově neomezené skladování,
semeno je možné použít kdykoli, i
dlouho po smrti dárce
• odběr s předstihem, možnost
zajištění háravé feny, odhalení
nekvalitního ejakulátu zavčas
• snadná příprava
• menší poškození spermií než při použití
kryokonzervace (fertilizační schopnost a
délka přežití je delší)
• levnější transport a výroba dávek
• vaginální inseminace možná
• dražší vyhotovení inseminační
dávky
• dražší transport
• více faktorů ovlivňující úspěch
• vyžaduje intrauterinní inseminaci
• nutný rychlý přesun semene při
konstantní teplotě 5°C až 10 °C (nejlépe
během 24 h, max. 40 h)
• načasování výroby inseminační dávky
záleží na monitoringu pohlavní aktivity
feny (progesteronový test)
• semeno nelze skladovat dlouhodobě,
inseminaci je nejvhodnější provést max.
do 5. dne od vytvoření dávky

20. Fig. 1. Frakce
získané
ošetřením
semene
gradientní
centrifugací
pomocí 40/80
PureSperm®
Fig. 2. Pohyblivost spermií během 24h po rozmrazení
Krev v semeni – při benigní hyperplazii prostaty, poranění penisu
– nejde-li kryokonzervaci odsunout – využití separačních metod
• více jak 4 % krve v ejakulátu negativně ovlivňuje přežitelnost spermií během
kryokonzervace (hemoglobin)
• swim-up a gradientní centrifugace – grad. centrifugace poskytla účinnější separaci
červených krvinek od spermií a zároveň umožňuje eliminaci bakteriální kontaminace,
která je častá při onemocnění prostaty
• spermie mrazené po odstranění červených krvinek gradientní centrifugací vykázaly lepší
přežitelnost než spermie z neošetřeného ejakulátu či ejakulátu ošetřeného metodou
swim-up. Na druhou stranu ztráta spermií při grad. separaci byla 50%.
• na základě našich předběžných výsledků se separace gradientem jeví jako vhodné
řešení při kryokonzervaci krví kontaminovaného semene, ale jen v případě
závažné hematospermie
Konzervace semene „s problémy“
Tab. 1. Kvalita semene před separací a po separaci různými metodami.
AS: po separaci; FT: po rozmrazení; AI: akrosomálně intaktní spermie

21. Konzervace semene „s problémy“
Pes s benigní hyperplazií prostaty – jde-li konzervaci semene odsunout -
léčba Ypozanem – kdy kryokonzervace?
• princip působení: osaterone acetate inhibuje efekt testosteronu selektivně
pouze v prostatě kompetitivní vazbou na testosteronové receptory v
prostatě a blokuje tak transport testosteronu do prostaty, neovlivňuje tedy
hladinu testosteronu ve varlatech
• postup léčby: perorální aplikace po dobu 7 dní, nástup účinku během 2
týdnů, délka působení min. 5 měsíců
• vyšetření prostaty doporučeno za 5 měsíců po podání či dříve podle
klinických příznaků
• dle výrobce preparát nemá negativní dopad na kvalitu semene
• dle našeho předběžného sledování došlo k přechodnému nárůstu
morfologicky abnormálních spermií kolem 1. měsíce po aplikaci, po 2
měsících po aplikaci se již morfologie upravila. Ostatní parametry kvality
ejakulátu nebyly výrazněji ovlivněny.

22. Konzervace semene „s problémy“
Odběr po smrti psa (či po orchidektomii)
• po smrti zvířete je odběr epididymálních spermií jediným možným řešení, jak získat
spermie použitelné pro kryokonzervaci a pozdější inseminaci (publikovány úspěšné
případy inseminací fen – i když zatím ojedinělé)
• varlata po orchidektomii, provedené z jakýchkoli důvodů (např. onemocnění
prostaty, při němž často dochází k hematospermii a ve zvýšené míře k mikrobiální
kontaminaci semene, což snižuje přežitelnost spermií během konzervace)
• pokud není možné spermie z nadvarlat odebrat ihned, je potřeba celá varlata s
nadvarlaty správně uchovat (především zabránění oschnutí vzorku) a co nejrychleji
transportovat při teplotě 5 až 10 °C do laboratoře ke zpracování. Takto lze spermie
psa z nadvarlat odebrat, bez významné alterace jejich mrazitelnosti, nejpozději do
24 h od smrti zvířete či jeho kastrace
• kryokonzervační proces poškozuje epididymální spermie více než ejakulované. Také
procento zabřezávání po inseminaci je výrazně nižší. Maximální dosud v literatuře
zveřejněná pohyblivost rozmrazených epididymálních spermií psa byla 40 %. Dopad
na mrazitelnost a plodnost mají samozřejmě i abnormality spermiogramu, které by
se vyskytly, i kdyby spermie byly ejakulované.

23. • převoz varlat v šourku na ledu do laboratoře
• posouzení varlat a nadvarlat
• preparace varlat z obalů, odnětí ocasu nadvarlat
• zpracování nadvarlat a získání spermií
• analýza získaného vzorku spermií
Postup získání nadvarletních spermií

24. Parametry a výroba inseminační dávky
• kvalita dávky záleží na stavu semene (čerstvé, chlazené, mrazené) a
deponování semene do reprodukčních cest feny [vagina, děloha (tělo,
rohy), vejcovod]. Oplození nastává ve vejcovodu.
• IUI zvýší šanci oplodnění při použití nativního semene špatné kvality
(převážně při malém počtu spermií)
• množství spermií je potřeba menší, čím je jejich deponování blíže místu
oplodnění
• bereme v potaz množství morfologicky normálních a pohyblivých spermií
• inseminační dávka (ID) pro IUI min. 100 mil. morfol. normálních a po
rozmrazení motilních spermií, pro vaginální UI min. 200 mil. normálních
a motilních čerstvých spermií
• objem ID záleží na místě deponování semene a velikosti feny
(optimálně vagina 2 až 5 ml, děloha max. 2 ml, vejcovod 0,02 ml)

25. Faktory ovlivňující úspěch umělé inseminace
• kvalita semene, fertilizační schopnost psa
• fertilizační schopnost feny, zdravotní stav (reprodukčně
bezproblémové zvíře, doporučuji mít fenu vyšetřenou mikrobiologicky
(vaginální stěr – bakteriologická kultivace, Mycoplasma canis)
• načasování inseminace
• místo deponování semene a inseminační technika
• péče o fenu po inseminaci
• při maximálním zajištění všech požadavků je úspěšnost IUI mrazeným
semenem vysoká (s u nás mrazeným semene kolem 80% bez ohledu
na zdrav. stav feny a typ intrauterinní inseminace).

26. Vývoz semene do zahraničí
• podmínky dovozu semene si stanovuje každá země sama
• státy EU nemají většinou specifické podmínky pro dovoz z ČR, stejně tak
USA. Některé země naopak mají přísné podmínky dovozu a vyžadují i tzv.
Import Permit
• je třeba počítat s tím, že vyřízení všech potřebných věcí v případě mrazeného
semene zabere dost času a nenechávat vše na poslední chvíli (hárání feny)
• potřebné dokumenty spojené s transportem semene zařídí veterinář
vyhotovující inseminační dávky
• druhy kontejnerů na transport mrazeného semene: jednorázový (4 denní),
vratný (8 denní, 2 týdenní, 3 týdenní)
• poskytované kontejnery na tekutý dusík musí být "Dry shipper, non
hazardous, not restricted acc. to IATA special Provision A152"
• pro transport chlazeného semene se běžně používá neoporový box s výdrží
cca 40 h (dle teploty vnějšího prostředí)

27. Dovoz semene psa do ČR
• Je potřeba splnit požadavky Státní veterinární správy ČR pro import
semene ze zahraničí (www.svscr.cz).
• Při dovozu semene ze třetích zemí je nutné min. 15 dní přede dnem
předpokládaného dovozu podat na SVS ČR (epodatelna@svscr.cz)
žádost o vydáni dovozního povolení obsahující informace:
1) Plemeno psa dárce
2) Že se jedná o zmrazené sperma
3) Počet dávek spermatu
4) Místo odeslání příp. i místo odběru spermatu
5) Místo určení v České republice
6) Jméno a adresa žadatele včetně případné korespondenční adresy
7) Účel dovozu v žádosti, aby jej zohlednili při stanovování veterinárních
podmínek dovozu (že nejde o zboží pro obchodní účely)

28. Potřebné dokumenty pro import semene do
ČR ze třetích zemí
1. Veterinární osvědčení, které musí zásilku při dovozu
doprovázet, a které potvrzuje veterinární lékař vyvážející
země. Toto poskytuje SVS ČR na základě žádosti o dovozní
povolení.
2. Dovozní povolení (SVS ČR)
3. SVVD (společný veterinární vstupní doklad) – první část
musí být doručena (e-mailem, faxem) den před příchodem
zásilky na Pohraniční veterinární stanici (PVS) Ruzyně –
zajišťuje transportní firma.

30. Děkuji za pozornost
Kontakt:
Laboratoř spermatologie a andrologie
Oddělení genetiky a reprodukce
Výzkumný ústav veterinárního lékařství
Hudcova 70
621 00 Brno - Medlánky
MVDr. Petra Přinosilová, Ph.D.
tel.: +420 777 786 828
email: prinosilova@vri.cz
www.frozendogs.com