Society of Evolutional Studies, Japan Annual meeting O03-03 2019/8/7

1. Myodonta-specific 4.5SH gene cluster
is
essential for mouse developemnt
Myodonta属特異的4.5SHクラスタは
マウスの発生に必須である
山本育子1、杉本道彦2、荒木喜美2、鈴木雄3、小林武彦3、○中川真一1
(1北海道大学、2熊本大学、3東京大学)
2019/8/7 日本進化学会 O03-03

2. 4.5SHとは？
• 発現量の多い核内ノンコー
ディングRNA (104 /cells)
• ユビキタスな発現・核スペッ
クルに局在
• マウス・ラットなどの小型・
短命齧歯類特異的遺伝子
• レトロトランスポゾンSINE
B1と高い相同性
4.5SH
B1 GCCGGGCATGGTGGCGCACGCCTTTAATCCCAGCACTTGGGAGGCAGAGGCAGGCGGA
4.5SH GCCGGTTGTGGTGGCGCACGCCGGTAGGATTTGC-TGAAGGAGGCAGAGGCAGGAGGA
***** ************** ** ** *************** ***
B1 TTTCTGAGTTCGAGGCCAGCCTGGTCTACACAGTGAGTTCCAGGACAGCCAGGGCTAC
4.5SH TCAC-GAGTTCGAGGCCAGCCTGGGCTACACATTTTTTT-------------------
* * ******************* *******

3. 4.5SHの分子機能モデル
Ishida et al. Genes Cells (2014)
4.5SH KD → 細胞質asB1↑
sB1 mRNAs asB1 mRNAs
ノザンブロット
解析

4. ···NNNNN···
4.5SHはMBサイズの
タンデムクラスタを形成している
Ezh2 Pdia4
/ /
chr6 NNRV RVS S
4.5SH cluster
4.5SH
RI RI RI
4.5SH 4.5SH
MEF 3T3
945 kb
RV N S RV N S
Pulse Field Gel Electrophoresis
パルスフィールド電気泳動
~900 kb
= 4.2 kb x ~200 copies
5 kb
4 kb
RI
4.2 kb
Conventional Gel Electrophoresis
通常のアガロースゲル電気泳動

5. 4.5SHノックアウト(KO)マウスの
作製
Homologous recombination
PCR check primers
相同組換え
チェックPCR
PGK-NeO-
pA
4.5SH cluster (~0.9Mb)gRNA1 gRNA2
PGK-NeO-
pA
//
////
//
Random integration
PCR check primers
ランダム挿入
PCRチェック

6. CRISPR-Cas9の併用により
MB欠損変異を高効率で作製可能
相同組換えあり
63/74 (85%)
ランダム挿入あり
59/74 (80%)
10 653
5
12.8% (10/74)
で目的の変異を確認

7. 4.5SH KOマウスは胎生致死となる
WT +/-
Brain RNA
WT +/-
KO
PPP
WT
4.5SH cluster
…
サザンブロットによる
組換えチェック
ノザンブロットによる
発現低下チェック
WT +/- KO
Adult
(3w)
25 34 0
Embryo
(E9.5)
3 6 0
ヘテロマウスを用いた解析 メンデル比

8. 4.5SH KOマウスは胎生致死となる
E6.5 WT E6.5 KO
4.5SH/DAPI 4.5SH/DAPI
DAPI DAPI

9. 4.5SH KOマウス胚は
桑実期胚まで発生する
4.5SH FISHDIC
From Kojima et al.
Semi Cell Dev Biol 34, p65- (2014)
E3.5-E5.5

10. 4.5SH KOマウス由来のES細胞
コロニーは形態異常を示す
#1 WT #7 WT #29 KO #30 KO

11. 4.5SHクラスター欠損で
隣接遺伝子の発現は変動しない
Ezh2 Pdia4
/ /
4.5SH cluster (~0.9 Mb)
······
Ezh2 Pdia4
/ /······
WT
KO

12. 進化的考察
SINE B1は進化のCapacitorか？
非翻訳領域
asSINE B1挿入による
遺伝的多型
asSINE B1挿入遺伝子の
発現低下による
表現型多形
4.5SH
クラスターの
出現

13. 進化的考察
SINE B1は進化のCapacitorか？
4.5SH仮説HSP仮説
HSP: 変異の蓄積を許容
（capacitor)
遺伝的多型の蓄積
↓
ストレス・HSP機能低下時
(actuator)
表現型多型の顕在化
非翻訳領域へのSINE B1挿入
（capacitor)
遺伝的多型の蓄積
↓
4.5SHクラスターの出現
(actuator)
表現型多型の顕在化
HSP90-buffered traits UTR-buffered traits