2. Основные аналиты, определяемые
иммунотурбидиметрическим методом
САХАРНЫЙ ДИАБЕТ
ЛИПИДНЫЙ ОБМЕН
БЕЛКИ ОСТРОЙ ФАЗЫ
ИММУННЫЙ СТАТУС
Гликозилированный гемоглобин
Альбумин (в моче)
Иммуноглобулин G
Иммуноглобулин М
Иммуноглобулин А
Комплемент С3
Комплемент С4
Аполипопротеин AI
Аполипопротеин В
Липопротеид (а)
С-реактивный белок
α1-Кислый гликопротеид
Α1-Антитрипсин
Фибриноген
МАРКЁРЫ ИНФЕКЦИОННЫХ И
ИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Ревматоидный фактор
Антистрептолизин О
3. Турбидиметрия – это …
метод исследования светорассеивающих
(мутных) растворов и определения
концентрации веществ в них по
интенсивности прошедшего через
исследуемый раствор светового потока.
9. Калибровочная кривая
- измерения проводят на восходящем участке кривой
- используют несколько способов интерполяции
- качество «подгонки» кривой проверяется по отклонению
от истинного значения в контрольных материалах
линейная
кубический
полином
сплайн
логит-регрессия
С (конц.)
А (опт. плотн.)
С1 С2 С3 С4 С5
А4
А3
А2
А1
А5
10. Калибровочный график строится для каждого индивидуального
белка, для каждого прибора, при любом изменении условий
регистрации и периодически по мере проведения исследования.
Калибровочный график в виде прямой: скорее исключение,
чем правило.
С (конц.)
А (опт. плотн.)
С1 С2 С3 С4 С5
А4
А3
А2
А1
А5
С (конц.)
А (опт. плотн.)
С1
А1
Калибровочная кривая
11. Методы измерения
Развитие мутности
(увеличение абсорбции) во
времени.
Абсорбция
Время
Конечная точка – измерение проводят относительно холостой
пробы.
Кинетика – измерение скорости реакции.
Фиксированное время – первое измерение вскоре после начала
реакции, второе – через 3-5 минут. Возможно измерение первой
точки до начала реакции.
12. Эффект прозоны
Определение проводится в зоне избытка антител.
Прозона - зона избытка антигена
При высокой концентрации белка пробу необходимо разбавить и
провести повторное измерение.
Абсорбция
Концентрация
калибровочные
сигналы
15. Сравнение методов
ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОД
IT Latex-IT ИФА
Специфичность +++ +++ +++
Чувствительность + ++ +++
Автоматизация +++ +++ +++
Время анализа 10 мин 10 мин 1-2 часа
16. Аналитические характеристики
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ – минимальное содержание аналита,
достоверно определяемое набором.
КОЭФФИЦИЕНТ ВАРИАЦИИ – относительный показатель
разброса результатов определения аналита, рассчитанный как
отношение среднеквадратичного отклонения к
среднеарифметическому, %.
ОБЛАСТЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ – интервал концентраций аналита
внутри которого его можно правильно определять при помощи
данного набора с отклонением от истинного значения не
превышающим К.В.
ПРОЗОНА – нисходящая зона кривой доза-ответ, в которой
определяемая концентрация аналита будет не верна.
19. Присутствует в крови в норме у здоровых людей.
Доказана прогностическая значимость СРБ в оценке
риска развития сердечно-сосудистых заболеваний.
СРБ
Увеличение концентрации СРБ в пердела нормальных
значений является индикатором атеросклероза (3-10 мг/л).
Самостоятельный метод (высокочувствительный СРБ).
20. СРБ
Диагностика воспаления (нормальная концентрация СРБ
исключает острое воспаление у взрослых).
Контроль эффективности лечения - антибиотикотерапия.
Осложнения, персистенция возбудителей инфекции.
Дифференциальная диагностика бактериальных и
вирусных инфекций.
22. СОЭ лейкоцитарная реакция
- не специфична для
острофазного ответа
- долгое время сохраняется
высоким после выздоровления
- показания меняются при анемии
- пожилой возраст
и т.д.
- не возникает при локальном
воспалении
- не выражена при вирусном
воспалении
- реагирует на тяжелую
физическую нагрузку
и т. д.
СРБ
23. РФ
РФ используется для диагностики и мониторинга
ревматоидного артрита.
Аутоантитела, принадлежащие ко всем классам иммуноглобулинов, способные
связываться с Fc-фрагментами измененных или комплексированных молекул
IgG человека.
Выявляется у 70-80% пациентов с РА. 20% - «серонегативный» РА.
Определяется через 3-6 месяца после начала заболевания.
Высокий титр – прогрессирующее течение, неблагоприятный прогноз.
Обязательный критерий при обследовании
пациентов с ревматоидным артритом (РА).
24. Диагностика
Оценка тяжести процесса
Выбор тактики лечения
Оценка эффективности проводимой
терапии
ЗДОРОВЫЕ ЛЮДИ
среднего возраста – 2%
старше 65 лет – 20%
старше 80 лет – 30%
РФ
25. Альбумин в моче
Определение альбумина в моче – единственный рутинный метод,
позволяющий диагностировать начинающееся поражение клубочков,
канальцев почек или нарушении селективности фильтрации ионов по заряду.
ДН-специфическое поражение почек при сахарном
диабете, сопровождающееся формированием узелкового
или диффузного гломерулосклероза, терминальная
стадия которого характеризуется развитием
хронической почечной недостаточности (ХПН)
ДН в терминальной стадии приводит к инвалидизации и
затем к смерти
ДН с частотой 40-50% осложняет СД 1 и в 15-30% СД
26. Стадии развития ДН по C.E. Mogensen
Стадия ДН
Выделение
белка,
мг/л
Характеристики
почки
Сроки развития
от начала
заболевания СД
1. Стадия гиперфункции
N
МАУ < 20
Гипертрофия почек, увеличение почечного
кровотока
В дебюте СД
2. Стадия начальных
структурных изменений
N
МАУ < 20
Утолщение базальных мембран капилляров
клубочков, расширение мезангиума
> 2-5 лет
3. Стадия начинающейся
ДН
МАУ
(20-200)
Углубление морфологических изменений > 5 лет
4. Стадия выраженной ДН ПУ > 350 Не менее 50% клубочков склерозировано > 10-15 лет
5. Стадия уремии ПУ ≥2000
Тотальный гломерулосклероз. Самоотравление
организма продуктами обмена веществ.
> 15-20 лет (5-7 лет
после начала ПУ)
Альбумин в моче
27. Только первые 3 стадии ДН могут быть обратимыми при рано
начатом лечении.
Для своевременной диагностики необходимо использование
высокочувствительных методов, позволяющих выявлять
небольшие количества альбумина в моче.
На стадии протеинурии терапия нарушений углеводного
обмена уже не способна остановить или существенно
затормозить быстрое прогрессирование ДН.
Определение уровня общего белка наиболее эффективно на
стадии протеинурии.
Следует помнить
28. Тест на
протеинурию
Тест на МАУ
да
нет
нет
ДН стадия МАУ Ежегодный
скрининг на МАУ
Лечение
Критерий назначения: стаж диабета
ПГК 80-120 мг/л (31%)
Оценка информативности
методов определения МАУ для
ранней диагностики ДН у
пациентов с СД 2 типа
ГОУ ВПО НГМУ Росздрава; МБУЗ
ГКБ №1, ЗАО «Вектор-Бест»
Альбумин в моче
Квота на анализ: 0,5
33. прогрев инкубация
S M считывание
R1 R2
инкубация
Счит.1
задержка
R M
S Счит. 2
прогрев
Editor's Notes
На сегодняшний день иммунотурбидиметрический анализ индивидуальных белков сыворотки крои, мочи и СМЖ широко используется в лабораторной практике. Этот метод позволяет получить данные, имеющие не только диагностическое, но и прогностическое значение, а также может быть использован для мониторинга течения многих заболеваний, тем самым способствую оперативной коррекции их терапии.
С помощью этого метода определяют такие показатели, как ….(по слайду).
Турбидиметрия – метод исследования мутных растворов и определения концентрации веществ в них по интенсивности прошедшего светового потока через исследуемый раствор. Главное преимущество такого подхода заключается в быстроте проведения анализа при сравнительно большой точности.
Для определения индивидуальных белков используется способность специфических антител образовывать комплексы с данными белками. При этом процесс взаимодействия антиген-антитело не останавливается на образовании одного комплекса – напротив, в результате реакции получается разветвленная сеть – другими словами - преципитат.
Оптическая схема детекции при турбидиметрии сходна с таковой при фотометрии. Световой поток проходит через исследуемый образец. При этом свет будет наталкиваться на частицы в растворе, и часть его будет изменять свое направление, отклоняясь под различными углами, т.е. рассеиваться. Рассеяние света зависит от длины волны света, размера частиц, их формы, количества. Таким образом, световой поток, прошедший через мутный раствор, будет делиться на прошедший и рассеянный. Интенсивность прошедшего света детектируется фотоприемником. На основании разницы между начальным и прошедшим светом будет устанавливаться «оптическая плотность» исследуемого раствора.
В качестве турбидиметра можно использовать большинство фотометров и биохимических анализаторов, так как этот способ не требует особой конструкции прибора. Существенным требование к такому оборудованию является лишь наличие в программе возможности определять концентрацию веществ по нелинейной калибровочной зависимости.
Реакция антиген-антитело, которая лежит в основе иммунотурбидиметрического анализа, проявляется в растворе в виде образования агрегатов. На слайде представлен график классической преципитационной кривой Хейдельберга-Кендалла. Эту кривую можно разделить на 3 зоны:
Зона, где наблюдается избыток антител. Величина преципитата увеличивается по мере добавления антигенов, при этом в растворе остаются свободные антитела.
Следующая зона – это зона эквивалентности, где концентрация антигенов и антител одинакова. Здесь наблюдается максимальный уровень преципитапции, в растворе не остается свободных ни антигенов, ни антител.
При дальнейшем увеличении концентрации антигенов количество антител бывает не достаточным для полного связывания антигенов, что ведет к измельчению размера иммунных комплексов, а в раствор остаются свободные антигены. Такое состояние системы называется зоной избытка антигена.
Таким образом, зависимость концентрации антигена от количества образовавшихся комплексов носит сложный и нелинейный характер, как и во многих других иммуноисследованиях.
Поэтому чтобы определить концентрацию какого-либо антигена необходимо сначала построить калибровочный график. Для этого используют набор калибровочных образцов, охватывающих область возможных измерений концентраций антигена в исследуемой жидкости. Искомую концентрацию рассчитывают, сопоставляя сигналы от калибраторов и пробы.
Однако не существует единственной математически определенной кривой, связывающей точки калибровки «правильным» способом. Однако чаще всего используют линейную интерполяцию точка за точкой, гиперболические и экспоненциальные уравнения.
Математическое построение кривой калибровки требует от 3 до 6 калибраторов. Анализ образцов с сигналом, выходящим за пределы самого высокого или самого низкого калибратора, должны быть повторены, т.к. значение не может быть определено точно на математически расширенной калибровочной кривой.
Необходимо помнить, что турбидиметрические показатели могут иметь существенные расхождения на разных анализаторах, вследствие различий в конструкции приборов. Поэтому калибровочный график строится для каждого индивидуального белка, для каждого прибора, при любом изменении условий регистрации и периодически по мере проведения исследования.
Иногда производителям удается найти такое равновесие между количеством антител в реагенте и областью определения антигена, когда калибровочный график может быть описан как прямая линия. В этих случаях достаточно и одного калибровочного образца. Производитель реагентов для турбидиметрии указывает, какое количество калибровочных точек необходимо.
Наборы реагентов для определения концентрации специфических белков иммунотурбидиметрическим методом позволяют проводить измерения по конечной точке, когда реакция образования иммунных комплексов пришла в равновесие, и мутность раствора не изменяется.
Можно измерять скорость реакции в течение определенного промежутка времени начиная с момента, когда антиген и антитела вступили во взаимодействие. Однако нужно помнить, что скорость реакции непостоянна.
Чаще всего используют метод фиксированного времени, когда первое измерение проводится вскоре после начала реакции, а второе через 3-5 минут. Однако при этом существует возможность первой регистрации результата непосредственно перед добавлением антител и запуском реакции.
Обычно состав реакционной смеси подбирается таким образом, чтобы определение проводилось в зоне кривой, обозначенной как зона избытка антител. При очень высоких концентрациях антигена в пробе антител не хватает, и определение попадает в нисходящую часть кривой, в которой при увеличении концентрации белка сигнал прибора уменьшается. Эта зона обозначается как прозона. При измерении в прозоне могут быть получены не правильные результаты. В таких случаях во избежание ложных результатов, пробу необходимо развести и повторить анализ.
Многие современные приборы способны отслеживать и определять избыток антигенов автоматически.
Для расширения допустимого диапазона измерений аналита применяют два подхода. Один из них – это усиление сигнала воднорастворимыми полимерами. Чаще всего используют полиэтиленгликоль-6000. Присутствие в реакционной смеси коллоида создает определенную вязкость раствора, молекулы ПЭГ заполняют часть объема реакционной смеси, и относительная концентрация белка в таком растворе становится выше и реакция взаимодействия антигена и антитела проходят значительно быстрее.
Главный эффект, достигаемый за счет использования водорастворимых полимеров, - это ускорение реакции. Что в свою очередь ведет к получению более высоких сигналов, увеличению прозональной безопасности и повышению чувствительности определения примерно в 2-5 раз.
Второй способ – это усиление сигнала латексными частицами. Латексом называют полистирольные частицы сферической формы размером 50-1000 нм. Поверхность частиц покрывают антителами. В ходе реакции образуется преципитат из соединенных между собой шариков латекса, посредством мостика из антигена и антитела.
Такой подход применяется в тех случаях , когда физиологическая концентрация определяемого белка низкая, поэтому иммунных комплексов при анализе образуется мало. В таком случае наличие латексных частиц позволяет достичь большего размера преципитата, что в свою очередь ведет к повышению чувствительности метода.
Иммунотурбидиметрия заняла прочное место среди других методов анализа индивидуальных белков. Если говорить о преимуществе турбидиметрии по сравнению с ИФА, то можно отметить следующее:
Для его использования пригоден любой фотометр, турбидиметрические наборы легко адаптируются к биохимическим анализаторам;
Отличается простотой и высокой скоростью проведения анализа.
Недостатком же считают – невысокую чувствительность в сравнении с ИФА. Однако все зависит от целей. Для белков, которые на данный момент предлагается количественно определять с помощью иммунотурбидиметрических методов, выявление более низких концентраций не требуется. Т.е. данный метод является по сути дела оптимальным решением задачи.
Контроль правильности и воспроизводимости результатов анализа проводят с помощью контрольных материалов, в качестве которых используют контрольные сыворотки, содержащие индивидуальные белки, концентрация которых определена турбидиметрическим методом.
Контроль качества осуществляют в соответствие с приказом Минздрава РФ № 220 и соответствующим отраслевым стандартом.
Кроме того, калибраторы, которые либо входят в состав наборов, либо предлагаются фирмами отдельно, должны прослеживаться до стандартов высокого уровня, например рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения.
С-реактивный белок – один из основных белков острой фазы воспаления. Он состоит из 5 идентичных нековалентно связанных полипептидных цепей, образующих замкнутый пентамер.
Синтез белка происходит в печени в ответ на повреждение тканей организма. Уровень СРБ быстро и многократно увеличивается в ответ на воспалительные реакции различной природы и локализации, а так же при паразитарных инфекциях, травмах и опухолях. Причем концентрация в крови при развитии острофазного ответа увеличивается очень быстро – в первые 6-12 часов, а максимум достигается на 2 сутки. При выздоровлении концентрация СРБ быстро снижается.
С-реактивный белок присутствует в крови в норме практически у всех здоровых людей. Однако незначительное, находящееся в пределах нормальных значений увеличение концентрации СРБ является индикатором атеросклеротических изменений сосудов и может служить маркером данной патологии. За последние несколько десятилетий было проведено множество исследований, доказывающих прогностическую значимость СРБ в оценке риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и связанных с ними осложнений.
Нужно помнить, что для обнаружения хронического вялотекущего сосудистого воспаления используется самостоятельный метод, который называется высокочувствительный СРБ. Аналитические характеристики таких наборов позволяют установить небольшое колебание концентрации СРБ в крови, не связанное с острофазным ответом.
Показаний для определения СРБ по стандартам оказания медицинской помощи много. Повышение уровня СРБ в сыворотке крови не является характерным признаком какого-либо определенного заболевания, оно служит неспецифическим показателем воспаления.
СРБ в первую очередь используется для диагностики ряда заболеваний, мониторинга течения болезни и эффективности лечения. Преимуществом теста на СРБ является то, что увеличение концентрации происходит быстро. Также быстро конц СРБ снижается при правильно подобранной терапии. С помощью данного показателя можно быстро и эффективно подобрать необходимый антибиотик не прибегая к микробиологическим исследованиям.
Кроме того, если уровень СРБ остается высоким и не имеет тенденции к снижению, то это свидетельствует о персистенции воспалительного процесса, например, в следствие осложнений при операции. (Однако, если уровень остается высоким или поднимается – это свидетельствует о том, что в организме сохраняется воспалительный процесс и указывает на неадекватное лечение или осложнения.)
По уровню СРБ также есть возможность дифференцирования вирусных и бактериальных инфекций.
По концентрации СРБ можно ориентировочно судить о тяжести заболевания. Например, при местных бактериальных инфекциях он не будет превышать 50 мг/л, при острой форме – будет более 50 мг/л, при крайне тяжелых генерализованных инфекциях – в районе 300 мг/л.
СРБ имеет преимущества перед определением СОЭ и лейкоцитоза. Величина СОЭ может изменятся под действием множества факторов – т.е. не является специфичным показателем воспалительного ответа. Лейкоцитарная реакция не возникает при локальном воспалении и не выражена при вирусных инфекциях.
К ревматоидному фактору относят иммуноглобулины человека разных классов, которые способны связываться с Fc-фрагментами измененных или комплексированных молекул иммуноглобулина G человека.
Определение РФ в крови человека широко используется в медицинской практике для диагностики и мониторинга ревматоидного артрита (РА) [системное заболевание, которое ведет к постепенному разрушению хрящевых и костных тканей организма].
Ревматоидный фактор выявляют у 70-80% больных с РА. Однако в 20-30% случаев РФ не выявляется на протяжении всей болезни, такой ревматоидный артрит называют «серонегативным».
Увеличение концентрации РФ в сыворотке крови выявляется через 3-6 месяцев после начала заболевания. Высокий титр РФ связан с прогрессирующим течением болезни и указывает на неблагоприятный прогноз.
Как и в случае с СРБ, РФ используется как для диагностики, так и для мониторинга течения болезни, для выбора тактики лечения и эффективности проводимой терапии.
Нужно заметить, что РФ не является специфическим показателем РА. Повышенный уровень РФ найден у 1-2% здорового населения моложе 60 лет и с возрастом выявляемость РФ у человека увеличивается. Более того, увеличение концентрации РФ в крови может происходить при ряде других заболеваний: СКВ, синдром Шегрена, инфекционный эндокардит, и др.
У здоровых людей выявляется ….
В качестве примера я хотела бы представить определение альбумина в моче для диагностики такого распространенного заболевания почек как ДН.
В норме почки задерживают альбумин, который, однако, можно обнаружить в моче в следовых количествах. Выведению альбумина с мочой препятствуют большой размер (69 кДа), отрицательный заряд его молекулы и реабсорбция в почечных канальцах.
Экскреция альбумина возрастает при поражении клубочков, канальцев или нарушении селективности фильтрации ионов по заряду.
Небольшое повышение экскреции альбумина с мочой называемое микроальбуминурией, является исключительно важным признаком для ранней диагностики и мониторинга диабетической нефропатии, которая является одним из наиболее тяжелых и прогностически неблагоприятных осложнений сахарного диабета (СД). ДН примерно с частотой 40-50 % осложняет СД 1 и 15-30% 2 типа.
Напомню. Существует несколько удобных и адекватных классификаций ДН по стадиям.
Наиболее детальная классификация ДН была разработана датским исследователем Mogensen C.E. (1983) и выделяет 5 стадий ДН.
Стадия гиперфункции почек – характеризуется гиперфильтрацией (увеличением СКФ более 140 мл/мин), увеличением почечного кровотока, гипертрофией почек, нормальной альбуминурией (менее 30 мг/сут. или менее 20 мг/л) и может развиться уже в дебюте диабета.
Стадия начальных структурных изменений почек – характеризуется утолщением базальных мембран клубочков, расширением мезангия, гиперфильтрацией (сохранением высокой СКФ), нормальной альбуминурией, развивается обычно в срок более 2-х лет с момента дебюта диабета.
Стадия начинающейся ДН – характеризуется микроальбуминурией (от 30 до 300 мг/сут.), нормальная или слегка завышенная СКФ, развивается в срок более 5 лет после дебюта диабета.
Стадия выраженной нефропатии – характеризуется протеинурией, снижением СКФ, артериальной гипертензией, необратимым склерозом не менее 50% клубочков и развивается в срок 10-15 лет после начала заболевания.
Стадия уремии – характеризуется снижением СКФ (менее 10 мл/мин) тотальным гломерулосклерозом. Нарастанием азотэмии. Развивается в сроки более 15 лет от начала заболевания или 5-7 лет от появления протеинурии.
Следует помнить
Только первые 3 стадии ДН могут быть обратимыми при тщательно и рано начатой коррекции гипергликемии.
На стадии протеинурии даже самая тщательная терапия нарушений углеводного обмена уже не способна остановить или существенно затормозить быстрое прогрессирование ДН.
Своевременная диагностика ДН на ранних стадиях представляет собой очень важную задачу.
Да данный момент выявление ДН напрямую зависит от длительности СД. По стандартам оказания медицинской помощи квота на данный анализ составляет 0,5 – т.е. только половина больных сахарным диабетом может пройти обследование на микроальбуминурию. При формировании группы риска эндокринологи опираются исключительно на стаж СД. При этом больного проверяют на протеинурию, если таковая не обнаружена, то больного необходимо обследовать на микроальбуминурию.
Нами совместно с НГМУ и ГКБ №1 города Новосибирска было проведено небольшое исследование, в результате которой мы выяснили, что 30% пациентов с нормальным количеством выделяемого белка с мочой, а именно в пределах от 80 до 120 мг/л, определенного методом с ПГК, уже имеют патологический уровень альбумина в моче. Таким образом, нам удалось сформировать дополнительные параметры формирования группы риска, отличные от стажа диабета.
Жидкие готовые к использованию реагенты
Анализируемые образцы – моча человека.
Калибратор входит в состав набора.
Высокая стабильность реагентов (срок годности 2 года).
Диапазон измерений – до 400 мг/л.
Нормальные значения – до 25 мг/л, до 30 мг/сут.
Современный иммунотурбидиметрический метод.
Применяется усиление латексными частицами.
Калибратор входит в состав набора.
Калибровка осуществляется по 1 концентрации калибратора (СРБ).
Адаптируется к любому анализатору открытого типа.
