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研究スライド
- 1. 抗微生物光線力学療法による 緑膿菌敗血症予防に関する研究 Study on the prevention of pseudomonas aeruginosa sepsis by antimicrobial photodynamic therapy 西舘研究室 氏名：石渡直人
- 3. 光線力学療法（Photodynamic Therapy，PDT) PDTの作用過程 対象に傷害を 与える． 光 増 感 剤 ¹ M 光 励起三重項状態 ３ M* 励 起 一 重 項 状 態 ¹ M * 溶 存 酸素 3 O * 一重項酸素 1 O*エ ネ ル ギ ー 光と光増感剤の光化学反応を用いた治療法 PDTとは 緑膿菌（PDT前） 緑膿菌（PDT後） PDT適用 ■薬剤耐性菌にも有効 ■抗菌スペクトルが広い． 特徴 細菌を対象とした抗微生物PDT （antimicrobial PDT, aPDT)が 新たな感染制御法として期待される
- 6. 光増感剤の選定 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 500 550 600 650 700 HbO2 Hb MB 波長(nm) 665 nm HbO2(酸素化ヘモグロビン)，Hb(脱酸素化ヘモグロビン)， MBの吸収スペクトル[1] 最大吸収波長 665 nm 励起光の組織 侵達長大 [1] A. Hirao, et al., Photochem. Photobiol, 86, 426-430（2010）. 陽イオン性 陰イオン性の 菌の細胞膜と結合 特徴 容易に入手可能 モル吸光係数（×104/cm・M） 0 1 2 3 4 5 6 7 8 メチレンブルー（MB）を採用
- 7. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 500 550 600 650 700 LEDの発光 スペクトル MBの吸収 スペクトル ■素子数：3×6 光源の選定 14.5 cm 6.9cm ■中心波長：665 nm 安価で入手可能 照射光強度（a.u.） モル吸光係数（×104/cm・M） 665 nm ■照射光強度：最大45 mW/cm2（可変） ■スペクトル幅(半値幅)：17 nm 波長(nm) 広範囲に照射可能 LEDアレイを採用
- 9. 皮膚全層にⅢ度熱傷作製 （背面の約40 cm2） 熱傷部に緑膿菌液塗布 （5.0×107 CFU/mL，200 mL） メチレンブルー塗布 （750 mM，DMSO25%，100 mL） 光照射開始（LEDアレイ，45 mW/cm2） 6 cm 2cm 感染領域 15 45 55 6回繰り返し実施 PDTにより褪色 照射終了65 創部表面の菌数評価 肝臓内および血中の菌数評価5日後 適用直後 1日後 3日後 熱傷創部 0 時間（分） aPDTの敗血症予防効果検証（実験方法）
- 12. 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09 1E+10 day0 day1 day2 day3 day4 day5 非治療群(n=9-11) 治療群(n=7) 108 106 104 100 創部の生存菌数（CFU/mL） 102 1010 *：p＜0.01（Mann-Whitney U test） * * ・創部の生存菌数はday0，day1に おいて適用群の方が2桁ほど少なく， 統計学的有意差も見られた． ・3日目以降で細菌が同程度まで 増殖し，有意差も見られなくなった. day1までは創部感染を制御 できているが，完全に制御は できなかった． aPDT適用からの日数 予防効果の評価 非適用群（n=9-11） 適用群（n=7）
- 13. 考察 何故細菌が増え，敗血症を予防できなかったのか？ 500 µm 感染創部のグラム染色結果 （赤い染色が緑膿菌の存在を示す．） 約600 µm MB 酸素 光 ＝ 殺菌効果 殺菌効果が不十分 細菌の分布範囲で光， MB，酸素が不足していた 可能性が考えられる．
- 15. ご清聴ありがとうございました．
- 17. Ⅲ度熱傷 Ⅲ度熱傷マウスモデル ・645 nm or 460 nm ・24 J/cm2 ・菌の血中移行を防げていない． ・創部から血中への菌移行を模擬 できていない． ・対象が小さいため，人への臨床 応用に適していない． 30分 血中の緑膿菌数 課題点 [1] Maria C. E. Hashimoto. et al, Photochemistry and Photobiology, 2012, 88: 590–595 緑膿菌液(3.9×109CFU/ml) HB:La+3(0.1 M/L) 光照射（2分間） 5分 先行研究[1] LED
Editor's Notes
- 事故や災害により発生する重症外傷には切傷，挫滅傷，裂傷，骨折，熱傷など様々な症例があるが，中でも広範囲熱傷患者は免疫系の恒常性が破たんし，また皮膚のバリア機能も損なわれるため，感染症を発症し敗血症に陥る恐れがあります．敗血症とは創部の病原菌が血中，体内へと侵入していき重篤な全身症状を引き起こす病で，重症化すると敗血症性ショックや多臓器不全を引き起こし死に至ります．敗血症を防ぐためには創部から血中への菌移行を阻止，つまり創部感染を制御する必要があります．しかし多剤耐性緑膿菌やメチシリン耐性黄色ブドウ球菌といった薬剤に対する耐性を獲得した薬剤耐性菌の出現により抗菌剤を使用した従来の方法による感染の制御は困難となっています．そのため抗菌剤によらない新たな感染制御法が求められています．
- そこで私が着目したのが光線力学的療法，PDTです．PDTとは，光と光増感剤の光化学反応を用いた治療法のことを指します．具体的な作用過程はこちらの図になります．まず光の照射により光増感剤が励起一重項状態へ励起されます．励起一重項状態の光増感剤は励起三重項状態へと自然遷移し，溶存酸素へエネルギーを移乗します．そしてエネルギー移動により溶存酸素が一重項酸素へと励起されます．PDTではこの一重項酸素の強い酸化力を利用して対象に傷害を与えます．PDTは薬剤耐性菌に有効であり，抗菌スペクトルが広い治療法であることから，細菌を対象とした抗微生物PDT，A-PDTが新たな感染制御法として期待できます．
- 光増感剤としてメチレンブルーを採用した理由について説明いたします．こちらの図は，酸素化ヘモグロビン，脱酸素化ヘモグロビン，メチレンブルーの吸収スペクトルを示したものになります．縦軸がモル吸光係数，横軸が光の波長を表しています．この図から，メチレンブルーの最大吸収波長は脱酸素化ヘモグロビンと酸素化ヘモグロビンの吸収波長と重複していない665nmであることがわかります．このことからメチレンブルーの励起光は組織内へ侵達しやすいと考えられます．また，メチレンブルーは陽イオン性であるので，陰イオン性である菌の細胞膜と結合しやすいと考えられます．さらにメチレンブルーは一般的な薬剤であるため比較的容易に入手することができます．これら3つの観点からメチレンブルーを採用いたしました．
- 光源としてLEDアレイを採用した理由について説明します．左の本研究で使用したLEDアレイの写真，右がLEDアレイの発光スペクトルとメチレンブルーの吸収スペクトルのグラフです．波長はメチレンブルーの吸収が極大となる665nm，照射光強度25ｍW/cm2，スペクトル幅17.19nm，素子数3×6のものを使用しました．LEDアレイはこの写真のようにLEDを複数個配列した器具なので，広範囲へ光を照射することができます．またLEDアレイはレーザー発振器などより安価で入手できます．以上の2つの観点からLEDアレイを採用しました．
- まずラット背面の皮膚全層にⅢ度熱傷を作成しました．こちらが熱傷を作成したラット背面の写真です．熱傷作成15分後に8.0×106 CFU/mlの緑膿菌液を0.25ml塗布することによりモデルを作製しました．菌液はこの黒い四角で囲われた範囲に塗布しました．そして感染30分後にA-PDTを適用しました．まず感染領域へ1.0mMのメチレンブルーを125µL塗布しました．こちらが塗布直後の創部写真です．その10分後に光を照射しました．照射時間は10分としました．こちらが光照射後の創部写真です．この写真のようにメチレンブルーはPDTにより褪色し反応性が失われるため，メチレンブルーの塗布と光照射は6回繰り返し実施しました．そしてA-PDT適用直後，1，3，5日後の感染創部の菌数と5日後における血中と肝臓内の菌数を調査し評価を行いました
- 先行研究では，マウス背面にⅢ度熱傷を作製し，熱傷皮下に3.9×10＾9 CFU/ｍｌの緑膿菌液を接種することで感染を確立し，30分後にヒポクレリンB・ランタノイドイオンを0.1 M/L熱傷皮下に投与し，5分後にLEDを照射することによりA-PDTを適用しています．そしてこのA-PDTの適用結果がこちらのグラフになります．この研究の問題点として，こちらのグラフからもわかるように菌の血中移行を防げていない，創部から血中への菌移行を模擬できていない，ヒポクレリンB・ランタノイドイオンは入手しにくいことが挙げられます．