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M1/M2型マクロファージの識別マーカー
2017年3月30日
伊純 明寛
a.isumi (at) cellbio.info
一口にマクロファージと言っても、その内実はM1型と
M2型の機能的な亜群（phenotype）に分かれています。
これらを明瞭に識別できる方法が中々無いことがしばし
ば頭を悩ませられる課題となります。
本資料では、マクロファージのphenotypeを識別する
ために一般的に使用されるマーカーの組み合わせについ
て概説していきます。
見やすさよりも情報を出来るだけ多く残すことを重視しているため、かなりtext richになっています。
[ Phenotypeの識別 ]
伊純 明寛](https://image.slidesharecdn.com/m1m2-170330143640/85/M1-M2-1-320.jpg)
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M1/M2型マクロファージの識別マーカー
マクロファージはM1型とM2型の機能的なphenotypeに分かれています。 M1型とM2型マクロファージの機能的な違いと、それらを識別するための特異的マーカーについて解説していきます。 20170330Thu. 伊純明寛
![SSII2022 [SS1] ニューラル3D表現の最新動向〜 ニューラルネットでなんでも表せる？？ 〜](https://cdn.slidesharecdn.com/ss_thumbnails/ss1ssii2022hkatoneural3drepresentationhiroharukato-220607054619-fadc6480-thumbnail.jpg?width=640&height=640&fit=bounds)
M1/M2型マクロファージの識別マーカー
- 1. 1 M1/M2型マクロファージの識別マーカー 2017年3月30日 伊純 明寛 a.isumi (at)cellbio.info 一口にマクロファージと言っても、その内実はM1型と M2型の機能的な亜群（phenotype）に分かれています。 これらを明瞭に識別できる方法が中々無いことがしばし ば頭を悩ませられる課題となります。 本資料では、マクロファージのphenotypeを識別する ために一般的に使用されるマーカーの組み合わせについ て概説していきます。 見やすさよりも情報を出来るだけ多く残すことを重視しているため、かなりtext richになっています。 [ Phenotypeの識別 ] 伊純 明寛
- 2. 2 目次 ● M1/M2型マクロファージ識別の目的 ✔ ケース① <生体材料の適合性評価> ✔ ケース② <動脈硬化症の病因としてのM1型マクロファージ> ✔ ケース③<I型アレルギーの病因としてのM2型マクロファージ> ● Phenotype識別のためのマーカー選択 ✔ Phenotype識別の前準備 | マクロファージの篩い分け ✔ M1型マーカーとM2型マーカーの組み合わせ -1（Iba1 / CD11c / CD163 or CD206） ✔ M1型マーカーとM2型マーカーの組み合わせ -2（CD80 or CD86 / CD163 or CD206） ✔ M1型マーカーとM2型マーカーの組み合わせ -3（Iba1 / CD181 / CD163 or CD206） ✔ M1型マーカーとM2型マーカーの組み合わせ -4（Iba1 / CD197 / CD163 or CD206） ✔ M1型マーカーとM2型マーカーの組み合わせ -5（Iba1 / iNOS / Arginase1） ✔ M1型マーカーとM2型マーカーの組み合わせ -6（Iba1 / CD38 / Egr2） ✔ マーカーの組み合わせ まとめ ● Appendix（おまけ） ✔ Appendix-1 | M1型/M2型マーカーを共発現する事例 • 事例A. 腫瘍随伴性マクロファージ（TAM; Tumor-Associated Macrophage） • 事例B. M2型マクロファージによりM1型マクロファージのApoptosis誘導過程 • 事例C. バクテリアへの免疫応答 ✔ Appendix-2 | サイトカインの検出 • 解決策 A | ELISpot法 • 解決策 B | Bouin固定 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 伊純 明寛
- 3.
- 4. 4 ケース① <生体材料の適合性評価> Ge LP,et al. (2015) Integration of nondegradable polystyrene and degradable gelatin in a core–sheath nanofibrous patch for pelvic reconstruction. Int J Nanomedicine. 2015 Apr 24;10:3193-201. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25995629 インプラントやステントなどのような人工物を組織へ埋植する生体材料の開発分野では、 術後の治癒段階を評価する上でマクロファージの局在観察に高く関心が寄せられています。 ● M1型の集簇が主であれば、埋植物が異物と見做され、貪食作用により腐食を受けていることを示す。 ⇒ 生体材料として適さない素材。 ● M2型の集簇が主であれば、埋植物へ向かって組織が再生・修復されていることを示す。 ⇒ 生体材料として適する素材。 生分解性埋植素材の埋植予後。 M1型の集簇が少ない一方で、 M2型は2週間後をpeakにして 多くの集簇が認められる。 3週間以降はどちらも あまり集簇が認められない。 ⇒ 殆ど炎症を来すことなく 3-4週間程度で定着完了。 伊純 明寛
- 5. 5 ケース② <動脈硬化症の病因としてのM1型マクロファージ> このようにM1型優位な免疫応答により増悪してしまう疾患では、M2型優位な状況 を促し、M1型への分化を抑制するよう拮抗させる投薬治療法が検討されています。 Phenotypeの識別により、M1型/M2型のバランス制御への奏功を評価することが出 来ます。 また、動脈硬化症のように、本来であれば異物排除に働くはずの M1型マクロファー ジの活性化が、むしろ病態形成の原因となってしてしまうケースもあります。 Fan-ChingLin, Howard A. Young (2013) The talented interferon-gamma. Advances in Bioscience and Biotechnology Vol.4 No.7A3 http://www.scirp.org/JOURNAL/PaperInformation.aspx?PaperID=34661 1. 血管内にコレステロール塊(Plaque)が蓄積すると、異 物排除のため M1型マクロファージが集簇します。 2. 集簇したM1型マクロファージはPlaqueを貪食します が、マクロファージは Plaque の分解能を持たないた め、マクロファージ死後には消化されないまま結晶化 した Plaque が堆積します。 3. また、集簇したM1型マクロファージは TNFα、IL- 6、IL-12 などの炎症性サイトカインを分泌して更に M1型マクロファージの分化・集簇を促進させる方向 へ働くため、Plaqueの堆積が進んでいきます。 4. この結果、損傷部位へ M1型マクロファージが集簇す ればするほど、局所的な Plaque の堆積が増していく ことで血栓を形成し、病態形成が増悪していくことに なります。 伊純 明寛
- 6. 6 ケース③ <I型アレルギーの病因としてのM2型マクロファージ> 治療法として、人為的にM1型マクロファージを増加させてM2型マクロファージを抑制する 投薬も検討され、やはりPhenotype識別により奏功の評価が可能となります。 Boden SR,Wesley Burks A. (2011) Anaphylaxis: a history with emphasis on food allergy. Immunol Rev. 242(1):247-57 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21682750 1. 体内にアレルゲンが侵入すると、M2マクロファージはこれを 貪食し、一部を抗原として膜表面へ提示するとともに、ヘル パーT細胞（TH2細胞）を活性化する。 2. TH2細胞はB細胞へアレルゲン特異的なIgE抗体を産生するよ う働きかける。アレルギー体質のヒトは通常よりも過剰にIgE 抗体を産生してしまう。 3. 産生されたIgE抗体は白血球の一種である肥満細胞（マスト細 胞）の膜上へ結合（感作）し、肥満細胞が抗原（アレルゲン） を認識するためのセンサーとして機能する（IgE抗体の産生量 が多いほど多くの肥満細胞へ結合する）。 4. 抗原を認識した過剰量の肥満細胞は異物排除のためヒスタミン 等の血管拡張促進物質を分泌することで、血管から免疫細胞を 滲出・集簇させ、過剰な炎症が生じてアレルギー症状となる （花粉症の薬に抗ヒスタミン剤が使われるのは、この炎症を抑 える目的）。 喘息や食物アレルギー、アトピーなどのI型アレルギーは、M2型マクロファージが病因と なるケースです。本来は炎症抑制に働くはずのM2型マクロファージが、むしろ遠因的に炎 症を誘発してしまうところが大きな特徴です。 M2型マクロファージは寄生虫防御などの慢性的な異物排除のため、M1型マクロファージによる短期的な免疫応答 では処理しきれない異物に対してIgE抗体の産生を促す機能があります。 特定の食物や花粉などに過剰に反応してしまう体質のヒトは、このIgE抗体の産生が過剰に起こることでアレルギー 症状として表れます。 伊純 明寛
- 7. 7 Phenotype識別のためのマーカー選択 様々な分野で重要な意義を持つM1型/M2型 Phenotypeの識別ですが しかしながら、これらを明確に識別するためのマーカー選択は悩ましい課題となっています。 本資料では、M1型/M2型識別のために使用されるマーカーの内、一般的なものを列記するとと もに、生理的な機能も交えておすすめの組み合わせについて概説していきたいと思います。 Phenotype マーカー名細胞内局在 機能 M1型+M2型 CD11b CD68 F4/80 Iba1（AIF-1） 細胞膜 細胞膜 Lysosome膜 細胞膜 細胞質 細胞膜 細胞接着に関与，Fibrinogenレセプター 食作用活性に関与 制御性T細胞（Treg）の分化に関与 アクチン膜骨格と結合して膜構造を変化 M1型 CD11c（integrin αX鎖） CD38 CD80 CD86 CD181（CXCR1, IL-8RA） CD197 (CCR7) iNOS 細胞膜 細胞膜 細胞膜 細胞膜 細胞膜 細胞膜 細胞質 細胞接着に関与，Fibrinogenレセプター cADP合成に関与 T細胞活性化の必須シグナル T細胞活性化の必須シグナル，IL-2分泌に関与 IL-8レセプター，好中球活性化に関与 MIP-3-betaレセプター，リンパ細胞活性化に関与 NO産生による殺菌・殺腫瘍作用 M2型 CD163 CD206（Mannose Receptor） Αrginase-1 Egr2（Krox20） 細胞膜 細胞膜 細胞質 核 エンドサイトーシス活性に関与 糖タンパクのエンドサイトーシスを活性化 ポリアミン類およびプロリン産生による組織修復 核転写因子 EGR; Early Growth Response protein 伊純 明寛
- 8. 8 Phenotype識別の前準備 | マクロファージの篩い分け Phenotype識別の前に、まずはPhenotypeに関らず全てのマクロファージをそれ以外の細 胞と篩い分けを行うことが必要となります。 マクロファージマーカーを選択する際の課題として、マクロファージ以外の免疫細胞にも広く発現しているため、観察目的 のマクロファージ以外が検出されてしまう問題があります。 ● Iba1（AIF-1）を推奨 Phenotype非特異的なマクロファージマーカーとして、最も安定的に発現する抗原としてIba1の検出をおすすめします。 F4/80も一般的に使用されるマーカーですが、F4/80のデメリットとして肺・腎臓で発現が弱く、精巣・リンパ節ではT細 胞ゾーンで発現が認められないことが報告されています（Gordonet al, (1994) BCG-induced granuloma formation in murine tissues. Immunobiology. 191(4-5):369-77.）。 一方でIba1は組織によって発現の強弱はありますが、基本的には全ての臓器で良好な発現が認められます。特別の用途 がない限りはIba1を用いるのが無難です。 Phenotype マーカー名 細胞内局在 機能 M1型+M2型 CD11b CD68 F4/80 Iba1（AIF-1） 細胞膜 細胞膜 Lysosome膜 細胞膜 細胞質 細胞膜 細胞接着に関与，Fibrinogenレセプター 食作用活性に関与 制御性T細胞（Treg）の分化に関与 アクチン膜骨格と結合して膜構造を変化 伊純 明寛
- 9. 9 【方針】 次頁からM1型/M2型マーカーの組み合わせを列挙していきますが 各Phenotypeマーカーはマクロファージ以外のものにも広範に発現しています！ そのため、下記の方針で識別を行うことが必要となります。 ・ Iba1− ・・・ マクロファージ以外（観察対象ではない他の細胞） ・ Iba1＋ /M1型マーカー＋ ・・・ M１型マクロファージ ・ Iba１＋ / M2型マーカー＋ ・・・ M２型マクロファージ １． Iba１によりマクロファージとそれ以外を篩い分け。 ↓ ２． M１型/M２型マーカーによりPhenotype識別。 伊純 明寛
- 10. 10 M1型マーカーとM2型マーカーの組み合わせ -1 パターン① Iba1/ CD11c / CD163 or CD206 汎用性 ・・・ 高 一般的に使用される組み合わせです。 Phenotype マーカー名 細胞内局在 機能 M1型+M2型 Iba1（AIF-1） 細胞質 細胞膜 アクチン膜骨格と結合して膜構造を変化 M1型 CD11c（integrin αX鎖） 細胞膜 細胞接着に関与，Fibrinogenレセプター M2型 CD163 CD206（Mannose Receptor） 細胞膜 細胞膜 エンドサイトーシス活性に関与 糖タンパクのエンドサイトーシスを活性化 【解説】 CD１１は細胞接着分子であるインテグリンの構成タンパクであり、a〜dに分かれています。 この内、マクロファージに発現するのはCD１１bとcですが、CD１１bはM１型のみならずM2型にも発現が認められるため、pan（全ての） macrophageマーカーである点に注意が必要です。M１型マーカーとして使用する場合はCD11bではなくCD１１cを使用してください。 CD１６３とCD２０６はエンドサイトーシスに関与する受容体であり、最も一般的に使用されるM２型マーカーとして使用されます。下記例で はM1型にも若干のmRNA発現が認められていますが、実際にはタンパクレベルでM1型に認められることは殆どありません。 ただし、どちらが手技的に使いやすいかは検討が必要です。 M１型 M１型 M１型M2型 M2型 M2型 Fujisaka S et al. (2009) Regulatory mechanisms for adipose tissue M1 and M2 macrophages in diet-induced obese mice. Diabetes (11) :2574-82 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19690061Gene profiles of macrophages positive or negative for CD11c and CD206 in epididymal fat tissue. 伊純 明寛
- 11. 11 M1型マーカーとM2型マーカーの組み合わせ -2 パターン② Iba1/ CD80 or CD86 / CD163 or CD206 汎用性 ・・・ 高 最も一般的に使用される組み合わせです。 Phenotype マーカー名 細胞内局在 機能 M1型+M2型 Iba1（AIF-1） 細胞質 細胞膜 アクチン膜骨格と結合して膜構造を変化 M1型 CD80 CD86 細胞膜 細胞膜 T細胞活性化の必須シグナル T細胞活性化の必須シグナル，IL-2分泌に関与 M2型 CD163 CD206（Mannose Receptor） 細胞膜 細胞膜 エンドサイトーシス活性に関与 糖タンパクのエンドサイトーシスを活性化 【解説】 CD80とCD86は類似構造の膜タンパクです。どちらもT細胞上 に発現するCD20およびCD152（CTLA−4）の受容体として機能 をします。 創傷部位等へ集簇したM1型マクロファージがT細胞と接近す ると、T細胞上のCD20およびCD152がリガンドとしてマクロファー ジ上のCD80およびCD86へ結合します。この刺激がシグナルとな り、T細胞の増殖およびサイトカイン分泌を誘導して免疫応答を促 進します。 CD163およびCD206についてはP．9と同様、どちらも特異性が 高くおすすめです。 特異性が非常に高く、最も一般的に使用される組み合わせです。 Mattiola I, et al. (2015) Priming of Human Resting NK Cells by Autologous M1 Macrophages via the Engagement of IL-1β, IFN-β, and IL-15 Pathways. J Immunol. 195(6):2818-28. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26276870 伊純 明寛
- 12. 12 M1型マーカーとM2型マーカーの組み合わせ -3 パターン③ Iba1/ CD181 / CD163 or CD206 汎用性 ・・・ 低 たまに見られる組み合わせですが、特異性の観点からおすすめは出来ません。 Phenotype マーカー名 細胞内局在 機能 M1型+M2型 Iba1（AIF-1） 細胞質 細胞膜 アクチン膜骨格と結合して膜構造を変化 M1型 CD181（CXCR1, IL-8RA） 細胞膜 IL-8レセプター，好中球活性化に関与 M2型 CD163 CD206（Mannose Receptor） 細胞膜 細胞膜 エンドサイトーシス活性に関与 糖タンパクのエンドサイトーシスを活性化 【解説】 CD181はIL-8のGタンパク共益型受容体です。 IL-8がCD181へ結合することで細胞内Ca2＋ 濃度が上昇し、IL−8を受容した方向（創傷部位）へ向かう走化性を生じさせます（参考 Calcium and Chemotaxis http://stke.sciencemag.org/content/2007/399/tw293）。好中球, 好塩基球, Tサブセットが主な発現部位です。 この組み合わせもPhenotype識別に使用されてい ることがありますが、特異性は高くありません。 また、好中球やT細胞などで高発現が認められるた め、マクロファージ以外の免疫細胞が高密度に集簇し ているサンプルの観察では、免疫細胞のほぼ全体が 染まってしまい、観察が難しくなる場合があります。 Zajac E, et al. Angiogenic capacity of M1- and M2-polarized macrophages is determined by the levels of TIMP-1 complexed with their secreted proMMP-9 (Supplemental Data) Blood. 122(25):4054-67. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24174628 おすすめできません。 伊純 明寛
- 13. 13 M1型マーカーとM2型マーカーの組み合わせ -4 パターン④ Iba1/ CD197 / CD163 or CD206 汎用性 ・・・ 中 一般的に使用される組み合わせです。 Phenotype マーカー名 細胞内局在 機能 M1型+M2型 Iba1（AIF-1） 細胞質 細胞膜 アクチン膜骨格と結合して膜構造を変化 M1型 CD197 (CCR7) 細胞膜 MIP-3-betaレセプター，リンパ細胞活性化に関与 M2型 CD163 CD206（Mannose Receptor） 細胞膜 細胞膜 エンドサイトーシス活性に関与 糖タンパクのエンドサイトーシスを活性化 【解説】 CD197はCCL19やCCL21のGタンパク共役型受容体 です。CCL19やCCL21は免疫細胞や線維芽細胞などの 間質細胞から分泌され、これらのリガンドがCD197と結合 することにより、セカンドメッセンジャーであるGDPを介して 走化性が制御され、リンパ系における循環や圓生部位への 集簇が誘導されます。 M2型にも若干の発現が認められますが、圧倒的に M1型の発現が多いです（CD80と同程度）。 （右図結果では、Fetal（胎児）のミクログリアではまだしっかりとした分 化機能が備わっていないのか、M2型へも発現が認められるため留意 しておく必要があります。） CD163およびCD206についてはP．9と同様、どちらも特 異性が高くおすすめです。 Durafourt BA et al. (2012) Comparison of polarization properties of human adult microglia and blood-derived macrophages. Glia. 60(5):717-27. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22290798 MØ, macrophage; GM, GM-CSF; M, M-CSF; AM, adult microglia; FM, fetal microglia. 伊純 明寛
- 14. 14 M1型マーカーとM2型マーカーの組み合わせ -5 Phenotype マーカー名細胞内局在 機能 M1型+M2型 Iba1（AIF-1） 細胞質 細胞膜 アクチン膜骨格と結合して膜構造を変化 M1型 iNOS 細胞質 NO産生による殺菌・殺腫瘍作用 M2型 Arginase1 細胞質 ポリアミン類およびプロリン産生による組織修復 iNOSとArginase1はどちらもArginineを基質とします。 同一の基質から対照的な経路で合成される酵素のため、Phenotypeごとの機能と も整合性を取れた組み合わせです。 M1型はiNOS（inducible NO Sinthase）を発現し、貪食した異物への攻撃のため ArginineからNOを合成します。 M2型はArginase1を発現し、ArginineからOrnithinおよびその下流のポリアミンと Prolineを合成します。これにより修復部位でのNO産生が抑制されるとともに、ポリアミ ンおよびProlineを介した組織修復が促されます。 生理的な機能を最も反映した組み合わせです。 パターン⑤ Iba1 / iNOS / Arginase1 汎用性 ・・・ 高 機能的な識別が出来るため、個人的には最もおすすめです。 【解説】 Rath M, Müller I, Kropf P, Closs EI, Munder M. (2014) Metabolism via Arginase or Nitric Oxide Synthase: Two Competing Arginine Pathways in Macrophages. Front Immunol. 5:532. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25386178 Angiogenic capacity of M1- and M2-polarized macrophages is determined by the levels of TIMP-1 complexed with their secreted proMMP-9. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24174628 iNOSとArginase1はそれぞれHIF-1α およびHIF-2αに制御されるため、これら 上流の因子を検討するのもありです。 伊純 明寛
- 15. 15 M1型マーカーとM2型マーカーの組み合わせ -6 Phenotype マーカー名細胞内局在 機能 M1型+M2型 Iba1（AIF-1） 細胞質 細胞膜 アクチン膜骨格と結合して膜構造を変化 M1型 CD38 細胞膜 cADP合成に関与 M2型 Egr2 核 核転写因子 EGR; Early Growth Response protein 最近の網羅的トランスクリプトーム解析により絞り込まれた組み合わせです（Novel Markers to Delineate Murine M1 and M2 Macrophages. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26699615）。 M1型/M2型にそれぞれ発現する膨大な因子の中から、最も発現動態が特異的かつ顕著であったものが抜き出された結 果、以下の結果が示されました。 パターン⑥ Iba1 / CD38 / Egr2 汎用性 ・・・ 低 最近の知見のためデータがまだ乏しいですが、文献による報告では最高精度です。 【解説】 ● M1型 CD38＋ /Egr2− ● M2型 CD38− /Egr2＋ ただし、まだデータが乏しく汎用性に関しては注意が必要です。 広範な実験条件で使用可能なマーカーかどうかは検証が十分とは言えない状況です。特にマクロファージは 由来や誘導方法、生理条件によって因子の発現が不安定に変化します。 右図のグラフのように非常に明瞭な識別結果が示されているため、そう簡単に特異性が問題となる可能性は 低く思われますが、念のため、観察目的とするマクロファージで使用可能か、他のマーカーとの組み合わせにより 事前検討を行う方が万全と言えます。 また、脳のミクログリア検出では、Egr2発現細胞の内の殆どがアストロサイトとなるため、Iba1を併用した識別 が非常に重要となります（アストロサイトはEgr2の機能によりミエリン鞘を形成する）。 伊純 明寛
- 16. 16 マーカーの組み合わせ まとめ パターン マーカー組み合わせ汎用性 備考 ⑤ (P. 13) ● M1型+M2型 Iba1 ● M1型 iNOS ● M2型 Arginase1 高 機能的な識別が出来る点から 最もおすすめです。 ② (P. 10) ● M1型+M2型 Iba1 ● M1型 CD80 or CD86 ● M2型 CD163 or CD206 高 最も一般的に使用される組み合わせで す。 ① (P. 9) ● M1型+M2型 Iba1 ● M1型 CD11c ● M2型 CD163 or CD206 高 一般的に使用される組み合わせです。 ④ (P. 12) ● M1型+M2型 Iba1 ● M1型 CD197 ● M2型 CD163 or CD206 中 一般的に使用される組み合わせです。 ⑥ (P. 14) ● M1型+M2型 Iba1 ● M1型 CD38 ● M2型 Egr2 低 報告された精度は最も高いですが データは少ないです。 ③ (P. 11) ● M1型+M2型 Iba1 ● M1型 CD181（CXCR1, IL-8RA） ● M2型 CD163 or CD206 低 散見される組み合わせですが おすすめできません。 <おすすめ順> 伊純 明寛
- 17.
- 18. 18 Appendix-1 | M1型/M2型マーカーを共発現する事例 -Transdifferentiationについて． M1型とM2型の分類は明瞭なものではなく、生理条件によって転換（Transdifferentiation）を 生じ、不安定に移り変わります。 Appendix M1型 M2型 その過程では両方のマーカーを発現するマクロファージも生じ、完全にM1型/M2型を識別する ことは困難となります。 その事例を参考までにご紹介していきます。 伊純 明寛
- 19. 19 事例A. 腫瘍随伴性マクロファージ（TAM; Tumor-AssociatedMacrophage） 腫瘍形成の最初期には異物排除のためM1型マクロファージが集簇しますが、腫瘍から分泌されるM-CSFにより、M1型か らM2型様マクロファージへの分化誘導が促進されます。 M1型からM2型様へ分化されたこれらのマクロファージを腫瘍随伴性マクロファージ（TAM; Tumor-Associated Macrophage）と呼びます。 TAMを誘導することにより、腫瘍はM1型マクロファージによる免疫応答から身を守り、且つM2型の性質を示すTAMから分 泌される成長因子による成長・肥大を促進します。 腫瘍周囲におけるM1型→M2型 Transdifferentiation. Appendix M-CSF腫瘍 M1 M2 IL-10 TGFβ VEGF EGF PDGF 抗腫瘍免疫の抑制 血管新生による腫瘍への栄養 腫瘍の成長活性化 TAM誘導初期では、元々発現していたM1型マーカーのみならずM2型マーカーも共発現します。 しかしながら、誘導の過程で元々のM1型マーカーが消失するTAMも生じ始めます。 ● TAMの誘導過程ではM1型/M2型マーカーの両方を発現する場合がある。 ● M1型マーカーを消失した後のTAMと正常M2型マクロファージとの一般的な識別方法は確立されていない。 ● 腫瘍周囲のM2型マーカー発現マクロファージをTAMと判定する以上の識別は難しい。 伊純 明寛
- 20.
- 21. 21 Appendix 事例C. バクテリアへの免疫応答 バクテリア由来Lipopsaccharide受容によるM2型→M1型 Transdifferentiation. バクテリアが体内へ侵入すると、本来は動物に存在しないはずの細胞壁を構成するリポ多糖類（LPS;Lipopsaccharide）が 体内に存在することになります。 M2型マクロファージがLPSを受容することにより、バクテリアを排除するため免疫促進性のM1型マクロファージへの転換が誘 導されます。 また、M1型マクロファージは免疫促進性のTh1細胞を活性化させ、Th1細胞からはIL-21が分泌されます。 M2型マクロファージがIL-21を受容することにより、更にM1型マクロファージへの転換が誘導されます。 LPS M2 M1 バクテリア IL-12 Th1 IL-21 バクテリアの侵入に際してはLPSの受容およびTh1からのIL-21によるfeedbackの 両面からM1型マクロファージへの転換を誘導します。 この過程のマクロファージでは分子発現の動態が不安定のためPhenotype鑑別は 難しくなります。 伊純 明寛
- 22. 22 Appendix-2 | サイトカインの検出 Appendix 本資料でマーカーとして取り挙げた分子は、受容体 や酵素などの細胞内分子のみに限定しました。 これらは発現動態が比較的安定しており、再現性の 高い検出結果を得るのに好都合なためです。 実際には、M1型/M2型のPhenotypeは細胞内の 分子動態のみならず、細胞外へ分泌するサイトカイン などのリガンド成分にも大きな違いが表れます。 M1Cytokine M2 Cytokine TNFα IL-1 IL-6 IL-12 IL-15 IL-23 CCL8 CCL15 CCL19 CCL20 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL13 TGFβ FGL2 IL-10 CCL1 CCL13 CCL14 CCL17 CCL18 CCL20 CCL23 CCL26 CXCL1 CXCL2 CXCL3 しかしながら、サイトカイン（特にIL系）は生細胞/固定細胞に拘らず、細胞外へ非常に遊 離してしまいやすい点と、品質の良い抗体の作製が難しいため、検出は困難を極めます。 ELISpot法解決策 A 最も高精度に サイトカインを検出できる実験系です。 解決策 B Bouin固定 組織上の局在を観察したい時は Bouin固定後の免疫染色が最適です。 伊純 明寛
- 23. 23 Appendix 解決策 A |ELISpot法 サイトカインは組織上での観察が非常に困難なため 通常は培養上清に含まれるサイトカイン濃度をELISA法により 測定することで検出されます。 しかしながらELISA法では、よほど高濃度な試料でない限り 再現性の高い検出結果を得るのは困難です。 そこで開発されたのがELISpot法です。 1. ディッシュ底面へ 抗サイトカイン一次抗体を固相化 2. 細胞をディッシュへ播種 3. 細胞からのサイトカイン分泌 4. 細胞を洗浄除去 （一次抗体へ結合したサイトカインは残留する） 5. 酵素あるいは色素標識二次抗体を結合させ サイトカインを特異的に検出 Cell-based ELISA法とよく似ていますが 途中で細胞を洗い流すところが異なっています。 Cell-based ELISA法では細胞を播種した後、一次抗体へ結合した細胞数をカウントします。 サイトカインは分子が小さく膜外へ非常に遊離してしまいやすいため、 抗サイトカイン抗体では細胞をトラップしきれず、Cell-based ELISA法は全く向きません。 ELISpot法は現状、最も高精度に サイトカインを検出できる実験系です。 Martino AT, Herzog RW, Anegon I, Adjali O. (2011) Measuring immune responses to recombinant AAV gene transfer. Methods Mol Biol. 807:259-72. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22034034 伊純 明寛
- 24. 24 Appendix 解決策 B |Bouin固定 Western BlotのようなLysateレベル、あるいはELISpotのような 単離された細胞レベルの間接的な検出ではなく、組織上でサイトカ インの分泌局在を観察したい場合は免疫染色を行うことになります。 しかしながら、サイトカイン（特にIL系）は分子量が小さく、細胞外 へ容易に流出してしまうため、通常の固定では極めて困難です。 サイトカインの染色にはBouin固定を推奨します。 Bouin固定はホルモンや伝達ペプチドなど、分泌タンパク の免疫染色に用いられます。 Bouin固定ではサイトカインの観察にも適することが報告 されています。 【ブタ組織】 Salguero FJ. et al, (2001) Detection of monokines in paraffin-embedded tissues of pigs using polyclonal antibodies. Vet Res. 32(6):601-9. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11777010 抗原 IL-6 組織 ブタ肝臓 固定液 Bouin液 透過処理 Tween20 Bouin固定および抗原賦活化の 際にTween20を混ぜたBufferで 透過処理を行うことで、より高い 検出性が期待できます。 伊純 明寛