Microbiologia

1. 1
Disciplina Bacteriologie, virusologie și parazitologie medicală
Conspect științific la tema:
MICROBIOLOGIA CA OBIECT. SISTEMATICA, NOMENCLATURA
BACTERIILOR. ULTRASTRUCTURA, MORFOLOGIA
MICROORGANISMELOR.
METODA MICROSCOPICĂ DE DIAGNOSTIC.
.

2. 2
Conținut:
1. Microbiologia ca obiect.
2. Sistematica, nomenclatura bacteriilor.
3. Ultrastructura, morfologia microorganismelor.
4. Metoda microscopică de diagnostic.
1. MICROBIOLOGIA CA OBIECT.
 Microbiologie (mikros bios logos - mic, viu, studiu). Microbiologia studiază
microorganismele şi activităţile lor.
 Microorganisme / microbi – organisme microscopice, cu dimensiuni de ordinul µm (10-6
m) sau nm (10-9 m). Microorganisme reunesc bacteriile și alte tipuri de organisme: alge,
ciuperci microscopice (fungi, micete), protozoare, virusuri şi agenți sub virali, de ex. prioni.
Termenul “microb” a fost utilizat în 1878 de chirurgul francez Charles-Emmanuel Sedillot.
Lumea microbiană. Vârsta aproximativă fiind 1-1,5 mlrd ani.
 Abundenţa şi diversitatea fiind 60% din biomasă; apă, aer, sol - scoarța terestră la 15 km,
surse termale la 100 grade; 4000 specii descrise – mai puțin de 1% din aproximativ 106
specii necultivabile în laborator. Genomul Pseudomonas aeruginosa posedă 5000 gene,
posedă sisteme eficiente de percepere a lumii, comunicare şi adaptare la condiţii variate ale
mediului.
Microbiologia studiază forma, structura, nutriţia, metabolismul, creşterea şi multiplicarea
microorganisme (pentru a le identifica) și urmăreşte relaţiile lor cu organismele-gazdă şi cu
mediul ambiant.
De ce studiem microorganismele?
 Studiul microorganismelor patogene şi oportuniste
Prevenirea şi controlul maladiilor infecţioase
Producerea antibioticelor
Obţinerea medicamentelor prin tehnologii de ADN recombinant: streptokinaza, insulina,
vaccinuri, etc
Producerea alimentelor: unt, brânză, caşcaval, chefir, yaurt, oţet, alcool, cacao, cafea, etc.
Rol de “insecticide” biologice
Fabricarea plasticului biodegradabil
Descompunerea deşeurilor şi metanului
Extragerea metalelor din minerale
Asigurarea rolului major în ciclurile geochimice, etc
Disciplinile microbiologice în raport cu:
1. Particularităţile biologice ale microorganismelor: Algologia, Protozoologia, Micologia,
Bacteriologia, Virologia
2. Implicaţiile în activităţile umane: Microbiologia medicală, veterinară, industrială, alimentară,
Genetica microbiană, Ecologia microbiană, Microbiologia solului, Microbiologia marină,
Microbiologia cosmică, etc
Microbiologia medicală studiază:
 Relaţiile dintre microorganisme şi gazda lor umană
 Capacităţile patogene ale microorganisme
 Capacităţile antiinfecţioase ale gazdei
 Principiile şi metodele diagnosticului etiologic al infecţiilor

3. 3
 Bazele terapiei antimicrobiene
 Bazele profilaxiei antimicrobiene
2. CLASIFICAREA ŞI NOMENCLATURA MICROORGANISMELOR
Lumea microbiană este extrem de diversă, ceea ce determină necesitatea aranjării lor în
grupe conform asemănării lor.
Se disting 3 noţiuni:
1. Taxonomie – ştiinţa despre clasificare
2. Clasificare – aranjarea organismelor în grupe sau taxoni în funcţie de asemănări sau înrudiri
3. Nomenclatura – numirea ştiintifică a grupelor taxonomice conform unor reguli
internaţionale.
Principalele grupe taxonomice (taxoni)
- Regn
- Tip/Diviziune
- Clasă
- Ordin
- Familie
- Gen
- Specie (unitate fundamentală)
Specia – o grupare de tulpini bacteriene (suşe/tulpini) cu multe caractere comune prin care
diferă semnificativ de alte tulpini.
În cadrul speciilor pot fi delimitaţi taxoni infraspecifici (variante / tipuri),
 care prezintă diferenţe minore în activitatea biochimică sau fiziologică (biovar),
 în structura antigenică (serovar),
 în gradul de patogenitate (patovar),
 în sensibilitatea la bacteriofagi (lizovar) sau la antibiotice (antibiovar).
Pot fi utilizaţi ca markeri epidemiologici pentru descifrarea unor epidemii (infecţii
nozocomiale, toxiinfectii alimentare, etc)
Conform ultimei clasificări internaţionale ale microorganismelor (Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology, 2001) se disting:
I. Forme acelulare (virusuri, viroizi, prioni)
II. Forme celulare, repartizate în 3 domenii:
- Bacteria – procariote (bacterii adevărate, eubacterii).
a) Bacterii cu perete celular fin, gram-negative;
b) Bacterii cu perete celular gros, gram-pozitive,
c) Bacterii lipsite de perete celular (micoplasme).
Nomenclatura microorganismelor
Numirea microorganismelor este stabilită de către Comitetul Internaţional de Bacteriologie
Sistematică. Nomenclatura taxonilor are la origine un substantiv grec sau latin, care defineşte
cel mai evident caracter al mi microorganismelor studiate, la care se adaugă un anumit sufix
latin.
Ordinul – Actinomycetales, Spirochaetales
Familia – Enterobacteriaceae, Spirochaetaceae
Genul – Staphylococcus, Leptospira, Clostridium, Pseudomonas
Specia – denumire binară (Gen + specie): Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Mycobacterium tuberculosis, etc.
3. MORFOLOGIA, ULTRASTRUCTURA MICROORGANISMELOR.

4. 4
Bacteriile sunt organisme unicelulare procariote autonome, cu dimensiuni între 0,2 şi 10 µm
(Spirochaeta – 250 µm) şi care diferă esenţial de celulele eucariote animale sau vegetale.
CELULE EUCARIOTE CELULE PROCARIOTE
Aparatul nuclear – nucleu cu nucleoli,
înconjurat de membrană nucleară
Moleculă de ADN circular, lipsa membranei
nucleare
Celula se divide prin mitoză sau meioză Diviziune binară
Lipsa peretelui celular (în caz de prezenţă
conţine chitina sau celuloza)
Prezenţa peretelui celular ce conţine
obligator peptidoglican
Prezenţa organitelor celulare Absenţa organitelor celulare,
citoplasma omogenă, ne-compartimentată
2 tipuri de ribosomi – în citoplasmă şi în
mitocondrii sau cloroplaste
Toţi ribosomii sunt identici
MORFOLOGIA BACTERIILOR
Morfologic se disting 4 grupe de bacterii:
1) Forme sferice (coci)
2) Forme cilindrice alungite (bastonaşe)
3) Forme încurbate/spiralate
4) Bacterii polimorfe: Actinomyces, Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma
 Formele sferice (coccus)
 Micrococi (Micrococcus)– celule izolate
 Diplococi (Diplococcus)– perechi (neisserii - bob de cafea, pneumococi - lanceolati)
 Streptococi (Streptococcus) - lanţuri
 Tetracoci (Tetracoccus) – câte 4 celule
 Sarcine – (Sarcina) – pachete din 8-16-32 coci
 Stafilococi – (Staphylococcus) – grămezi neregulate de coci
 Formele cilindrice alungite (bastonaşe)
 Bastonașe sau bacterii propriu zise nu formează spori (Mycobacterium, enterobacterii,
etc);
 Corynebacterium, bastonaşe cu capetele rotunjite bombate datorită pigmentului de
volutină;
 Bacili – bastonaşe mari cu capetele retezate, formează spori ce nu depăşesc diametrul
celulei (ex.: Bacillus anthracis). Posibilă aranjarea în lanţuri – streptobacili
 Clostridium – bastonaşe cu capetele rotunjite, formează spori ce depăşesc diametrul
celulei (ex.: Clostridium tetani, Clostridium botulinum, C. perfringens, etc)
 Formele încurbate (spiralate)
 Vibrion – bastonaşe încurbate în virgulă (ex.: Vibrio cholerae)
 Spirili îngroșate cu flexiuni aranjate uniform, Campylobacter, Helicobacter – 2 spire,
aspect de “pasăre în zbor” (ex.: Campylobacter jejuni)
 Spirochaeta – celule spiralate, cu 5-25 spire, flexibile (ex.: Treponema, Leptospira,
Borrelia)
 Formele filamentoase fac parte actinomicetele, care au fire ramificate ; miceliul lor poate
avea lungimea de 100—600 nm şi diametrul de 0,5—1,2 nm.

5. 5
Actinomicetele sânt producătoare de antibiotice, unele genuri pot provoca îmbolnăviri la om
— actinomicoze.
În ultrastructura celulei bacteriene se evidenţiază următoarele părţi: anvelopa în trei
straturi, citoplasmă cu diferite incluziuni şi substanţa nucleară, numită nucleoid. Structurile
suplimentare ale celulei bacteriene sânt: capsulele, sporii, flagelii, pilele.
Anvelopa celulei constă din stratul mucozitar extern, peretele celular şi membrana
cltoplasmatică.
a) Stratul capsular mucozitar se află la exteriorul celulei şi execută funcţia de protecţie.
b) Peretele celular reprezintă unul din elementele structurale principale ale celulei. El
asigură forma şi desparte celula de mediul exterior. O proprietate importantă a peretelui
celular este permeabilitatea lui selectivă, care asigură pătrunderea în celulă a substanţelor
nutritive necesare (aminoacizi, glucide ş. a.) şi evacuarea din celulă a produselor metabolice,
peretele celular păstrează în interiorul celulei presiunea osmotică constantă. Rigiditatea
peretelui celular este asigurată de complexul de substanţe polizaharidice,numit muriină sau
peptidoglicani. Unele substanţe, cum ar fi lizozima, lezează peretele celular.
Peretele bacterian al bacteriilor Gram-pozitive diferă ca structură şi compoziţie de cel al
bacteriilor Gram-negative, deşi ambele conţin peptidoglicani în structura peretelui.
(1)Bacteriile Gram-pozitive au un perete gros, alcătuit, în primul rând, dintr-un strat rigid de
peptidoglicani, precum şi din acid teichoic. Cantitatea mare de peptidoglicani (70-80%)
conferă bacteriilor Gram-pozitive sensibilitate la lizozim şi la penicilină.
(a)Lizozimul hidrolizează specific peptidoglicanii între N-acetil- glucozamină şi acidul
N-acetilmuramic.
(b)Penicilina inhibă specific sinteza de peptidoglicani.
(2)Bacteriile Gram-negative au un perete bacterian mai subţire decât al celor Gram -
pozitive, cu un conţinut mult mai mic de peptidoglicani (până la 20%) şi fără acid
teichoic. Un strat complex numit membrană externă, acoperă peretele bacterian al
bacteriilor Gram-negative.
(a)Membrana externă a bacteriilor Gram-negative este mai groasă decât stratul de
peptidoglicani şi este compusă din lipoproteine şi din glicolipide ataşate de
peptidoglicani.
(b)Membrana externă conţine antigenul O, care este caracteristic bacteriilor Gram -
negative.
Îndepărtarea peretelui bacterian, care protejează membrana citoplasmatică subiacentă,
determină liză bacteriană, deoarece membrana este incapabilă să reziste presiunii
osmotice din natură.
Protoplaştii sunt forme bacteriene lipsite de perete, create artificial,
menţinute în medii osmotice capabile să protejeze de liză bacteriană. În medii hipotone
aceste celule se sparg, iar în medii hipertone se ratatinează. Protoplaştii provin din
bacterii Gram-pozitive.
Sferoplaştii sunt, de asemenea, forme bacteriene create artificial
prin îndepărtarea parţială a peretelui. Peretele lor este lipsit de mureină, însă conţine
lipide. Datorită acestor lipide sferoplaştii iau aspect sferic. Sferoplaştii provin din
bacterii Gram-negative.
Rolurile peretelui bacterian:
a) Asigură forma bacteriei.
b) Asigură rezistenţa bacteriei la presiunea osmotică intracelulară, de 16-25 atmosfere.

6. 6
c) Are rol în diviziunea bacteriei, participând la formarea septului
transvers.
d) Este sediul antigenelor care pot induce un răspuns specific (umoral sau celular) în
organismul în care pătrund bacteriile.
e) Este sediul unor receptori pentru ataşarea altor celule (microfage, macrofage) sau a unor
proteine plasmatice (opsonine) şi pentru fixarea unor virusuri (bacteriofagi).
f) Are rol important în patogenitatea germenilor, fiind sediul unor factori de patogenitate.
Membrana citoplasmatică. Membrana citoplasmatică (numită şi membrana celulară sau
membrana plasmatică) reprezintă bariera dintre interiorul şi exteriorul celulei. Are
grosimea de 50 Å şi o structură obişnuită de mozaic fluid. Membrana citoplasmatică are
permeabilitate selectivă. Sistemul de transport electronic, principalul sistem energetic al
celulei, este localizat la nivelul membranei citoplasmatice, fiind sediul respiraţiei
bacteriene.
Mezozomii sunt invaginări complexe ale membranei citoplasmatice, observate la
majoritatea bacteriilor.
Pot avea formă veziculară, tubulară sau lamelară. Funcţia lor nu este bine cunoscută, dar
se presupune că, fiind în contact cu nucleul prin capătul lor intern, de aici porneşte
semnalul de diviziune a nucleului. Acest semnal se declanşează în momentul
în care raportul suprafaţă/volum se modifică în favoarea volumului.
Componentele citoplasmatice. Principalele componente citoplasmatice sunt ADN-ul,
ribozomii şi vacuolele. Citoplasmă este un sistem coloidal dens, omogen ce conţine
proteine, enzime, lipide, săruri minerale, pigmenţi, glucide, vitamine.
Structura intracitoplasmatică variază cu vârsta bacteriei. Citoplasmă celulei tinere are
un aspect omogen, iar a celulei bătrâne are un aspect vacuolar.
l. ADN-ul. Celula bacteriană nu are o membrană nucleară, aspect caracteristic al celulelor
procariote.
a. ADN-ul nuclear este concentrat în citoplasmă sub forma unui nucleoid. Nucleoidul este
format dintr-o moleculă de ADN dublu-catenar, circulară,cu un diametru de 20Å şi
o lungime de l mm, numită cromozom. Existenţa unui singur cromozom conferă
caracterul de organism haploid bacteriei.
b. în anumite bacterii, în citoplasmă există şi ADN extracromozomial
structuri numite plasmide), de asemenea circular, dar cu o moleculă mult mai scurtă
decât a ADN-ului cromozomial. Plasmidele conţin în general gene implicate în rezistenţa
la antibiotice (factorul R) sau în codificarea altor funcţii nevitale.
2. Ribozomii. Sunt structuri complexe compuse din ARN şi proteine. Au un diametru de
aproximativ 20 nm. a. Coeficientul de sedimentare al ribozomilor bacterieni este 70 de
unităţi Svedberg (70 S), ca la orice celulă procariotă. Funcţia ribozomilor este de sinteză
a proteinelor. Antibiotice precum streptomicina, tetraciclină şi cloramfenicolul inhibă
sinteza de proteine
în ribozomii bacterieni.
3. Granule de depozit (vacuole şi incluziuni). Conţin diverşi metaboliţi de natură organică şi
anorganică, care fie folosesc ca material necesar proceselor anabolice, fie sunt produse de
catabolism. Prezenţa lor şi cantitatea în care se găsesc variază în raport cu tipul de
bacterie, cu vârsta şi cu activitatea metabolică. Citoplasmă celulelor bătrâne nu mai este
omogenă, ci devine granulară prin acumularea unui număr mare de vacuole.

7. 7
C. Structuri externe. Capsula, flagelii şi pilii sunt structuri ce se găsesc în afara învelişului
bacterian. Sunt structuri facultative.
1.Capsula, înveleşte unele bacterii, fiind învelişul situat cel mai la exterior. Este de natură
mucopolizaharidică, cel mai adesea; la unele bacterii capsula este de natură
mucoproteică, fiind compusă din D-aminoacizi. În coloraţia obişnuită cu albastru de
metilen apare necolorată, ca un halou în jurul bacteriei sau grupului de bacterii.
Reprezintă un factor de patogenitate. Antigenele capsulare au o mare specificitate.
2. Cilii şi flagelii. Sunt prezenţi la numeroase bacterii şi reprezintă un organ
de locomoţie. Reprezintă organe de mişcare şi sânt caracteristici bacteriilor baciliforme.
Lungimea lor depăşeşte considerabil lungimea celulei bacteriene. Flagelii pornesc de la
corpusculul bazai, dispus în citoplasmă, şi ies la suprafaţa celulei. Viteza deplasării
bacteriilor depinde de numărul şi dispoziţia flagelilor, de vârsta bacteriilor şi influenţa
factorilor mediului exterior. Flagelul bacterian este compus dintr-un singur tip de proteină,
numită flagelină. Flagelina este o proteină contractilă. Flagelinele reprezintă antigeni cu
mare specificitate.
Unele bacterii au un singur flagel – monotrih, altele prezintă un mănunchi de flageli situat
la un pol al celulei- amfitrihi,la doi poli – lofotrihi, iar altele prezintă flageli (cili) pe
toată suprafaţa - peritrihi.
3. Pilii. Sunt fibre proteice ce acoperă complet suprafaţa bacteriilor Gram- negative.
Pilii sunt de două feluri: comuni şi sexuali. Pilii comuni au originea la nivelul membranei
celulare şi străbat peretele bacterian. Pilii comuni, numiţi şi fimbrii, sunt compuşi dintr-un
singur tip de proteină, cu molecula în formă de filament helicoidal. Pe aceşti pili există
receptori ce recunosc numai anumite structuri din organism. Au rol în aderenţa bacteriană
şi, prin aceasta, intervin în patogenitate.
Pilii sexuali (factorul F). Sunt implicaţi în conjugarea bacteriană, permițând trecerea
materialului genetic de la o bacterie la alta. Au deci rol în mecanismele de variabilitate
genetica.
4. Sporul. Reprezintă o formă de rezistenţă prezentă doar la anumite specii bacteriene
(de ex. la familia Bacillaceae). Forma sporului este sferică sau ovalară. Formarea sporului:
în jurul nucleului bacterian se dispun structuri ce conţin H2O legată (dipicolinatul de Ca),
conferind o rezistenţă deosebită la variaţiile de temperatură şi la uscăciune. În funcţie de
specie, rezistă la temperaturi de peste 100° C timp de 2-3 ore, în condiţii favorabile sporul
germinează trecând în forma vegetativă.
Structurile sporului (de la exterior spre interior): exosporium, peretele sporal, cortexul
sporal (alcătuit din lamele concentrice), ADN-ul cromozomial, sporal.
Rolul sporului este de a asigura perpetuarea speciei bacteriene în condiţii nefavorabile, bacteria
trecând în forma de rezistenţă - sporul. Nu are rol în multiplicare sau patogenitate.
4.METODA MICROSCOPICĂ DE DIAGNOSTIC.
Studiază morfologia şi structura bacteriilor, precum şi caracterele lor tinctoriale
1. În stare nativă (preparate umede, necolorate: “între lamă şi lamelă”, “picătură suspendată”). Studiază
morfologia, mobilitatea bacteriilor, unele activităţi (ex.: sporogeneza)
2. În frotiuri (preparate fixate şi colorate)
III. Tehnici de colorare
Caracterele morfologice ajută identificarea germinilor. Acestea pot fi observate la microscopul
optic cu ajutorul frotiurilor – preparate din produse patologice sau culturi bacteriene ce

8. 8
se depun pe o lama de sticlă, se usucă şi se colorează. Caracterele morfologice se pot
modifica în condiţii nefavorabile, în condiţii optime, la celulele tinere caracterele se
păstrează.
A. Coloraţia cu albastru de metilen
Este o coloraţie simplă, utilizându-se un singur colorant. Se face în mod obligatoriu
pentru frotiurile efectuate din produse patologice deoarece prezintă unele avantaje:
1. Poate evidenţia germenii extracelulari, dar mai ales pe cei intracelulari.
2. Evidenţiază germenii încapsulaţi.
3. Pune în evidenţă relaţiile dintre germeni şi elementele figurate din produs.
B. Coloraţia Gram
Se foloseşte în mod obligatoriu în diagnosticul bacteriologic. Este o metodă complexă cu
doi coloranţi şi un decolorant, numită tehnica diferenţială. Etapele coloraţiei Gram se
derulează astfel:
1.Pe frotiul fixat se pune VIOLET DE GENŢIANĂ (colorant bazic) timp de
l minut. La sfârşitul acestui timp toţi germenii vor fi coloraţi în violet.
Majoritatea bacteriilor au afinitate puternică pentru coloranţii bazici, excepţie
făcând mycobacteriile şi spirochetele.
2. Se adaugă LUGOL care are rol de mordant (fixator de culoare).
3. Se scurge lugolul şi se adaugă un amestec de ALCOOL cu ACETONĂ în
scopul decolorării. Decolorarea durează 7-8 secunde.
Bacteriile cu un conţinut mare de mureină în perete (70-80%) rezistă la decolorare, însă
cele cu un conţinut mic de mureină şi mare de lipide se decolorează.
4. Urmează spălarea cu apă de robinet.
5. Urmează recolorarea cu FUXINĂ 10% timp de l minut. Fuxina, colorant
roşu, va recolora bacteriile decolorate.
6. Se spală lama cu apă, se usucă şi apoi se examinează la microscopul optic.
Bacteriile colorate în violet sunt Gram-pozitive, iar cele colorate în roşu
sunt Gram-negative.
C Coloraţia Ziehl-Nielsen
Mycobacteriile (bacilul tuberculozei, bacilul leprei) au în compoziţia peretelui bacterian
acid micolic care le conferă impermeabilitate pentru coloranţi. De aceea nu se pot colora
cu tehnica Gram.
Pentru aceşti germeni, numiţi AAL (acid-alcoolo-rezistenţi) se foloseşte o tehnică
specială, coloraţia Ziehl-Neelsen.
( l ) Se acoperă lama în întregime treime cu FUXINĂ concentrată şi se încălzeşte de 3
ori l flacăra până la apariţia vaporilor de apă, cu pauze de cate 2 minute.
2 ) Se scurge Fuxiua si se spală lama cu apa
(3)Urmează decolorarea cu soluţie ACID-ALCOOL, timp de 2 minute.
(4)Se spală lama cu apă.
(5)Se recolorează cu ALBASTRU DE METILEN.
(6)Se spală lama cu apă, se usucă şi apoi se examinează la microscopul optic.
Comentariu: La sfârşitul timpului (2) toţi germenii sunt coloraţi în roşu, chiar şi
mycobacteriile (la căldură acidul micolic din compoziţia peretelui bac teri an devine
permeabil pentru fuxină).
La decolorare, la rece mycobacteriile vor fi impermeabile, deci nu se vor decolora. Toţi
ceilalţi germeni, Gram-pozitivi sau Gram-negativi, se vor decolora, iar apoi se vor colora în

9. 9
albastru cu albastru de metilen. Imaginea la microscop ne prezintă mycobacteriile de culoare
roşie, pe un fond albastru.
D. Evidenţierea granulelor de volutină după metoda Neisser
1. Pe frotiul fixat în flacăra arzătorului se aplică pe 1-2 min albastru după Neisser.
2. Se varsă colorantul şi se aplică câteva picături soluţie de Lugol pe 1 minut.
3. Preparatul se spală cu apă şi se absoarbe excesul cu hârtie de filtru.
4. Suplementar se recolorarea cu soluţie de hrizoidină sau vizuvin pe 2-3 minute.
5. Preparatul spălat cu apă, uscat, se examinează la microscop cu imersia.
E. Coloraţia Burry Hinss cu evidenţierea capsulei
1. Pe lama portobiect se aplică o picătură de tuş diluat de 10 ori, în ia se diluiază o picătură de
cultură, care se repartizează uniform pe toată suprafaţa frotiului (exact ca şi frotiul de sânge),
apoi se usucă la temperatura camerei.
2. Preparatul se fixează prin metoda chimică cu ajutorul alcoolului sau clorurii de mercur, apoi
se spală cu apă.
3. Se aplică fuxina Pfeiffer timp de 3-5 minute, atent se spală cu apă şi se usucă.
4. Se microscopiază cu imersie.
J. Coloraţia sporilor după metoda Aujeszky.
1. Produsul microbian în picătură groasă este expus la o margine de lamă.
2. Pe frotiul uscat la temperatura camerei se toarnă câteva picături de soluţie de acid clorhidric
0,5% şi se încălzeşte 1-2 minute până la apariţia vaporilor, după ce se varsă excesul de acid
de pe preparat.
3. Preparatul se spălă cu apă, se absoarbe excesul de apă şi se fixează în flacăra arzătorului.
4. Se acoperă lama cu soluţie de fucsină Zeihl. Se încălzeţte în flacăra arzătorului până la
emitere de vapori.
5. Se decolorează frotiul repetat cu alcool clorhidric (acid sulfuric 5%) până rămâne incolor
(cca 2 min).
6. Se spală abundent lama cu apă de robinet.
7. Se recolorează 3-5 minute cu soluţie de albastru de metilen Loeffler.
8. Preparatul se spălă cu apă, se absoarbe excesul de apă şi se examinează la microscop cu
imersia.
Bibliografie:
De bază:
1. Ch.Piatkin, Iu. Krivoşein, Microbiologie, Ed. Lumina, Chișinău, 1993.
2. F.K Cerches, L.B.Bogoiavlenscaia, N.A.Belscaia Microbiologia, Chișinău, Știința, 1994.
3. Petru Galeţchi, Dumitru Buiuc, Ştefan Plugaru Ghid practic de microbiologie medicală,
Î.I.P. Știința Chișinău, Editura tehnică București, 1997.
Suplimentară:
1. G.M.Şub (sub redacţia) Bazele bacteriologiei, virusologiei şi imunologiei medicale, 2003.
2. Lucia Debeleac, M.C.Popescu – Drânda, Microbiologie, Editura medicală AMALTEA,
2003.
3. А.С.Лабинская Микробиология с техникой микробиологических исследований.
4. Buiuc D., Neguţ M., Tratat de microbiologie clinică, Bucureşti, 1999.