1. DNA sequencing
Смирнов Арсений

2. ДНК – наиболее «освоенная»
биологическая макромолекула

3. Методики работы с ДНК
1. Выделение
2. Электрофорез
3. Рестрикция
4. Лигирование
5. Гибридизация
6. Полимеразная цепная реакция
7. Секвенирование
8. ДНК-микрочипы

5. Electrophoresis

6. Ethidium bromide

7. CTGGCCTCAAGTTATCCTCCCACTCAGTCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTAAGCCACCTCACCCTGTCAGCCTAAAGACA
GTGCTTAATGAAGAGAAATATAAGTGCTTTGAGCAATGGAAGTATAATTAAAATTATACTATGAAAGATTTATAAAGATGACCATTT
TGAATGGGACCACACTTATTTGGTTATATAAATTATGATACACTATTAAAAATTCATCATGATGATTTTGTATTTACATTTTATTTACAT
GTTTGCAATTTGTGAGGAAAGCTAAAATTATGGCTAAGCCATAAATATTTTTGCAGTTTGTTGAGGGTGTTTGTAAAAGTGTTGCC
AAGGAAGACCAGTTGGCTACCCAAACAAGGGTTTAGTCTAGGTCTGATCAATACATACACATTATCTCAGGTTTGTCTATCAGAAA
AACCTTAGGTTATCCAAATCAAAATAAAATAGATGCATAAAACAAAGGCCAATATGTGTTGAACAATTATATTGTGATATACAACTG
CCAAGCATTCCCGATTACCATGACTCCATTTAGTCAGTCCATGGGCAAATGCCATCAATGAGGACAGCCCAGGGTTTCCATATTCT
CTCTTGGCTTTACATCCTATAGGAATTGGAGGGGC
?

8. Севенирование ДНК
- анализ первичной структуры ДНК
(прочтение последовательности нуклеотидов)
Классические методы:
• Максам-Гилберт (химическое)
• Сэнгер (энзиматическое)

9. Химическое секвенирование
(Максам-Гилберт)
Четыре группы химических реагентов, разрезающих
молекулу ДНК перед нуклеотидами:
• G (DMS – dimethylsulphate, диметилсульфат)
• A или G (FA – formic acid, муравьиная кислота)
• T или C (H – hydrazine, гидразин)
• C (H+S – гидразин+соль)

10. Секвенирование (Максам-Гилберт)

11. DNA structure

12. DNA replication

13. Chemistry of DNA synthesis

14. DNA synthesis catalized by DNA
polymerase

15. Энзиматическое секвенирование
(Сэнгер)
Исскуственный синтез ДНК в пробирке

18. Секвенирование (Сэнгер)

19. Сравнение секвенирования по
Максаму-Гилберту и по Сэнгеру

20. Капиллярный электрофорез

21. Автоматическое секвенирование

22. Автоматическое секвенирование

23. Полногеномное секвенирование
1. Геном разбивается на небольшие перекрывающиеся
фрагменты
2. Фрагменты секвенируются
3. Сиквенсы собираются в итоговую последовательность
• картирование
• перекрывание

24. Проект «Геном человека»
1990-2003
Джеймс Уотсон и Крейг Вентер – первые люди с
индивидуальными прочитанными геномами

25. Международный консорциум Celera Genomics
Метод Hierarchical shotgun Whole-genome shotgun
Планируемые сроки 1990 – 2005 1998 – раньше гос. проекта
Планируемый бюджет 3 млрд. $ 300 млн. $
Доступность
результатов
Полностью доступны Полностью запатентованы
«Геном человека»
Государственный проект vs. частная компания

26. «Геном человека»
Государственный проект vs. частная компания

27. Полногеномное секвенирование
подход, основанный на картировании

28. Библиотеки ДНК
- большое число молекул векторной
ДНК со встроенными фрагментами
чужеродной (анализируемой) ДНК

29. Полногеномное секвенирование
подход, основанный на перекрывании

30. 1990 1995 2000 2003
3 500 000 000 $
«Геном человека»

31. Стоимость секвенирования одного генома
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
“Sanger” “NGS”
1 000 000 000 $
1 000 000 $
100 000 000 $
10 000 000 $
100 000 $
10 000 $

32. Next-generation sequencing =
High-throughput sequencing =
Massive parallel sequencing
34

33. Стоимость секвениорвания
Sanger NGS NNGS
35

34. Накопление данных
bases bytes
36

35. Накопление данных
37

36. 38

37. Sanger NGS
Library preparation
Template preparation
Sequencing
39

38. NGS approaches
• Sequencing by synthesis
– Pyrosequencing
– Semiconductor sequencing
– Sequencing by reversible termination
– Phospholinked Fluorescent Nucleotides or Real-
time sequencing
• Sequencing by ligation
40

39. 41

40. “Benchtop” sequencers
42