1. Zależne od TP53 zróżnicowanie odpowiedzi na promieniowanie jonizujące - badanie na poziomie transkryptu MW
2. CEL PRACY Celem niniejszej pracy było zbadanie jakie cechy strukturalne transkryptów mogą korelować ze zmianami po napromieniowaniu w komórkach HCT 116, oraz wpływu białka P53 na stabilizację i destabilizację transkryptów.
3. Zakres pracy obejmuje: Analizę długości i składu nukleotydowego części kodującej i końców 3’ (3’ UTR) transkryptów Obecności motywów sekwencyjnych wiążących miRNA Komplementarności motywów wiążących miRNA obecnych w sekwencji kodującej i końca 3’ Zbadanie struktury genów o przeciwnych kierunkach zmian ekspresji w liniach HCT 116 p53+/+ i HCT 116 p53 -/-
4. Materiał analizowany Dane z mikromacierzy AffyMetrix dotyczace transkryptomu komórek: HCT_p53PK1.CEL P K HCT_p53MK1.CEL N K HCT_p53P0h.CEL P 0 HCT_p53M0h.CEL N 0 P-pozytywny N-zmutowane (p53-/-) K-kontrola, 0h-czas bezpośrednio po napromienieniu. 22283 zestawów sond Affymertix
5. Elementy analizy Wczytanie danych i normalizacja oraz usunięcie szumu Podział genów na grupy dla kryterium zmian 150%: Grupa I geny których ekspresja wzrosła Grupa II geny których ekspresja zmalała Grupa III geny których ekspresja nie uległa zmianie
7. Analiza długości sekwencji kodujących transkryptów, porównanie grupy I i II dla linii HCT116 p53+/+ Wykres średnich długości sekwencji kodujących po odrzuceniu wartości odstających Wyniki testu Welcha i Wilcoxona nie wykazują istotnej statystycznie różnicy w długościach części kodującej transkryptów pomiędzy Grupą I (UP) i Grupą II (DOWN)
8. Analiza długości sekwencji kodujących transkryptów, porównanie grupy I i II dla linii HCT116 p53-/- Wykres średnich długości sekwencji kodujących po odrzuceniu wartości odstających Wyniki testu Welcha i Wilcoxona wykazują różnicę istotną statystycznie w długościach części kodującej transkryptów pomiędzy Grupą I (UP) i Grupą II (DOWN)
9. Podobna analiza wykonana dla sekwencji 3’ UTR transkryptów nie wykazała istotnych różnic długości między grupami w żadnej z linii komórek
11. Transkrypty których poziom zmieniał się różnie w komórkach zawierających i nie zawierających białka P53 (grupa transkryptów „różnicujacych”) Ilość genów o zmiennej ekspresji w zależności od linii komórkowej - „geny różnicujące”.
12. Analiza długości sekwencji 3’ UTR w transkryptach grup R1 i R2 Długości sekwencji 3’ UTR grup R1 i R2 różnią się na poziomie istotności p=0.057 (test Wilcoxona)
13. Wyszukiwanie motywów miRNA w transkryptach 714 miRNA mirnada (open source Linux) http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do Parametry: Score cutoff S>= 140 Energy cutoff E<= -7.0 Gap opening: -9.0 Gap extension -4.0
14. Przykłady miRNA o największej grupie genów docelowych Pierwsze 10 miRNA posortowane wg największej ilości transkryptów mogących dołączać miRNA do sekwencji końca 3’ dla genów których ekspresja wzrosła w HCT 116 p53-/-. Motywy rozpoznawane przez miRNA występują w częściach 3’ UTR i sekwencjach kodujących
15. Nie wszystkie motywy są całkowicie komplementarne do swoich miRNA Wskaźnik dopasowania motywów miRNA jest jednakowy dla transkryptów w grupach UP i DOWN Wskaźnik dopasowania motywów miRNA różni się dla motywów obecnych w częsciach kodujacych i cześciach 3’ UTR transkryptów we wszystkich badanych grupach (p<0.05, testy Wilcoxona i Welcha)
16. WNIOSKI Stabilizacja lub destabilizacja transkryptów w komórkach HCT 116 nie jest związana z mechanizmami operującymi na końcu 3’ transkryptu ponieważ nie obserwujemy różnic w strukturze końców 3’ transkryptów, których ekspresja wzrosła lub zmalała pod wpływem promieniowania Istnienie różnicy w długości części kodującej transkryptów ulegających stabilizacji (UP) lub destabilizacji (DOWN) sugeruje, że w komórkach nie zawierających białka P53 istnieją czynniki stabilizujące, oddziaływujące z częścią kodującą transkryptu. We wszystkich badanych grupach istnieją różnice pomiędzy częścią kodująca i 3’ UTR w dopsowaniu motywów rozpoznawanych przez miRNA (w częsci kodującej motywy są znacznie lepiej dopasowane – charakteryzuje je wyższy współczynnik)
