2. La struttura molecolare dei canali del Ca 2+ è nel suo insieme del tutto simile a quella dei
NaV, sebbene (piccole) differenze nelle sequenze cambino profondamente la selettività, il
gating e la sensibilità ai farmaci.
Le subunità alfa sono costantemente associate a subunità accessorie, in numero maggiore
di quelle del Na+: α2, β, γ e δ.
I canali del Ca VD sono tutti bloccati (pur con sensibilità diverse) dal Cadmio (Cd2+) e
dai “metalli pesanti” (Ni2+, Co2+ e La3+).
3. Organizzazione strutturale dei canali del Ca VD
Subunità α1: 4 domini omologhi (IIV), con 6 segmenti transmembrana
ciascuno;
Subunità β: intracellulare, costituita
da più a eliche;
Subunità α2δ: in giallo le regioni
idrofobiche;
I siti di interazione tra le subunità
sono indicati da frecce bipolari.
4. Classificazione in base alle proprietà elettrofisiologiche:
a) Canali LVA (low-voltage-activated (-70mV); avendo una spiccata
inattivazione voltaggio-dipendente, sono stati chiamati canali T (“transient”).
Sono sensibili all’amiloride.
b) Canali HVA (high-voltage-activated (-30m/-20V); hanno un’inattivazione
molto più lenta.
Correnti di Ca HVA
0 mV
Correnti di Ca LVA
-40 mV
100 pA
30 ms
400 pA
30 ms
Poi s’è visto che si tratta di una famiglia comprendente molti membri, che sono stati
indicati da lettere (P, Q, R ecc.)
5.
6. I diversi sottotipi di canali del Ca inattivano in maniera differente
α1C (L)
α1E (R)
50 ms
α1G (T)
7. Possibile modello di inattivazione VD dei canali del Ca
Il linker intracellulare tra i domini I e II potrebbe agire da particella inattivante che
fisicamente occluderebbe il poro del canale interagendo, almeno in parte, con le regioni
S6 dei domini II e III del canale. La subunità β del canale del Ca si associa con il linker
tra i domini I-II modificando le proprietà dell’inattivazione; essa potrebbe interagire sia
con la subunità α1 che con la membrana.
8. Possibile modello di inattivazione Ca-dipendente dei canali del Ca
Un’elevata concentrazione di Ca intracellulare innesca l’inattivazione dei canali di tipo L. Il
sensore per il Ca sarebbe una molecola di calmodulina (CaM). CaM è costitutivamente
legata al complesso del canale. L’inattivazione avverrebbe tramite un’interazione Cadipendente della CaM legata con un motivo IQ-simile sulla coda carbossilica di α1C. È
possibile che un meccanismo analogo intervenga anche a livello dei canali N, P/Q ed R
(Peterson, Neuron, 1999).
CHIUSO
APERTO
INATTIVATO
Ca2+
Voltaggio
•
•
•
•
Nello stato chiuso (iperpolarizzato) l’accesso della CaM alla regione IQ-simile è ridotto.
Nello stato aperto (depolarizzato) la CaM legata ha un rapido accesso al dominio IQ-simile.
L’accumulo di Ca2+ sulla bocca interna del canale porta all’attivazione Ca-dip. della CaM.
L’interazione di CaM-Ca2+ con la regione IQ-simile induce l’inattivazione del canale.
9. Canali voltaggio-dipendenti per il Ca2+ di tipo L
I canali “L” o recettori per le di-idro-piridine (DHP, come la
Nifedipina o la nimodipina) hanno un’enorme importanza in
Fisiologia. Sono tipici del muscolo scheletrico, ma sono presenti
anche nel cuore (*) e nel sistema nervoso.
Hanno un’inattivazione più o meno lenta, che è anche Cadipendente.
(*) il bloccante Verapamil viene impiegato nella cura della tachicardia parossitica
10. Canali VD per il Ca2+ di tipo L nel muscolo scheletrico
Nel muscolo scheletrico, i canali L sono addensati nei tubuli trasversi del reticolo
sarcoplasmatico, dove funzionano da “sensori del voltaggio”. Sono accoppiati
(con l’ansa di connessione II-III) ad altri canali del Ca2+ (Ca-dipendenti) presenti
nei tubuli longitudinali del ret.sarc., detti “recettori della Ryanodina”. Si attiva
così un il rilascio di Ca che attiva con grande rapidità (per feedback positivo)
l’apparato contrattile.
11. Modello per il rilascio voltaggiodipendente del Ca2+
A riposo
+
+
TT
-
+
+
+
RS
2+
Ca
-
Sensore
del volt.
Canale
di rilascio
Vm
-
Depolarizzata +
-
+
+
+
+
2+
Ca
2+
Ca
12. Canalopatie dove sono coinvolti canali del Ca2+ VD
Si è osservato che la paralisi periodica ipokaliemica, che si manifesta con debolezza muscolare che compare
all’adolescenza, è associata a mutazioni del gene del canale L (cromosoma 1). I segmenti S4 dei domini II o IV
hanno meno Arg (quindi i canali hanno minor sensibilità al voltaggio) e l’inattivazione è più rapida.
E’ comprensibile che queste caratteristiche riducano il rilascio intracellulare di Ca2+.
Si pensa che mutazioni del gene del RYR (cromosoma 19) siano la causa della ipertermia maligna: un’anomala
risposta all’anestesia generale con alotano e succinilcolina (convulsioni muscolari dovute ad un aumentato rilascio
di Ca2+ intracellulare, aumento della temperatura corporea, squilibrio idrosalino) che risulta fatale in 1 caso su
20.000.
La situazione è recentemente migliorata grazie alla diagnosi precoce ed all’uso del dantrolene, che inibisce il
rilascio di Ca2+ da parte del ret.sarc.
Può essere interessante ricordare che la mutazione è presente in tutti i maiali domestici (mentre manca nei porci
selvatici) che presentano sensibilità all’alotano. E’ probabile che la mutazione sia stata selezionata
(inconsapevolmente) dagli allevatori perché si accompagna ad aumento della massa muscolare.
13. Canali VD per il Ca2+ di tipo L nel muscolo cardiaco
Accoppiamento EC Cardiaco
(Ca2+-induced-Ca2+-release)
TT
+
SR
TT
Vm
Ca2+
Canale del Ca2+ Canale di rilascio
+ +
SR
14. Ruolo dei canali voltaggio-dipendenti per il Ca nel PdA cardiaco
(tessuto di lavoro)
Solitamente l’ingresso di Ca2+ attraverso canali VD accompagna (e prolunga) i pda al
Na+. E’ il caso delle fibrocellule muscolari scheletriche, ma soprattutto delle fibrocellule
muscolari cardiache.
Qui l’ingresso di Ca2+ non solo potenzia l’effetto
del Na+ nella fase iniziale del pda (depolarizzazione
ed overshoot), ma perdura anche quando i canali del
Na+ si sono inattivati (l’inattivazione dei canali del
Ca2+ c’è, ma è incompleta), dando luogo ad un
lungo “plateau”.
Domanda: ma se durante il plateau entrano cariche positive sotto
forma di ioni Ca2+, perché il pdm si mantiene costante <attorno
allo zero> ?
Risposta: perché durante il “plateau” la corrente entrante di Ca2+ è
esattamente controbilanciata da una corrente uscente di K+
<attraverso canali al K+ che incontreremo tra breve>
15. Questo lunghissimo “plateau” del pda cardiaco è funzionalmente importante per due
buone ragioni:
a) il Ca2+ che entra attraverso i canali (L) della membrana plasmatica attiverà il “Caactivated Ca-release” del reticolo sarcoplasmatico, quindi la contrazione del cuore;
b) mantenendo depolarizzata la membrana, la
rende ineccitabile per tutta la sua durata (perché
mantiene inattivati i canali del Na+).
In altre parole: durante il plateau, il cuore si
trova in uno stato di refrattarietà assoluta,
quindi per tutta la durata della contrazione
(della sistole) non può essere nuovamente
eccitato.
La situazione è molto diversa da quella che si
ha nel muscolo scheletrico, nel quale la
refrattarietà assoluta termina ancor prima che
inizi la contrazione.
16. Il muscolo scheletrico infatti (per fortuna !) è
tetanizzabile, cioè le singole “scosse” possono
sommarsi tra loro fino alla completa fusione,
producendo un aumento della forza contrattile.
Di fatto, la maggior parte delle nostre contrazioni
sono dei “tetani”.
Il cuore invece (per fortuna !) non è
“tetanizzabile”:
qualunque stimolo “ectopico” è inefficace per
tutta la durata della sistole (I), e può produrre
una seconda contrazione (“extrasistole”) solo
mentre il cuore si sta rilasciando..
Ma qui stiamo uscendo dal seminato !
17. Potenziali d’azione al Ca2+ nelle cellule pacemaker cardiache
Non mancano esempi di pda sostenuti solo dall’ingresso autorigenerativo di Ca2+, come il
gigantesco pda delle cellule del Purkinje del cervelletto, evocato dalla stimolazione delle
fibre rampicanti (attivazione di canali P).
Un altro esempio funzionalmente molto rilevante è quello del miocardio di conduzione
(tessuto “pacemaker” del cuore).
Questi pda al Ca2+ si generano
spontaneamente (o meglio, per
effetto dell’automatismo tipico del
pacemaker), e poi si propagano a
tutte le fibrocellule del miocardio di
lavoro (che di per sé resterebbero in
riposo).
Queste,
eccitate,
genereranno i pda provvisti di
“plateau” che abbiamo visto prima.
Curiosamente, nel miocardio di conduzione il contributo del Na+ non manca perché i canali del Na+ siano assent:. questi ci sono, ma
non entrano in gioco perché sono sempre inattivati (nel tessuto pacemaker, il potenziale di membrana non diviene mai sufficientemente
negativo da rimuoverne l’inattivazione).
18. Interazione tra canali “T” e canali “f”
L’esempio del pda (al Ca2+) del pacemaker cardiaco ci offre l’opportunità di parlare di un
altro tipo di canali voltaggio-dipendenti: i canali “f” (“funny”), espressi anche in molti
neuroni autoritmici del SNC (dove vengono chiamati canali “h”)
I canali del Ca2+ di tipo L (e T)
sostengono il pda, ma per essere attivati
necessitano di una depolarizzazione della
membrana.
Questa,
nelle
cellule
autoritmiche, avviene “spontaneamente” e
si chiama prepotenziale.
Nel tessuto pacemaker, il prepotenziale (e
con esso l’automatismo cardiaco) è
generato dall’apertura dei canali-f .
19. Modulazione dei Canali “f”
Di grande importanza è la “modulazione” (variazione della sensibilità al voltaggio) dei canali f
operata dall’orto- e dal para-simpatico tramite i rispettivi neurotrasmettitori
<noradrenalina(+adrenalina) ed acetilcolina>.
Modulando i canali f, l’orto- ed il para-simpatico regolano la frequenza cardiaca (!!), come se fossero l’uno
l’acceleratore e l’altro il freno di un’automobile.
Questi neurotrasmettitori agiscono su recettori accoppiati a proteine-G e fanno rispettivamente aumentare e
diminuire il livello intracellulatre di AMPc. I canali f sono voltaggio-dipendenti, ma anche chemio-dipendenti (dal
versante intracellulare), una condizione tutt’altro che infrequente.
21. Attività ritmica spontanea in un neurone talamico
Attività oscillatoria
Bursts di PdA dovuti
all’interazione della corrente
di Ca2+ IT con la corrente
pacemaker entrante Ih
-65 mV
1s
att
iva
n
zio
e Ih
Ih
ne I T
io
az one
i
tiv
at az
de attiv
in
-65 mV ------
attivazione IT
PdA al Na+
Spike al Ca 2+
Potenziale
pacemaker
rimozione
inattivazione IT
22. Gli stadi del sonno sono caratterizzati da cambiamenti nelle registrazioni EEG
Veglia – occhi aperti
Veglia – occhi chiusi
Sonno non REM – stadio I
Sonno non REM – stadi II e
III
Sonno non REM – stadio IV
Sonno REM
Sonno non-REM, Stadio IV
(SWS; Slow-Wave-Sleep ‘sonno
profondo’):
onde ampie a bassa frequenza (~1
Hz, ‘onde delta’) sono attivi pochi
neuroni ma altamente sincronizzati
23. I neuroni talamocorticali nei
nuclei di relay del talamo hanno
due modalità di scarica
(vedi registrazioni)
25. La genesi di un burst di pda in un singolo neurone del NRT può generare un IPSP nelle cellule
talamocorticali del nucleo reticolare (NRT) che è sufficientemente ampio da generare uno spike
al Ca2+ e un burst di pda.
Una depolarizzztione del neurone del NRT non solo porta questa cellula a scaricare con modalità
tonica, ma modifica drammaticamente anche ampiezza e andamento temporale dell’IPSP
risultante nel neurone talamocorticale del nucleo di relay. Treni di pda nel NRT generano solo
IPSP di piccola ampiezza nelle cellule talamocorticali.
26. Attività elettrica registrata da neuroni coinvolti nel sonno SWS e durante la veglia
Registraz. extracell.
da neurone corticale.
Registraz. extracell.
da neurone del NRT
Registr. extracell.
dal nucleo di relay.
Registr. intracell
dal nucleo di relay.
27. La depolarizzazione di neuroni talamocorticali in seguito ad una iniezione intracellulare di
corrente provoca l’abolizione della scarica ritmica a burst e la sua sostituzione con un’attività
tonica, come nella transizione dal sonno ad onda lenta alla veglia (o al sonno REM).
L’abolizione della scarica ritmica a burst è causata dall’inattivazione della corrente di Ca 2+ T e
dalla mancata attivazione della corrente H.
L’applicazione di
ACh o NE causa una
depolarizzazione dei
neuroni
talamocorticali
attraverso la
riduzione di una
corrente di K+ di
"leakage" attiva a
riposo.
Tali risultati indicano che perfino singoli neuroni talamocorticali esibiscono i due diversi stati
dell’EEG: una scarica ritmica a burst durante il sonno ad onde lente, e un’attività tonica durante
la veglia. È interessante osservare che i neuroni talamocorticali scaricano a 0.5-4 Hz, un range di
frequenze comparabile a quello delle onde lente delta.
28. Cellule pacemaker talamiche
• le cellule pacemaker del nucleo reticolare del talamo che scaricano ritmicamente
a bursts inducono i neuroni corticali a scaricare in maniera sincrona nel pattern
dell’SWS (Slow-Wave-Sleep) dell’EEG
• durante la veglia: i neuroni colinergici (ACh), noradrenergici (NE) e
serotoninergici (5-HT) sono attivi e inibiscono le cellule pacemaker talamiche
• durante il sonno SWS, l’attività delle cellule ACh, NE e 5-HT diminuisce: le
cellule pacemaker talamiche sono attive
29. La struttura dei canali HCN
Appartengono alla classe dei canali HCN: “canali cationici attivati
dall’iperpolarizzazione”. Vengono attivati alla fine di ogni pda, quando la
membrana si iperpolarizza.
La loro apertura
genera una corrente
entrante
che,
depolarizzando
la
membrana, produce il
prepotenziale, quindi
il pda successivo.
Una subunità presenta:
6-DTM come i canali Kv
S4 riconosciuto come sensore del voltaggio per l'elevata presenza di residui
carichi positivamente
motivo GYG nel linker S5-S6, tipico del filtro di selettività dei canali Kv
nel C-terminale è presente un dominio CNB come nei canali CNG
si pensa che i canali siano formati da TETRAMERI come i canali Kv
indietro
30. Canali VD per il Ca2+ di tipo L nel muscolo liscio
Nel muscolo liscio, il ret.sarc. è praticamente assente. Qui l’attivazione
dell’apparato contrattile (non organizzato in sarcomeri) è totalmente dipendente
dal Ca2+ che entra attraverso i canali L della membrana plasmatica.
Il fenomeno dell’accoppiamento eccitazione contrazione nei tessuti muscolari
illustra bene la doppia importanza dei canali del Ca2+:
• fanno entrare nella cellula ioni con carica positiva (similmente ai NaV)
• fanno anche comparire nella cellula un vero e proprio secondo messaggero
(gli ioni Ca2+) che ha uno straordinario potere regolatore di molti processi
intracellulari
31. Canali voltaggio-dipendenti per il Ca2+ di tipo N e P/Q nell’esocitosi
Un altro esempio di enorme importanza funzionale è l’ “esocitosi regolata” di
vescicole (v. rilascio di insulina) in tutte le cellule secernenti.
Un caso particolarissimo di “esocitosi regolata” è la liberazione di vescicole
contenenti neurotrasmettitore nella trasmissione sinaptica.
Qui operano canali “N” (per neuronal, bloccati dall’ ω-Conotossina), che sono
esclusivi del SNC, ma
anche canali “P/Q” (bloccati dall’ ω-Agatossina)
ed R, per i quali non è noto alcun bloccante specifico.
32. La trasmissione sinaptica
La combinazione del neurotrasmettitore con i propri recettori presenti nella membrana
postsinaptica consentirà la trasmissione sinaptica
(una depolarizzazione [EPSP] nelle sinapsi eccitatorie o un’ iperpolarizzazione [IPSP]
nelle sinapsi inibitorie…)
Ma questa è una storia che riguarda i canali chemio-dipendenti …
33. Eventi pre-simnaptici
Questi canali sono addensati nelle terminazioni presinaptiche, dove sono essenziali per il
rilascio di neurotrasmettitore.
In particolare sono presenti al centro delle zone attive alle quali sono ancorate le
vescicole sinaptiche pronte al rilascio (“pool” di rilascio).
Le zone attive sono formazioni del citoscheletro altamente ordinate, visibili dal versante
citoplasmatico della membrana presinaptica). In corrispondenza delle zone attive, i lipidi
della membrana sono organizzati a formare dei “rafts” (zattere).
L’arrivo del pda e la conseguente depolarizzazione della membrana presinaptica apre i
canali del Ca2+ ….
…. ed il Ca2+ fa scattare un complesso sistema di controllo. La fusione delle vescicole
promossa dal Ca2+ è preceduta da fasi preliminari:
34. A) “Docking” (attracco) …
La T. botulinica è il veleno più potente che si
conosca
Anche la T.tetanica agisce sul sistema di controllo
della liberazione di vescicole sinaptiche
B) “Priming” (preparazione) …
La latratossina, il principio attivo del veleno della
Vedova Nera, provoca la liberazione spontanea ed
incontrollata delle vescicole
C) all’arrivo del pda si ha la fusione Cadipendente, (preceduta dalla formazione di un
poro
attraverso
il
quale
passerà
il
neurotrasmettitore), che consente l’esocitosi delle
vescicole ancorate alle zone attive (“pool di
rilascio”).
35. Ruolo dei canali del Ca2+ al di fuori delle zone attive della membrana presinaptica
Canali VD per il Ca2+ (solitamente del tipo L) sono anche presenti nella membrana
presinaptica al di fuori delle zone attive (A).
La loro attivazione (B) serve a distaccare le vescicole del “pool di deposito” dai filamenti
di actina del citoscheletro, quindi a rifornire il “pool di rilascio”.
Lo schema C illustra il processo in maggior dettaglio.
Anche in questo caso si mette bene in evidenza il ruolo del Ca 2+ come secondo messaggero intracellulare !
36. L’ingresso di Ca2+ depolarizza la cellula
Il fondamentale ruolo del Ca2+ come “messaggero” intracellulare non deve far
dimenticare che si tratta di un catione, e che il suo ingresso in cellula per apertura di
canali voltaggio-dipendenti avrà degli effetti elettrici sul potenziale di membrana.
In prima approssimazione, è prevedibile che questo ingresso determinerà una
depolarizzazione.
Ma c’è di più: infatti l’ingresso di cariche positive attraverso canali VD attivati dalla
depolarizzazione, in modo del tutto analogo a quanto avviene nel caso del Na+ (A, ma a
differenza di quanto avviene per i canali del K+, B), può facilmente diventare
autorigenerativo e dar luogo a veri e propri potenziali d’azione al Ca2+.
37. La presenza di canali del calcio aumenta l’eccitabilità neuronale
gCa= 0
10 nA
1.5 s
gCa= 2 µS
10 nA
gCa aiuta a raggiungere la soglia
38. Ogni ione può essere trasportato da numerosi tipi di canali ionici, ognuno
con proprietà di attivazione distinte. Questo conferisce una grande
flessibilità alla codificazione dei pda da parte dei neuroni ed è un elemento
chiave per conferire al cervello una notevole capacità computazionale.
ripolarizzazione
aumentata
Rallentamento della
scarica; aumento dell’AHP
firing
ritardato
+ KCa1
La KM determina
adattamento
diminuzione della
risposta alla
ripolarizzazione
velocità di
firing
rallentata
+ KM
+ KCa2
firing a scoppio
(burst)
La KCa determina
adattamento e AHP di
lunga durata
mancanza
di burst
depolarizzazione
(inattiva IT)
È possibile regolare la frequenza, la durata, la regolarità, il ritardo delle
scariche di pda, generando le basi per costruire il codice neuronale.
40. Zone attive della placca neuro-muscolare
Le zone attive della placca neuromuscolare (anch’esse visibili in freeze fracture dalla faccia citoplasmatica della
membrana presinaptica) sono organizzate in modo diverso..
Sono delle “strisce” altamente organizzate, ognuna delle quali assomiglia ad una serie di “costole” articolate su di
una “colonna vertebrale”, ma l’intervento dei canali del Ca2+ (visibili assieme ai pori di fusione dalla faccia della
m. presinaptica che dà verso la fessura sinaptica) nel rilascio di acetilcolina (*) è concettualmente identico.
(*) nelle sinapsi centrali il neurotrasmettitore eccitatorio è quasi sempre l’ acido glutamico
41. Movimenti (compreso il battito cardiaco), sensazioni, pensieri, emozioni (tutte le funzioni del sistema nervoso
dipendenti dalla trasmissione sinaptica) …. avvengono grazie alla presenza di un complesso sistema di canali
ionici che abbiamo appena cominciato ad esaminare.
Naturalmente, si tratta di una condizione necessaria (queste funzioni sono impedite o compromesse se i canali
ionici vengono messi fuori uso) …
… ma non sufficiente, cioè i canali ionici, per essere utili, devono operare in un contesto altamente ordinato di
membrane, trasporti attivi, organuli intracellulari, collegamenti intracellulari, ecc…
42. Neurone del
n. di relay
Neurone
del NRT
Neurone del
n. di relay
Potenziali
d’azione
Neurone
del NRT
La genesi di un burst di pda in un singolo neurone del NRT può generare un IPSP nelle cellule
talamocorticali del nucleo reticolare (NRT) che è sufficientemente ampio da generare uno spike
al Ca2+ e un burst di pda.
Una depolarizzztione del neurone del NRT non solo porta questa cellula a scaricare con modalità
tonica, ma modifica drammaticamente anche ampiezza e andamento temporale dell’IPSP
risultante nel neurone talamocorticale del nucleo di relay. Treni di pda nel NRT generano solo
IPSP di piccola ampiezza nelle cellule talamocorticali.
