Mass-spectrometry based method of cytometry.

1. CyTOF - масс-цитометрия: метод
и применение.
Ультра-высокомультиплексная цитометрия с
помощью время-пролётной масс-
спектрометрии индуктивно-связанной плазмы
и антител, меченых стабильными изотопами
лантаноидов.
Евфратов С. А.

2. ● Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay
Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry
Analytical Chemistry, Vol. 81, No. 16 Aug 15
Разработка аналитического метода масс-цитометрии CyTOF.
● Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a
Human Hematopoietic Continuum
Science. 2011 May 6; 332(6030)
Демонстрация применения метода на примере характеризации клеток
костного мозга.
● Single-cell mass cytometry of TCR signaling: Amplification of small initial
differences results in low ERK activation in NOD mice
PNAS. 2014 Nov 18; 111(46)
Применение CyTOF для изучения передачи сигналов от ТКР.

3. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on
Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry
● Ограничения красителей для цитометрии —
MS изотопных меток как выход.
● Построение прототипа CyTOF на ICP-MS-TOF.
● Калибровка на полимерных частицах с
метками на 3 элементах.
● Подтверждение работоспособности прибора
для клеточных линий с 22 метками.

4. ИСП
Распылитель
Оптимизация
параметров
квадруполя
Отсечение
основной массы
лёгких ионов
Оптимизация
детекции
ионов
Увеличение
скорости съёма,
увеличение
разрешения и
чувствительности

5. Калибровка на Tb-Ho-Tm beads
Tb+ Tm+
Ho+
Сырые
данные

8. Испытание на клеточных линиях

9. KG1a
Ramos
monoblastic M5 AML
monocytic M5 AML
Лимфоидные маркеры
Миелоидные маркеры
Маркеры дифференциации

10. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human
Hematopoietic Continuum
● Комбинированное FlowCy-CyTOF измерение
CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD56, CD20, CD33,
pSTAT3 и pSTAT5 под воздействием IL-2, IL-
6, IL-10, GM-CSF и IFNα.
● 2-наборовое CyTOF фенотипирование по
13+18 маркерам (+ выживаемость, размер и
ДНК) — 34 параметра.
● SPADE-анализ профилей под воздействием
разных стимулов (интерлейкиты, ингибиторы
киназ).

12. SPADE

14. ● Стимуляция Т-клеток анти-TCR + анти-
CD28.
● Мечение 24 изотопными метками (pCD3ζ,
pZAP70, pLAT, pSLP76, pc-CBL, pNF-κB, IκB,
pERK1/2, pS6, pMAPKAPKII, pAKT, pS6,
p4EBP1, pCREB, pFAK) для маркирования и
измерения.
● Профилирование во времени.
Single-cell mass cytometry of TCR signaling: Amplification of small initial differences results in
low ERK activation in NOD mice

17. ● Меньшая активность pERK1/2–pS6 и
меньший уровень pS6.
● Порог фосфорилирования CD3ζ для
максимального фосфорилирования SLP76.
● Смещение вправо для pMAPKAPKII–IκBα и
уменьшение фракции клеток в состоянии
IκBα(low)
Анализ плотности состояний