Sàn lọc và khảo sát emzym Lipase

1. Science & Technology Development, Vol 14, No.T3- 2011
Trang 64
SÀNG L C, THU NH N VÀ KH O SÁT HO T TÍNH LIPASE T BACILLUS
Tr n ðăng Khoa, Lê Quang Huy, Ngô ð i Nghi p
Trư ng ð i h c Khoa h c T nhiên, ðHQG-HCM
(Bài nh n ngày 21 tháng 03 năm 2011, hoàn ch nh s a ch a ngày 18 tháng 11 năm 2011)
TÓM T T: Nghiên c u v i m c tiêu ch n l c ch ng Bacillus có kh năng sinh t ng h p lipase
cao; t 10 ch ng Bacillus, chúng tôi ch n ñư c ch ng Bacillus subtilis OII (BS7) sinh lipase cao nh t
pH = 7,0; n ng ñ cơ ch t 1,2% sau 3 ngày nuôi c y. Ch ph m lipase thu nh n ñư c có pHopt 10,0; topt
60o
C. Ion Mg2+
, Ca2+
là hai ion gi ho t tính; ion b t ho t là Zn2+
, Cu2+
; SDS 0,2% làm gi m 95% ho t
tính lipase. Chúng tôi tinh s ch ñư c lipase c a BS7 có tr ng lư ng phân t kho ng 23,8 kDa. Nh ng
k t qu trên là cơ s cho vi c t o ra lipase tái t h p t Bacillus subtilis OII.
T khóa: Bacillus, lipase, tinh s ch.
GI I THI U
Lipase (EC 3.1.1.3) thu c nhóm ph enzyme
th y phân có serine trung tâm ho t ñ ng c a
t ng h th y phân α/β, xúc tác cho nhi u ph n
ng khác nhau: th y phân các liên k t
carboxylester trong glyceride, chuy n ester
hóa. Trong môi trư ng khan nư c lipase có kh
năng ester hóa rư u, ñư ng, thiol và amin t o
nh ng ester có c u trúc l p th ñ c trưng [4,
10]. Ngoài ra, lipase hi n di n r ng rãi và tham
gia vào s chuy n hóa sinh h c c a lipid trong
t nhiên.
Trong nh ng năm g n ñây, lipase gi m t v
trí quan tr ng trên th trư ng enzyme thương
m i do kh năng xúc tác các ph n ng b m t
phân cách gi a pha nư c và các pha khác
ñi u ki n bình thư ng và không t o ra s n
ph m ph . Lipase chi m 5% th trư ng enzyme
thương m i, ch sau protease và carbohydratase
[10]. Chúng ñư c s d ng trong công nghi p
s n xu t ch t t y r a, th c ph m, m ph m, y
h c, nhiên li u sinh h c, x lý môi trư ng và
các ch ph m sinh h c khác [8].
Lipase có th thu nh n t nhi u ngu n khác
nhau như ñ ng v t, th c v t hay vi sinh v t.
Ngu n thu nh n t vi sinh v t ñư c quan tâm
nhi u nh t do ñi u ki n s n xu t, thu nh n d
dàng. Các vi sinh v t thư ng ñư c s d ng như
Rhizopus, Pseudomonas, Candida, Aspergillus,
Bacillus… [4]
S d ng enzyme trong các ngành công
nghi p, y dư c, … ñang là xu hư ng chung c a
c th gi i. nư c ta, enzyme ch y u ñư c
nh p kh u t nư c ngoài v i chi phí cao, trong
ñó lipase là m t lo i enzyme có giá thành cao
và ñư c ng d ng trong nhi u lĩnh v c khác
nhau [8]. Vì v y, vi c nghiên c u v kh năng
sinh t ng h p, thu nh n lipase có ho t tính cao
và tinh s ch t vi sinh v t là r t c n thi t giúp
Vi t Nam có kh năng s n xu t lipase v i giá
thành r , ch t lư ng cao mang l i hi u qu cho
ngân sách nhà nư c. Bên c nh ñó, vi khu n
Bacillus v i kh năng thích nghi cao, m t s

2. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 14, SOÁ T3- 2011
Trang 65
loài sinh lipase có th ch u nhi t, ch u ki m,
h a h n ng d ng trong m t s lĩnh v c ñòi h i
ñi u ki n khó khăn, kh c nghi t.
V T LI U – PHƯƠNG PHÁP
V t li u
Ch ng vi sinh v t: 10 ch ng Bacillus do
phòng thí nghi m B môn Sinh hóa – Trư ng
ðH Khoa h c T nhiên, ðHQG Tp. HCM
cung c p, kí hi u: BST1, BST2, BS3, BS6,
BS7, B1, Ba1, BL1, BL2, BL141
Hóa ch t: D u olive s d ng ñ xác ñ nh
ho t tính lipase c a hãng Fragata (Tây Ban
Nha).
Phương pháp
Ch n l c ch ng có kh năng sinh lipase cao:
Ch n nhanh ch ng sinh lipase cao b ng so sánh
vòng phân gi i [3].
Phương pháp xác ñ nh ho t tính lipase: Ho t
tính enzyme lipase ñư c xác ñ nh d a trên
phương pháp c a Nobuhiro Watanabe (1977)
[6]. M t ñơn v ho t tính c a lipase ñư c ñ nh
nghĩa là s µmol acid béo ñư c sinh ra trong 1
phút [6, 7].
Phương pháp kh o sát nh hư ng c a th i
gian nuôi c y, pH môi trư ng, n ng ñ cơ ch t
ñ n kh năng sinh t ng h p lipase.
Phương pháp kh o sát các ñ c tính c a
lipase: pH ho t ñ ng, ñ b n, nhi t ñ ho t
ñ ng, nh hư ng c a m t s ion, kh năng c t
ñ c hi u.
Phương pháp tinh s ch lipase b ng s c ký l c
gel Sephadex G – 75, ki m tra ñ tinh s ch
b ng ñi n di SDS - PAGE [1].
3. K T QU – TH O LU N
Ch n l c ch ng sinh t ng h p lipase cao
T 10 ch ng Bacillus, b ng phương pháp
nuôi c y trên ñĩa th ch v i cơ ch t là tributyrin
0,1% và phương pháp ñ c l th ch có b sung
ch t phát huỳnh quang rhodamine B 0,001%
chúng tôi ch n ñư c 7 ch ng có vòng phân gi i
l n là: B1, Ba1, BL1, BL2, BST1, BST2, BS7.
B ng 3.1. K t qu ch n l c sơ b b ng tributyrin 0,1% và rhodamine B 0,001%
Ch ng B1 Ba1 BL1 BL2 BL141 BST1 BST2 BS3 BS6 BS7
Trybutyrin +++ ++++ ++ +++ - +++ +++ - + ++++
Rhodamine B + + + + - + + - + +
Chú thích: “+” dương tính; “-“ âm tính; s lư ng d u “+” t l v i ñ l n vòng phân gi i
7 ch ng ñư c nuôi c y l ng trong môi trư ng
c m ng sinh lipase. Ho t tính lipase ñư c xác
ñ nh ñ ch n ch ng có ho t tính lipase cao
nh t.

3. Science & Technology Development, Vol 14, No.T3- 2011
Trang 66
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
B1 Ba1 BL1 BL2 BST1 BST2 BS7
Ch ng vi sinh
Hottính(UI/ml)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
6,0 7,0 8,0 9,0 10,0
pH
Hottính(UI/ml)
Hình 1. Ho t tính lipase c a 7 ch ng Bacillus
K t qu Hình 1 cho th y, ch ng BS7 có
ho t tính lipase cao nh t là 1,8 UI/ml. Như v y,
chúng tôi ch n ch ng BS7 – Bacillus subtilis
OII ñ ti n hành các kh o sát ti p theo.
Kh o sát th i gian nuôi c y ch ng BS7
Nuôi c y ch ng BS7 trong môi trư ng sinh
t ng h p lipase. Xác ñ nh ho t tính sau 2, 3, 4,
5 ngày nuôi c y.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
Th i gian nu i c y
Hottính(UI/ml)
Hình 2. nh hư ng c a th i gian nuôi c y lên kh năng sinh t ng h p lipase
Qua Hình 2 nh n th y, ho t tính lipase tăng
t ngày th 2 cho ñ n ngày th 3 và ñ t giá tr
cao nh t 3 ngày nuôi c y. K t qu này tương
t v i nghiên c u c a Senthilkumar R và c ng
s (2008) [11].
Kh o sát pH môi trư ng nuôi c y ch ng
BS7
pH môi trư ng là m t thông s quan tr ng có
nh hư ng r t l n ñ n ho t ñ ng bi n dư ng
c a vi sinh v t.
Hình 3. nh hư ng pH lên kh năng sinh t ng h p lipase

4. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 14, SOÁ T3- 2011
Trang 67
T k t qu trong Hình 3 cho th y BS7 có kh
năng sinh t ng h p lipase pH 6,0 ñ n 8,0;
pH 7,0, lipase ñư c t o ra có ho t tính cao nh t.
K t qu này tương t v i nghiên c u c a
Sangeetha R và c ng s (2008) [9].
Kh o sát n ng ñ cơ ch t nh hư ng sinh t ng h p lipase
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
0,8% 1,0% 1,2% 1,4% 1,6%
N ng ñ d u olive (%)
Hottính(UI/ml)
Hình 4. nh hư ng c a n ng ñ d u olive lên kh năng sinh t ng h p lipase
Hình 4 cho th y kh năng sinh t ng h p
lipase t t nh t n ng ñ d u olive t 1,0 – 1,2
%. K t qu c a chúng tôi thu ñư c tương t v i
nghiên c u c a Wang và c ng s (1995), tác
gi s d ng v i n ng ñ d u olive là 1,0 % ñ
nuôi c y ch ng Bacillus A30-1 [8].
Kh o sát nh hư ng c a pH lên ho t tính và ñ b n ch ph m lipase
0
20
40
60
80
100
8,0 9,0 10,0 11,0 12,0
pH
%hottính
Hình 5. nh hư ng c a pH ñ n ho t tính ch ph m lipase ( : ñ m Tris –Cl; : ñ m carbonate)
0
20
40
60
80
100
Trư c b o
qu n
8,0 T 9,0 T 10,0 T 10,0 C 11,0 C 12,0 C
%hottính
Hình 6. nh hư ng c a pH ñ n ñ b n c a ch ph m lipase (T: ñ m Tris –Cl; C: ñ m carbonate)

5. Science & Technology Development, Vol 14, No.T3- 2011
Trang 68
0
20
40
60
80
100
30 40 50 60 70
Nhi t ñ ( C)
%hottính
o
K t qu Hình 5 cho th y ch ph m lipase
thu nh n t BS7 ho t ñ ng thích h p pH 10,0
ñ m Tris – Cl và ñ m carbonate. Như v y
lipase thu nh n t BS7 là lipase ki m, phù h p
v i ñ c tính lipase c a Bacillus subtilis ñư c
công b b i Gertie van Pouderoyen và c ng s
(2001) [2].
Tương t t Hình 6 cho th y ch ph m lipase
c a BS7 gi ñư c ho t tính cao nh t sau 24 gi
b o qu n trong dung d ch ñ m pH 10,0 4o
C.
ð m Tris – Cl pH 10,0 và ñ m carbonate
pH 10,0 gi ñư c ho t tính g n như nhau.
Kh o sát nh hư ng c a nhi t ñ lên ho t
tính c a ch ph m lipase
Nhi t ñ cũng là m t thông s quan tr ng
nh hư ng ñ n v n t c ph n ng c a enzyme.
Khi nhi t ñ tăng lên s d n ñ n v n t c ph n
ng enzyme tăng, nhưng ñ n m t m c nào ñó
nhi t ñ tăng s c ch ho t ñ ng c a enzyme
và có th b t ho t enzyme.
Hình 7. nh hư ng c a nhi t ñ ñ n ho t tính ch ph m lipase
Qua Hình 7 cho th y ch ph m lipase c a
BS7 có th ho t ñ ng nhi t ñ 50 – 60 o
C, topt
là 60 o
C. K t qu tương t v i k t qu c a
Wang và c ng s (1995) khi nghiên c u lipase
c a ch ng Bacillus sp. A 30 – 1 có topt là 60 o
C
[8].
Kh o sát nh hư ng c a m t s ion kim
lo i và ch t t y r a ñ n ho t tính c a ch
ph m lipase
Lipase ñư c ng d ng nhi u trong ngành
công nghi p s n xu t b t gi t, ch t t y nên kh
năng gi ñư c ho t tính khi có m t các ion và
ch t t y r a trong h n h p r t quan trong. Tùy
vào n ng ñ và lo i ion, ch t t y khác nhau mà
s làm tăng, gi t t ho t tính hay gi m.

6. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 14, SOÁ T3- 2011
Trang 69
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324252627282930
Th t các phân ño n
OD280nm
0
20
40
60
80
100
M u
ch ng
Ca2+
1mM
Mg2+
1mM
Zn2+
1mM
Cu2+
1mM
SDS 0,2% Omo 0,2%
%hottính
Hình 8. nh hư ng c a ion và ch t t y r a lên ho t tính ch ph m lipase
Sau khi 1 gi 4o
C v i các tác nhân trên,
ch ph m lipase t ch ng BS7 b kìm hãm ñ i
v i ion Zn2+
và Cu2+
. Các ion Ca2+
và Mg2+
h u
như không nh hư ng ñ n ho t tính, ion Mg2+
gi ñư c ho t tính t t nh t. Dung d ch SDS
0,2% làm gi m g n 95% ho t tính, b t gi t
Omo 0,2% làm ho t tính gi m 76,57%.
Kh năng c t ñ c hi u c a ch ph m
lipase thu nh n t BS7
Sau khi th c hi n ph n ng chuy n ester hóa,
chúng tôi ti n hành s c ký khí GC – MS, k t
qu hàm lư ng alkyl ester c a acid béo là 4,948
%; 2-monoglyceride là 24,561%, không phát
hi n 1-monoglyceride và diglyceride; các ch t
khác là 66,408 % (triglyceride, d n xu t
cholesterol, các ester khác). T k t qu thu
ñư c, có th k t lu n ch ph m lipase thu nh n
t BS7 có v trí c t ñ c hi u là 1 và 3 trên phân
t triglyceride, ñi u này phù h p v i nghiên
c u c a Gertie van Pouderoyen và c ng s
(2001) [2].
Tinh s ch lipase b ng phương pháp l c gel
Sephadex G-75
K t qu ño OD280 ñư c ghi nh n Hình 9.
Hình 9. S c ký ñ bi u di n các phân ño n l c gel Sephadex G - 75
Sau l c gel Sephadex chúng tôi thu ñư c 3
peak: peak 1 không có ho t tính; peak 2 có ho t
tính riêng 1,07 UI/mg Pr; peak 3 có ho t tính
riêng cao nh t ñ t 35,57 UI/mg Pr. Hi u su t
thu nh n protein sau khi l c gel là 88,53%;
t ng ho t tính lipase thu l i sau khi l c gel ñ t
48,54%. Ho t tính riêng lipase c a peak 3 cao

7. Science & Technology Development, Vol 14, No.T3- 2011
Trang 70
∼ 45 kDa
∼ 23,8 kDa
hơn ho t tính riêng lipase trư c khi l c gel g n
6 l n.
Ki m tra ñ tinh s ch c a enzyme sau khi
l c gel b ng ñi n di SDS – PAGE
Chúng tôi ti n hành t a protein peak 3, ly
tâm thu l y t a, r a t a, hòa l i trong nư c c t
hai l n r i ti n hành ch y ñi n di SDS – PAGE.
K t qu ñi n di ñư c trình bày Hình 10, nh n
th y r ng:
gi ng 2 có 2 v ch ñ m và 1 s v ch m .
V y m u ch ph m lipase trư c khi l c gel
Sephadex G-75 có nhi u lo i protein. Gi ng 3
có 1 v ch, protein có tr ng lư ng phân t
kho ng 23,8 kDa.
V y chúng tôi ñã tinh s ch ñư c enzyme
lipase thu nh n t ch ng Bacillus subtilis OII
có tr ng lư ng phân t kho ng 23,8 kDa. K t
qu này tương t v i nghiên c u c a Jisheng
Ma và c ng s (2006) ñã tinh s ch ñư c lipase
t ch ng Bacillus subtilis IFFI10210 v i tr ng
lư ng phân t là 24 kDa [5].
Hình 10. K t qu ch y di n di SDS – PAGE
Gi ng 1: thang chu n protein
Gi ng 2: ch ph m lipase trư c khi tinh s ch
Gi ng 3: protein peak 3
K T LU N
Chúng tôi ñã ch n l c ñư c ch ng BS7
(Bacillus subtilis OII) có kh năng sinh t ng
h p lipase cao trong các ch ng kh o sát (4,86
UI/ml). ði u ki n cho BS7 t ng h p nhi u
lipase là pH 7,0; 1,2% d u olive nhũ hóa; sau 3
ngày nuôi c y. Ch ph m lipase thu nh n t
BS7 có kh năng ch u ki m (pHopt 10,0), ch u
nhi t (topt 60o
C), có v trí c t 1 và 3 trên phân t
triglyceride. Tr ng lư ng phân t lipase thu
nh n ñư c kho ng 23,8 kDa.

8. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 14, SOÁ T3- 2011
Trang 71
SELECTION, PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF BACILLUS LIPASE
Tran Dang Khoa, Le Quang Huy, Ngo Dai Nghiep
University of Science, VNU-HCM
ABSTRACT: The objective of this study is to screen Bacillus strains for high lipase
production; from 10 strains of Bacillus subtilis OII (BS7) has ability the best lipase production. The
maximum lipase was carried out using liquid culture medium at pH 7,0, substrate concentrations 1,2%
(w/w) after 3 days. The optimum pH and temperature on lipase activity were found to be pH 10,0 and
60 o
C respectively. Ion Mn2+
, Ca2+
are the ions remain activity; active lipase was inhibited by Cu2+
,
Zn2
; solution of SDS 0,2 % decreases 95% activity. Molecular weight of lipase production by BS7 is
approximate 23,8kDa. The results are preconditions for the research on recombinant lipase by Bacillus
subtilis OII.
Key words: Bacillus, lipase, purification.
TÀI LI U THAM KH O
[1]. Ph m Th Ánh H ng, K thu t sinh hóa,
NXB ðHQG TP.HCM (2003).
[2]. Gertie V P, Thorsten E, Karl-Erich J and
Bauke W D, The Crystal Structure of
Bacillus subtilis Lipase: A Minimal a/b
Hydrolase Fold Enzyme, J. Mol. Biol,
309: 215 – 226 (2001).
[3]. Gisela K and Karl-Erich J, Specific and
Sensitive Plate Assay for Bacterial
Lipases, Applied and Environmental
Microbiology: 211 – 213 (1987).
[4]. Hansan F, Ali S A, Hameed A, Industrial
application of microbial lipases, Enzyme
and Microbial Technology, 39 (2): 235 –
251 (2006).
[5]. Jisheng M, Zuoming Z, Baijing W,
Xiangju K, Yuguo W, Shugui C, Yan F,
Overexpression and characterization of a
lipase from Bacillus subtilis, Protein
Expression and Purification, 45: 22 – 29
(2006).
[6]. Nobuhiro W, Yasuhide O, Yasuji M and
Koichi Y, Isolation and Identification of
Alkaline Lipase Producing
Microorganisms, Cultural Conditions
and Some Properties of Crude Enzymes,
Agricutural and Biological Chemistry,
41 (8): 1353 – 1538 (1977).
[7]. Praphan P and Kirk L P, Lipase Assays –
Food Analytical Chemical, C3.1.1 –
C3.1.13 (2001).
[8]. Rohit S, Yusuf C, Uttam C B,
Production, purification,
characterization, and applications of
lipases, Biotechnology Advances, 19:
627–662 (2001).
[9]. Sangeetha R, Geetha A and Arulpandi I,
Optimization of protease and lipase
production by Bacillus pumilus SG 2

9. Science & Technology Development, Vol 14, No.T3- 2011
Trang 72
isolated from an industrial effluent, The
Internet Journal of Microbiology,
Volume 5, Number 2 (2008).
[10].Saxena R K, Ghosh P K, Rani G, Sheba
D W, Sapna B and Ruchi G, Microbial
lipase: Potential biocatalysts for the
future industry, Current Science, 77(1):
101 – 115 (1999).
[11].Senthilkumar R and Selvakumar G,
Isolation and Characterization of an
Entracellular Lipase Producing Bacillus
sp. SS-1 from Slaughterhouse Soil,
Advanced Biotech, 24 – 25 (2008).