This poster was posted at the final day of creative challenge program. In this research, my team tried to develop rapid test kit for well-known animal born contagious disease, Avian Influenza(AI), using aptamer. Although the language is written in Korean, I can give you detailed English information if you need it. Contact me further if you wish to. Thanks.

1. 언론에서 흔히 보고되는 조류 인플루엔자는, Avian Influenza Virus (AI Virus) 감염에 의하
여 발생하는 조류의 급성 전염병으로 닭, 칠면조, 오리 등 가금류에서 피해가 심하게 나
타납니다. 바이러스의 병원성 정도에 따라 저병원성과 고병원성 조류인플루엔자로 크
게 구분되고, 이 중에서 고병원성조류인플루엔자(Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI)
는 세계동물보건기구(OIE)에서도 위험도가 높아 관리대상 질병으로 지정하고 있으며,
발생시 OIE에 의무적으로 보고 하도록 되어있습니다. HPAI 에 감염된 닭이나 칠면조는
급성의 호흡기 증상을 보이면서 발병 시 100%에 가까운 폐사를 나타내는 것이 특징입
니다.
AI 바이러스는 혈청형에 따라 A형, B형, C형 세 가지로 나뉘고, 저희 팀에서 앞으로 진행
할 AI 바이러스는 A형에 속합니다. 상기 기술한 H5N1의 앞 두 글자 H5는 바이러스 표면
에 존재하는 혈구응집소의 특성을 뜻하고(H16까지 총 16 가지가 존재), 뒤 두 글자 N1은
뉴라미니다제라는 효소가 나타내는 표면 단백질의 특성에 따라 붙은 이름입니다.(N1부
터 N9까지 총 9 가지가 존재)
저희 팀의 지도교수님인 구만복 교수님 연구실에서 최근에 보고한 논문에 따르면, 두
압타머 IF10 과 IF22 는 동시에 H5N1 virus에 결합합니다. 보고된 두 압타머를 이용하여
H5N1 virus에 의해 발병된 조류 인플루엔자의 진단을 하는 것이 저희 팀의 주제입니다.
2-1. Aptamer에 붙일 금나노입자(AuNP) 제작
2-2. Aptamer가 올라갈 스트립 제작
2-3. 금나노입자-압타머 고정화 – AuNP : Aptamer 1:50의 농도비를 유지하여 반응
2-4. NC membrane-압타머 고정화 – 위 단면도에서 보이는 것과 같이 Aptamer 3 종류를 우
측의 스트립에 Streptavidin을 이용하여 고정화시킴
2-5. 스트립 어세이 – 실제 바이러스를 이용하여 완성된 스트립을 테스트
안타깝게도 샌드위치 압타머를 기반으로한 조류독감 바이러스(H5N1) LFA 스트립 키
트의 제작 연구는 실패로 돌아가게 되었습니다. 자연스럽게 프로토타입을 기반으로
진행할 계획이었던 상업화 계획 역시도 진행할 수 없게 되었습니다.
실패 원인으로 2가지를 꼽고자 합니다. 첫 번째는 실험과정에서 타겟 바이러스와 프
라이머리 압타머(Capturing 압타머)가 결합하는 조건을 최적화하지 못했을 가능성입
니다. 타겟 바이러스와 프라이머리 압타머가 결합하기 위해서는 적절한 온도, pH, 반응
시간이 필요할 것입니다.
두 번째 가능성은 원천적으로 LFA 플랫폼에서 IF10-타겟바이러스-IF22 간의 샌드위치
결합이 이루어지지 않을 수도 있다는 것입니다. IF10-타겟바이러스-IF22의 샌드위치 결
합은 선행 연구를 통해 밝혀진 결과이나, 이는 SPR 플랫폼에서 얻어낸 결과입니다. SPR
플랫폼의 경우 Capturing 압타머-타겟 바이러스-Reporting 압타머가 결합 할 수 있도록
약 30여분 간의 반응을 진행합니다. 그러나 LFA의 경우 5분 이내로 타겟바이러스-IF10
이 흘러가게 됩니다. 그러므로 샌드위치 결합을 형성할 시간이 부족하다는 근본적인
문제점이 있을 가능성이 있습니다
실험결과 우측 그림처럼 Control line에서 colorimetric signal이 보이는 것을 확인할 수
있었으나, Test line에서는 signal이 보이지 않음을 확인할 수 있었습니다. 우선 control
line에서 반응이 일어났다는 것은 IF10 압타머가 금나노입자에 정상적으로 부착이 되었고,
IF10-AuNP가 정상적으로 흘러서 Control line에 고정된 complimentary IF10과 결합하였음을
의미합니다. 또한 타겟인 H5N1 바이러스를 copies를 사용하여 반응시켰습니다. 이는
상대적으로 고농도의 타겟을 사용한 것이다. 따라서 Test line에서 아무런 반응이 보이지
않았다는 것은 AuNP-IF10과 IF22가 H5N1바이러스에 샌드위치 방식으로 결합하지
못했다는 것을 의미합니다.
Aptamer 기반의 상업용 rapid test kit 개발
Aptsor(김호준, 이현승, 김지수)
지도교수 생명공학과 구만복
무조건적으로 연구를 지원해주신 바이오센서 및 생분자공학 연구실 구성원분과 구만복
지도교수님께 무한한 감사의 말씀을 전하고 싶습니다. 특히 바쁜 와중에도 시간을 내어
매우 큰 도움을 주신 이방현 박사과정 선배님께 감사의 말씀 드립니다.
과학실험 관련 CCP 팀원들 모두가 겪었을 크고 작은 실패는 결코 실패가 아닌 진정한
성공으로 향하는 성장의 길이라고 생각합니다. 주도적으로 질문을 던지고 창의적으로
해결하려고 하는 자세를 가지고 계속해서 각자의 자리에서 정진했으면 합니다. 훗날
우리 모두가 고려대학교의 위상을 드높이는 훌륭한 사람이 되어서 만나기를 고대합니다.
약 10개월에 걸쳐 우리 팀은 차세대 바이오센터인 압타머를 기반으로 한 현장진단키트를
구상하고 Prototype의 개발을 위한 연구활동을 진행하였습니다. 제한된 시간과 제한된
자원을 토대로, 부족한 경험과 실력은 주변의 도움과 지도교수님 및 연구실
선배님들로부터 보완할 수 있었던 값진 시간이었습니다.
1) HAuCl 80 ml를 300C에서 가열 2) TCD 8 ml 첨가
3) 약 2분 후 색 변화 확인 4) 완성된 금나노 용액 (지름 10 – 20 nm)
AI Virus type H5N1의 모식도
Aptamer Sequence
IF22
5'-Biotin-TTTTTTTTTTCGTACGGTCGACGCTAGCTAAATGGGCGTG
GGAATGACTCTACGGGGCCACGTGGAGCTCGGATCC-3'
IF10
5'-Thiol-(C6)-CGTACGGTCGACGCTAGCTAACGGTGTGGCCCGGGG
GTACAGCGCACTCACGTGGAGCTCGGATCC-3'
사용된 Aptamer의 정보
Sample Pad
Conjugation Pad
NitroCellulose
Membrane
Plastic Backing Card
Absorbent Pad
Sample
Droplet
Control Line
(IF10 comp)
Test
Line
(IF22)
AuNP Conjugated
Aptamer(IF10)
Rapid test kit의 단면도 Sample pad, Conjugated pad, NC membrane, Absorbent pad로
구성된 스트립
모세관 현상을 이용하여 Lateral flow assay를 진행하는 과정 실험 결과
실험결과 그림19처럼 Control line에서 colorimetric signal이 보이는 것을 확인할 수 있었으나, Test line에서는 signal이 보이지 않음을 확인할 수 있었습니다. 우선 control line에서 반응이 일어났다는 것은 IF10 압타머가 금나노입자에 정상적으로 부착이 되었고, IF10-AuNP가 정상적으로 흘러서 Control line에 고정된 complimentary IF10과 결합하였음을 의미합니다. 또한 타겟인 H5N1 바이러스를 copies를 사용하여 반응시켰습니다. 이는 상대적으로 고농도의 타겟을 사용한 것이다. 따라서 Test line에서 아무런 반응
즉, 금나노입자를 이용한 Lateral flow assay 플랫폼에서 H5N1 바이러스를 샌드위치 방식으로 검출해낼 수 없었습니다. 그러므로 rapid kit 형태의 상업용 조류독감 진단키트로 이어지기 위해서는 실패한 결과에 대한 원인 분석, 트러블 슈팅, 후속 연구가 뒷받침되어야할 것으로 보입니다.