修士論文予備審査会_Strobilurus属とTalaromyces属の宿主選好性
- 1. 修士論文予備審査発表会 2013/1/16 13:25- 宿主選好性の実態および決定要因に関する Strobilurus 属菌と Talaromyces 属菌 の比較研究 筑波大学大学院生命環境科学研究科 生物科学専攻博士前期課程 2 年次 201121078 中島淳志
- 2. 宿主選好性（ host selectivity） ある生息環境下で、 特定の 菌 が特定の 宿主基質 に （キノコやカビ） （植物など） 生息する性質。 (Hyde et al., 2007 を改変 ) スギエダタケ Strobilurus ohshimae 「スギの枝」のみに生える
- 3. 宿主選好性（ host selectivity） ある生息環境下で、 特定の 菌 が特定の 宿主基質 に （キノコやカビ） （植物など） 生息する性質。 (Hyde et al., 2007 を改変 ) 生態 多様性 進化 生活史・分布 多様性生成要因 適応・種分化・共進化 宿主との相互作用 種数推定
- 4. 宿主選好性（ host selectivity） ある菌が宿主選好性を示すか？ 実態 子実体（キノコ）だけでなく、 「菌糸体」もそれを示すか？
- 5. 宿主選好性（ host selectivity） ・共生菌や寄生菌に対して、 腐生菌では経験的にしか 実態 ある菌が宿主選好性を示すか？ 実態 知られていない。 子実体（キノコ）だけでなく、 「菌糸体」もそれを示すか？ ・子実体では近年 実証的研究がされているが、 (Gilbert et al., 2008; Yamashita et al., 2010; Shirouzu et al., 2012) 、 「菌糸体」を調べた例はない。
- 6. 宿主選好性（ host selectivity） 決定要因 ある菌がなぜ特定のものに生息するのか？ （宿主選好性は何によって決まっているか？）
- 7. 宿主選好性（ host selectivity） 決定要因 ある菌がなぜ特定のものに生息するのか？ （宿主選好性は何によって決まっているか？） 菌のストレス耐性 ? 基質中の Rayner & Boddy (1985) 基質の大きさや形状？ 阻害物質 ? Gulis (2001) 菌の酵素の違い ? Boddy & Heilmann-Clausen (2008) Gulis (2001) 基質中の温度や湿度 ? 基質中の化学成分？ 基質中の元素 ? （生長に正の影響） Christensen (1989) Christensen (1989) Roets et al. (2012) Roets et al. (2012)
- 8. 宿主選好性（ host selectivity） 決定要因 ・様々な要因が複雑に関係するとは言われるが、 ある菌がなぜ特定のものに生息するのか？ どの要因が重要かは分かっていない。 （宿主選好性は何によって決まっているか？） 菌のストレス耐性 ? 基質中の Rayner & Boddy (1985) 基質の大きさや形状？ 阻害物質 ? Gulis (2001) 菌の酵素の違い ? Boddy & Heilmann-Clausen (2008) Gulis (2001) 基質中の温度や湿度 ? 基質中の化学成分？ 基質中の元素 ? （生長に正の影響） Christensen (1989) Christensen (1989) Roets et al. (2012) Roets et al. (2012)
- 9. 大型菌類（キノコ） 微小菌類（カビ） 本質的な違いはないが、 研究手法が大きく異なってきた。 子実体観察・採集 培養・顕微鏡観察 Classical Micro- Botany biology
- 10. 大型菌類（キノコ） 微小菌類（カビ） 本質的な違いはないが、 研究手法が大きく異なってきた。 両者の比較研究を行うことで、 Classical Micro- 普遍的な原理の解明を目指す。 Botany biology
- 11. 大型菌類（キノコ） Strobilurus （マツカサキノコ）属菌 2 cm 針葉樹の球果（ " 松ぼっくり " など）に発生
- 12. 大型菌類（キノコ） Strobilurus （マツカサキノコ）属菌 S. esculentus S. stephanocystis （マツカサキノコ） （マツカサキノコモドキ） 「トウヒ属」の球果に発生 「マツ属」の球果に発生 bar = 2 cm
- 13. 微小菌類（カビ） 「ギンナンアオカビ」 （仮称） ※ 本研究で発見 Talaromyces 属未記載種であることが判明 「イチョウ」の種子（ギンナン）に発生 2 cm
- 14. 「針葉樹球果のみに発生する」大型菌類 「イチョウ種子のみに発生する」微小菌類 Strobilurus 属菌 「ギンナンアオカビ」 両者ともに ・天然で宿主選好性が強いと思われた。 ・採集および培養が容易。
- 15. 「針葉樹球果のみに発生する」大型菌類 「イチョウ種子のみに発生する」微小菌類 Strobilurus 属菌 「ギンナンアオカビ」 両者ともに ・天然で宿主選好性が強いと思われた。 ・採集および培養が容易。 紅い色素と 近縁種間で 胞子形成により 異なる宿主に 培養法で 選好性分化 検出容易
- 16. - 本発表の構成 - 大型菌類（キノコ） 微小菌類（カビ） 1 実態 2 実態 培養法 分子検出法 培養法 土壌湿室 釣菌法 3 決定要因 対峙培養実験
- 17. 1 大型菌類（キノコ） 実態
- 18. 1 大型菌類（キノコ） 実態 目的 本属菌 2 種が子実体ではなく 「菌糸体」でも 宿主選好性を示すかどうか検証。
- 19. 1 大型菌類（キノコ） 実態 目的 本属菌 2 種が子実体ではなく 「菌糸体」でも 宿主選好性を示すかどうか検証。 天然宿主基質から直接「菌糸体」を検出 培養法 分子検出法
- 20.
- 21. 1 材料と方法 培養法担子菌選択培地を用いた手法を開発 Strobilurus 属を含む 担子菌の天然宿主基質からの分離培養は困難。 担子菌を選択的に分離する新手法を開発。
- 22. 1 材料と方法 培養法担子菌選択培地を用いた手法を開発 Strobilurus 属を含む 担子菌の天然宿主基質からの分離培養は困難。 担子菌を選択的に分離する新手法を開発。 日本各地の針葉樹球果から 35 菌株を分離培養し同定 → 5 菌株が Strobilurus 属菌 本属菌の天然宿主基質からの検出に初成功。
- 23. 1 材料と方法 分子検出法 特異的PCR を用いた手法を開発
- 24. 1 材料と方法 分子検出法 特異的 PCR を用いた手法を開発 ITS領域…760 bp S. esculentus 相同性…98.16% 異なる部分…9か所14塩基 S. stephanocystis 近縁種の配列と比較し、 両種に対する 特異的プライマーペアを設計
- 25. 1 材料と方法 分子検出法 特異的 PCR を用いた手法を開発 ITS領域…760 bp S. esculentus 相同性…98.16% 異なる部分…9か所14塩基 S. stephanocystis 近縁種の配列と比較し、 両種に対する 特異的プライマーペアを設計 （洗浄・表面殺菌処理） （ダイレクトシーケンシング） （ DNA 抽出） 特異的 PCR 配列決定 （ネステッドPCR） により判別
- 26. 1 材料と方法 開発した 培養法 と 分子検出法 を、 菅平高原実験センター内で同じマットの下に 2 年間 （2010.11-2012.11）置床した ドイツトウヒ・アカマツの球果 10 個ずつに適用。 ドイツトウヒ アカマツ （約10 cm間隔で交互に置床）
- 27. 1 結果 S. esculentus S. stephanocystis ドイツトウヒ アカマツ 9 ・ドイツトウヒ球果からは S. esculentus のみが 5 66 検出された。 4 0 0 0 培養 分子 培養 分子
- 28. 1 結果 S. esculentus S. stephanocystis ドイツトウヒ アカマツ 9 ・ドイツトウヒ球果からは S. esculentus のみが 5 66 検出された。 4 ・アカマツ球果からは 培養法では S. stephanocystis のみが検出された。 0 0 0 一方、分子検出法では 両種が 6 回検出された。 培養 分子 培養 分子
- 29. 1 結果 S. esculentus S. stephanocystis ドイツトウヒ アカマツ 9 ・ドイツトウヒ球果からは S. esculentus のみが 5 66 検出された。 4 ・アカマツ球果からは 培養法では S. stephanocystis のみが検出された。 0 0 0 一方、分子検出法では 両種が 6 回検出された。 培養 分子 培養 分子
- 30. 1 結果と考察 Strobilurus 属菌2 種では 「菌糸体」が固有の宿主基質に限って 生育する（＝菌糸体が宿主選好性を示す） 傾向（この現象は本研究が初の報告）。
- 31. 1 結果と考察 Strobilurus 属菌2 種では 「菌糸体」が固有の宿主基質に限って 生育する（＝菌糸体が宿主選好性を示す） 傾向（この現象は本研究が初の報告）。 ただし、アカマツ球果からは分子検出法で 両種を検出（→胞子を検出？）。 分子検出法で「菌糸体」と「胞子」を 区別するため手法の改良（定量化など）が必要。
- 32. 2 微小菌類（カビ） 実態 目的 「ギンナンアオカビ」の宿主選好性の 実態を確かめる。 （宿主基質の植物種・宿主基質の部位）
- 33. 2 微小菌類（カビ） 実態 目的 「ギンナンアオカビ」の宿主選好性の 実態を確かめる。 （宿主基質の植物種・宿主基質の部位） 「菌糸体」を検出する手法を用いる 土壌湿室釣菌法 培養法 （分子検出法は省略）
- 34. 2 材料と方法－１ 土壌湿室 イチョウ以外に生息するか？（植物種） 釣菌法 イチョウ樹下 0 m, 18 m （上田市上田）および非樹下（上田市菅平高原）で 土壌を採取し、カップに 10 g ずつ投入。 13 種類の種子・果実（ 48 h 50℃ → 5 mm 四方に断片化）を加え、 25℃ 7 日間培養し、宿主基質上での胞子形成菌を記録。
- 35. 2 材料と方法－１ 土壌湿室 イチョウ以外に生息するか？（植物種） 釣菌法 イチョウ樹下 0 m, 18 m （上田市上田）および非樹下（上田市菅平高原）で 土壌を採取し、カップに 10 g ずつ投入。 13 種類の種子・果実（ 48 h 50℃ → 5 mm 四方に断片化）を加え、 25℃ 7 日間培養し、宿主基質上での胞子形成菌を記録。 ブドウ プルーン 各基質 3 断片を置床 イチョウ （イチョウ種子は 12 断片） アケビ イチジク パイナップル マンゴー アンズ バナナ マメガキ ウンシュウミカン ヒヨドリジョウゴ トウモロコシ
- 36. 2 結果 土壌湿室釣菌法 ・イチョウ樹下土壌のみで 「ギンナンアオカビ」が 胞子形成。 ・0 m 地点では 11/12 断片 18 m 地点では 12/12 断片 と高頻度で検出された。 胞子形成 → 菌糸体生育
- 37. 2 結果 土壌湿室釣菌法 ・イチョウ樹下土壌のみで 「ギンナンアオカビ」が 胞子形成。 ・0 m 地点では 11/12 断片 18 m 地点では 12/12 断片 と高頻度で検出された。 胞子形成 → 菌糸体生育 ・イチョウ以外の 12 種類の宿主基質では、 全く「ギンナンアオカビ」は検出されず。
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- 39. 2 材料と方法－２ 培養法 どの部位に生息するか？ 表面殺菌処理 （次亜塩素酸 1 分） 断片化処理 （ 5 mm 四方） MEA 培地 （一部は CMA 培地） 24 ウェルプレートに置床 （ 1 枚の葉 /1 つの種子につき 8 断片）
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- 41. 2 結果 土壌湿室釣菌法 培養法 土壌湿室釣菌法では、 13 種中「イチョウ」のみで 「ギンナンアオカビ」を高頻度で検出。 培養法では「落下した種子」のみで 「ギンナンアオカビ」を検出。
- 42. 2 結果 土壌湿室釣菌法 培養法 土壌湿室釣菌法では、 13 種中「イチョウ」のみで 「ギンナンアオカビ」を高頻度で検出。 培養法では「落下した種子」のみで 「ギンナンアオカビ」を検出。 「ギンナンアオカビ」は、天然では 「菌糸体」の生育段階で「イチョウ種子」に 顕著な選好性を持つと考えられた。
- 43. 大型菌類（キノコ） 3 微小菌類（カビ） 決定要因 ・ Strobilurus 属菌も「ギンナンアオカビ」も 汎用培地で生育。 ・「ギンナンアオカビ」は純粋培養下で イチョウ以外の宿主基質でも生育。
- 44. 大型菌類（キノコ） 3 微小菌類（カビ） 決定要因 ・ Strobilurus 属菌も「ギンナンアオカビ」も 汎用培地で生育。 ・「ギンナンアオカビ」は純粋培養下で イチョウ以外の宿主基質でも生育。 宿主成分の有無だけでは 宿主選好性は説明できない。
- 45. 大型菌類（キノコ） 3 微小菌類（カビ） 決定要因 目的 宿主選好性には「菌糸体」の性質が関係？
- 46. 大型菌類（キノコ） 3 微小菌類（カビ） 決定要因 目的 宿主選好性には「菌糸体」の性質が関係？ 培養実験で 菌糸体と宿主基質の関係を調査。
- 47. 3 材料と方法 宿主抽出液添加培地の作成 + （オートクレーブ処理） CYA （ツァペック酵母寒天） 各宿主基質 宿主抽出液 (5 g/L) 添加培地
- 48. 3 材料と方法 宿主抽出液添加培地の作成 + （オートクレーブ処理） CYA （ツァペック酵母寒天） 各宿主基質 宿主抽出液 (5 g/L) 添加培地 宿主抽出液添加培地は 宿主選好性菌 3 種の 生長を促進。 S. step. S. esc. 「ギンナンアオカビ」 エラーバーは標準偏差 , * は p < 0.05, ** は p < 0.01, *** は p < 0.001 であることを示す（ Welch's t-test, n=4 ）
- 49. 3 材料と方法 対峙培養実験 相手菌 ・天然での種間競争を 培地上で再現する実験。 宿主選好性菌 対峙培養相手菌の分離培養 MEA （麦芽エキス寒天） 10 種 （うち 1 種は結果から除外） 担子菌 選択培地 10 種 （ 5 種ずつ）
- 50. 3 材料と方法 対峙培養実験 相手菌 ・天然での種間競争を 培地上で再現する実験。 宿主選好性菌 対峙培養相手菌の分離培養 MEA （麦芽エキス寒天） 生活史戦略の 似た菌を分離 担子菌 （ほぼ全てジェネラリスト） 選択培地
- 51. 3 材料と方法 ・宿主選好性菌・相手菌のコロニーを 底面半径 2.5mm の四分円柱に切り出し。 ・ 24 ウェルプレートの宿主抽出液添加培地と 無添加培地にそれぞれ対にして接種。 ・ 25℃ で 7 日間培養し、面積比を計測。 相手菌 宿主選好性菌
- 52. 3 材料と方法 ・宿主選好性菌・相手菌のコロニーを 底面半径 2.5mm の四分円柱に切り出し。 ・ 24 ウェルプレートの宿主抽出液添加培地と 無添加培地にそれぞれ対にして接種。 ・ 25℃ で 7 日間培養し、面積比を計測。 相手菌 大 面積比 3.0 0.33 面積比 面積比 1 宿主選好性菌 大
- 53. 3 結果 無添加 添加 相手菌 面積比 「ギンナン アオカビ」 n.s. は有意差なし , * は p < 0.5, ** は p < 0.1, *** は p < 0.01 であることを示す（ Welch's t-test, n=4 ）
- 54. 3 結果 無添加 添加 「ギンナン アオカビ」 n.s. は有意差なし , * は p < 0.5, ** は p < 0.1, *** は p < 0.01 であることを示す（ Welch's t-test, n=4 ） 宿主抽出液添加培地でより多くの面積を占有。
- 55. 3 結果 無添加 添加 「ギンナン アオカビ」 宿主抽出液の有無で面積比が 「逆転」する現象。 n.s. は有意差なし , * は p < 0.5, ** は p < 0.1, *** は p < 0.01 であることを示す（ Welch's t-test, n=4 ） 宿主成分の有無が競争の結果に影響
- 56. 3 結果 Strobilurus属菌 2 種 S. esculentus S. stephanocystis 無添加 添加 無添加 添加 n.s. は有意差なし , * は p < 0.05, ** は p < 0.01, *** は p < 0.001 であることを示す（ Welch's t-test, n=4 ）
- 57. 3 結果 Strobilurus属菌 2 種 S. esculentus S. stephanocystis 無添加 添加 無添加 添加 宿主抽出液添加培地でより多くの面積を占有。 n.s. は有意差なし , * は p < 0.05, ** は p < 0.01, *** は p < 0.001 であることを示す（ Welch's t-test, n=4 ）
- 58. 3 結果 Strobilurus属菌 2 種 S. esculentus S. stephanocystis 無添加 添加 無添加 添加 「逆転」現象も見られた。 n.s. は有意差なし , * は p < 0.05, ** は p < 0.01, *** は p < 0.001 であることを示す（ Welch's t-test, n=4 ）
- 59. 3 結果と考察 宿主選好性菌 3種全てで、 種間競争の結果が宿主成分により向上。
- 60. 3 結果と考察 宿主選好性菌 3種全てで、 種間競争の結果が宿主成分により向上。 今回、対峙培養に用いた相手菌は 多くがジェネラリスト。 宿主選好性が強いほどそこでの 種間競争に有利になる現象 「地の利 」の存在を示唆。 (home-court-advantage)
- 61. 結論 宿主選好性の 実態 本研究では初めて菌糸体の検出を試みた。 Strobilurus 属菌 2 種と「ギンナンアオカビ」では 宿主選好性が宿主基質中での 栄養生長の時点で表れることを実証。
- 62. 結論 宿主選好性の 決定要因 基質中の 阻害物質 ? 菌のストレス耐性 ? Gulis (2001) 菌の酵素の違い ? Rayner & Boddy (1985) Gulis (2001) 基質の大きさや形状？ 分解しやすさ（リグニン含量） ? Gulis (2001) Boddy & Heilmann-Clausen (2008) 基質中の温度や湿度 ? 基質中の元素 ? Christensen (1989) Christensen (1989) Roets et al. (2012) 基質中の化学成分？ （生長に正の影響） Roets et al. (2012)
- 63. 結論 宿主選好性の 決定要因 基質中の 阻害物質 ? 菌のストレス耐性 ? Gulis (2001) 菌の酵素の違い ? Rayner & Boddy (1985) Gulis (2001) 基質の大きさや形状？ 「地の利」 分解しやすさ（リグニン含量） ? 宿主基質の Gulis (2001) Boddy & Heilmann-Clausen (2008) 物理化学的性質 基質中の温度や湿度 ? 基質中の元素 ? Christensen (1989) Christensen (1989) Roets et al. (2012) 基質中の化学成分？ （生長に正の影響） Roets et al. (2012)
- 64. 結論 宿主選好性の 決定要因 基質中の 阻害物質 ? 菌のストレス耐性 ? Gulis (2001) 菌の酵素の違い ? Rayner & Boddy (1985) Gulis (2001) 基質の大きさや形状？ 分解しやすさ（リグニン含量） ? 種間競争 ? Gulis (2001) Boddy & Heilmann-Clausen (2008) Gochenaur (1978) Shearer (1995) 基質中の温度や湿度 ? 基質中の元素 ? Christensen (1989) Christensen (1989) Roets et al. (2012) 基質中の化学成分？ （生長に正の影響） Roets et al. (2012)
- 65. 結論 宿主選好性の 決定要因 基質中の 阻害物質 ? 菌のストレス耐性 ? Gulis (2001) 菌の酵素の違い ? Rayner & Boddy (1985) Gulis (2001) 基質の大きさや形状？ 分解しやすさ（リグニン含量） ? 種間競争 ? Gulis (2001) Boddy & Heilmann-Clausen (2008) Gochenaur (1984) Gochenaur (1978) Shearer (1995) Shearer (1995) 基質中の温度や湿度 ? 基質中の元素 ? Christensen (1989) Christensen (1989) Roets et al. (2012) 基質中の化学成分？ （生長に正の影響） （生長に正の影響） Roets et al. (2012) Roets et al. (2012)
- 66. 結論 宿主選好性の 決定要因 基質中の 経験に 阻害物質 ? 宿主抽出液培地を 基づく推測 菌のストレス耐性 ? Gulis (2001) 作成し純粋培養 菌の酵素の違い ? Rayner & Boddy (1985) Gondwanamyces capensis Gulis (2001) 有意差なし 基質の大きさや形状？ 分解しやすさ（リグニン含量） ? 種間競争 ? Gondwanamyces proteae Gulis (2001) Boddy & Heilmann-Clausen (2008) Gochenaur (1984) Gochenaur (1978) 有意差なし Shearer (1995) Shearer (1995) Ophiostoma spledens 基質中の温度や湿度 ? 基質中の元素 ? Christensen (1989) Ophiostoma phasma Christensen (1989) Roets et al. (2012) 基質中の化学成分？ 有意差なし （生長に正の影響） （生長に正の影響） Roets et al. (2012) Roets et al. (2012)
- 67. 結論 基質中の 種間競争 化学成分 生長促進 での優位 宿主選好性 の発現
- 68. 結論 基質中の 種間競争 化学成分 生長促進 での優位 宿主選好性 の発現 特定の宿主選好性菌を材料とし、 明瞭な因果関係を示した初めての例。 ・今後、これが普遍的に見られるか調査。
- 69. 今後の展望 「ギンナンアオカビ」が 特定の菌と対峙培養した時に 色素を産生する現象を確認。 抗生物質の産生は Strobilurus 属菌でも 知られている。 →種間競争、さらに宿主選好性に関与している？ strobilurin-A
- 70. ご清聴ありがとうございました。 謝辞 本修士論文の作成にあたっては、 以下の方々に貴重なご意見や試料収集のご協力をいただきました。 この場をお借りして感謝の意を表します。 （主査・指導教官）井上勲先生・（副査）山岡裕一先生・（副査）町田龍一郎先生 出川洋介先生・萩本宏先生・細矢剛先生・徳増征二先生・吹春俊光先生・保坂健太郎先生 佐久間大輔先生・升屋勇人先生・稲葉重樹先生・廣瀬大先生・白水貴先生・折原貴道先生 佐藤清吉さん・種山裕一さん・酒井きみさん・浅井淑子さん・松崎務さん他ナチュラリストの方々 筑波大学菅平高原実験センターの皆様・山岡研の皆様・石田研 / 中山研の皆様
- 71.
- 72. 培養 分子 培養 分子 ドイツトウヒ アカマツ
- 73. 結果 土壌湿室釣菌法 ・一見してケカビの発生が少なかった。 トウモロコシ イチョウ 発生接合菌数の平均値は 0m 地点 0.33 種 18m 地点 0.58 種 非樹下 0.89 種で いずれも 13 宿主基質中最小。 ブドウ プルーン （接合菌以外の菌を加えても同じ）
- 74. 1 結果と考察 しかし、分子検出法では、 S.esculentus が 別の宿主基質（アカマツ球果）からも検出された。 分子検出法は鋭敏性が高く、胞子や不活性菌由来の DNAを検出した可能性も高い？ （マットの下では S. esculentus のみ 4 期子実体形成） 菌糸体の生育を確実に検出するには、 定量的な手法（リアルタイム定量 PCR など）の 導入が必要か。
- 75. 第4 章 結果 土壌湿室釣菌法 ・宿主基質が紅く 変色した。 着色はほぼイチョウ種子のみ （ 0m, 18m 地点で 23/24 断片） 非樹下では着色せず。 （例外としてイチジクとバナナの計 4 断片でも着色）
- 76. 結果 対峙培養実験 侵入したら +1, されたら -1, それ以外 ±0 【定性的評価】 「ギンナンアオカビ」 S. esculentus S. stephanocystis （コントロール） （宿主抽出液添加）
- 77. 3 結果 対峙培養実験 「ギンナンアオカビ」は通常 CYA 培地で色素を作らないが、 特定の菌と対峙すると培地が紅くなる。 写真から培地の RGB 値を測定してグラフにした。 10 種中 5 種で 色素の産生を確認