1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP. HCM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN :
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07, năm 2012

2. NỘI DUNG BÁO CÁO
1 •Tổng quan về FGF-2
2 •Phương pháp thực hiện
3 •Kết quả và biện luận
4 •Kết luận và đề nghị

3. NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG FGF-2
Nghiên cứu
FGF-2 Y học
Mỹ phẩm
Tăng sinh,
biệt hóa tế
bào
Lành
vết
thương
Hình
thành
mạch

4. ỨNG DỤNG FGF-2
• Thành phần trong nuôi cấy tế bào
gốc phôi người
Nghiên
cứu
• Điều trị bệnh thiếu máu cục bộ
• Điều trị bỏng
• Ngăn ngừa sẹo lồi
Y học
• Ngăn ngừa sự lão hóa của da
• Làm đen tóc
Mỹ
phẩm

5. CẤU TRÚC FGF-2
FGF-2
 Dạng hình cầu.
 Chứa 12 phiến β đối song
song.
 FGF-2 chứa bốn cysteine
nhưng lại không có cầu nối
disulfide nội phân tử.

6. FGF-2 NGUỒN ĐỘNG VẬT
Tế bào
động vật
• Chi phí cao
• Hiệu quả kinh tế thấp
• Giống với tự nhiên

7. Ưu điểm
 Dễ thao tác di truyền
 Mật độ nuôi cấy cao
 Môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền
 Hiệu quả sản xuất protein tái tổ hợp cao
HỆ THỐNG BIỂU HIỆN Escherichia coli
Hệ thống E. coli hoàn toàn thích hợp
để biểu hiện FGF-2
(FGF-2 không biến đổi sau dịch mã, không có
cầu nối disulfide)

8. SẢN PHẨM THƯƠNG MẠI
FGF-2
1260USD/mg 1250USD/mg

9. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN FGF-2
(BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR) TÁI
TỔ HỢP TRONG Echerichia coli

10. NỘI DUNG THỰC HIỆN
Cấu trúc chủng E. coli DH5α/pET-fgf2
Cấu trúc chủng E. coli BL21(DE3)/pET-fgf2
Kiểm tra sự biểu hiện của protein FGF-2
1
2
3

11. SƠ ĐỒ TẠO DÒNG
BamHI, NdeI PCR/BamHI, NdeI
Gen fgf2
Biến nạp
pET-His
4636bp
T7 Promoter
MCS
T7 Terminator
AmpR
pBR322 Origin
pET-His pIDTSmart-il2
2362bp
Text
Origin
M13 Forward
M13 Reverse
il2
KanR
pIDT-
fgf2
pET-His/
BamHI, NdeI
Nối
Sàng
lọc
pET-fgf2

12. KẾT QUẢ THU NHẬN pET-His/BamHI, NdeI
1, Thang DNA 1kb;
2, Plasmid pET-His;
3, pET-His/BamHI,NdeI.
NdeI/ BamHI

13. KẾT QUẢ THU NHẬN GEN fgf2
1, Thang DNA 1kb plus
2, PCR đoạn gene fgf2 với
cặp mồi FGF2-F và FGF2-R

14. Sàng lọc PCR Khuẩn lạc
E. coli
DH5α
KẾT QUẢ BIẾN NẠP VÀO CHỦNG E. coli DH5α
1, Đĩa đối chứng
2, E. coli DH5α / pET-fgf2

15. SÀNG LỌC THẾ BIẾN NẠP BẰNG PCR KHUẨN LẠC
1, Thang DNA 1kb;
2, PCR pET-His/FGF2-F và FGF2-R;
3, Gen fgf2;
4, PCR khuẩn lạc/FGF2-F và FGF2-R;
5, PCR pET-His/T7promoter và T7terminator;
6, 7, PCR khuẩn lạc/T7promoter và
T7terminator.
450bp
fgf2
650bp
T7terminatorT7 promoter

16. KIỂM TRA PLASMID TÁI TỔ HỢP
1, Thang DNA 1kb;
2, PCR pET-His;
3, PCR pET-fgf2 mồi đặc hiệu FGF2-F và FGF2-R;
4, PCR pET-His T7promoter và T7terminator;
5, PCR pET-fgf2 T7promoter và T7terminator;
8, pET-fgf2/BamHI, NdeI.
450bp
fgf2
650bp
T7terminatorT7 promoter
PCR RE

17. GIẢI TRÌNH TỰ
Trình tự gen ĐÚNG so với trình tự lý thuyết 100% và
đồng khung dịch mã

18. Cấu trúc chủng thành công E. coli
DH5α/pET-fgf2

19. NỘI DUNG THỰC HIỆN
1
2
3

20. E. coli
BL21(DE3)
pET-fgf
1, Đĩa đối chứng
2, Tế bào E. coli BL21(DE3)/ pET-fgf
1, Thang chuẩn 1kb;
2, PCR plasmid pET-His;
3, PCR plasmid pIDT-fgf2;
4, PCR khuẩn lạc E. coli BL21(DE3).
KIỂM TRA BẰNG PCR KHUẨN LẠC

21. Cấu trúc chủng thành công E. coli
BL21(DE3)/pET-fgf2

22. NỘI DUNG THỰC HIỆN
Cấu trúc chủng E. coli DH5α/pET-fgf2
Cấu trúc chủng E. coli BL21(DE3)/pET-fgf2
Kiểm tra sự biểu hiện của protein FGF-2
1
2
3

23. E. coli BL21(DE3)/ pET-fgf
OD600 =0,8 - 1
Bổ sung IPTG 0,5mM
Hoạt hóa
Thu mẫu
KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN CỦA FGF-2
SDS-PAGE WESTERN BLOT
 +
nổi
+
tủaLWM
IPTG +
tổng
 +
nổi
+
tủaLWM
+
tổng

24. Biểu hiện thành protein FGF-2
trong tế bào E. coli BL21 (DE3)

25. Cấu trúc thành công chủng E. coli
DH5α/pET-fgf2
Cấu trúc thành công chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-fgf2
Biểu hiện thành công protein FGF-2
trong tế bào E. coli BL21 (DE3)
1
2
3
KẾT LUẬN

26. KIẾN NGHỊ
1
• Tối ưu các điều kiện biểu hiện
FGF-2
2
• Lên men thu nhận FGF-2 qui
mô phòng thí nghiệm
3
• Khảo sát quy trình tinh chế
FGF-2