1. ẢNH HƯỞNG CỦA ABA
TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI
CẤY TẠO CHỒI TRỰC TIẾP
TỪ MÔ SẸO CỦA LÁ CÂY
CHÈ ( CAMELLIA SINENSIS
(L.))

2. MỤC LỤC
GIỚI THIỆU:
NỘI DUNG:
Tổng quan về sinh học của cây chè
Vật liệu
Phương pháp tiến hành
Sự khởi đầu nuôi cấy mô sẹo
Tái sinh rễ in vitro và chuyển cây con ra
vườn ươm
Phân tích thống kê
Kết quả
Sự hình thành mô sẹo và tái sinh chồi
Sự tái sinh rễ in vitro và chuyển cây ra vườn
ươm
Nghiên cứu cơ quan khí khổng
KẾT LUẬN:
TÀI LIỆU THAM KHẢO:

3. GIỚI THIỆU:
Chè là một trong những cây công
nghiệp quan trọng và tạo ra nhiều
việc làm ở tất cả các vùng trồng chè
trên thế giới. Bên cạnh vai trò là một
loại thức uống phổ biến, chè ngày
càng được ưa chuộng bởi đặc tính
kháng ung thư và chống lão hóa
(Jankul et al. 1997)

4. Trước đây, chỉ có một công
bố về sự phát sinh phôi vô
tính trực tiếp từ các mô lá
dòng chè Assamica-SRL 73,
(Kato, 1996) và sự tái sinh
chồi gián tiếp từ lá thông qua
rễ bất định có nguồn gốc
callus (Sandal et al. 2005).

5. Tổng quan về sinh học của cây chè
Camellia sinensis
• C.sinensis có nguồn gốc ở khu vực Đông
Nam Á, ngày nay nó được trồng phổ biến ở
nhiều nơi trên thế giới(NĐ và CNĐ). Nó là loại
cây xanh lâu năm mọc thành bụi hoặc các
cây nhỏ, thường được xén tỉa thấp hơn 2 m,
được trồng lấy lá.
• Hoa: màu trắng ánh vàng.
• Hạt:có thể ép để lấy dầu.
• Lá: dài 4–15 cm và rộng 2–5 cm. Lá tươi
chứa khoảng 4% caffein. .

6. Cây chè C.sinensis

8. • Chè xanh, chè ô long và chè đen tất cả
đều được chế biến từ loài này, nhưng
được chế biến ở các mức độ oxi hóa khác
nhau.
• Lá dài từ 4–15 cm,rộng từ 2–5 cm. Lá tươi
chứa khoảng 4% cafein. Lá non và các lá
màu xanh lục nhạt được thu hoach để sản
xuất chè

9. Một số các biến thể khác nhau của C. sinensis
được trồng ở Việt Nam:
– Biến thể Trung Quốc (C. sinensis sinensis)
– Biến thể Cam pu chia (C. sinensis parvifolia)
– Biến thể Assam (C. sinensis assamica hay
C. assamica).
• Phần lớn chè được sản xuất từ biến thể này Nó
là loại cây nhỏ (thân đơn) với lá to. Như đã nói
ở mục giới thiệu thì những công bố đầu tiên
trên thế giới về cây chè in vitro của Kato(1996),
Sandal và cộng sự(2005) cũng đều chỉ thực
hiện trên biến thể chè này.

10.  Vì vậy mà khi lặp lại các công bố
của Kato và Sandal đối với các giống
chè cao sản đang tiêu thụ tại Việt
Nam, như giống Oo-Long, đã gặp
phải nhiều khó khăn.

11. VẬT LIỆU
• Các đoạn chồi nách những cây
chè trưởng thành Camellia
sinensis var.,
• Môi trường nuôi cấy MS, MS1,
MS2,MS3,…là những tổ hợp các
chất sinh trưởng thực vật (IBA,
BA, ABA ) theo liều lượng khác
nhau.

12. Abscisic acid( ABA)

13. Năm 1961 F.Addicott và cộng sự tách
từ quả bông già khô chất kích thích
rụng lá. Năm 1963 từ quả bông non
cũng vậy, ông gọi là absixin (từ tiếng
latinh abscidere - tách ra, rơi rụng).
Cũng 1963 Waring tách từ lá bạch
dương chất gây ngủ chồi.
Năm 1964 tách chất tương tự từ lá cây
ngô đồng và tinh thể hoá gọi là dormin
Năm 1967 gọi chất đó là a.Abscisic
(ABA).

14. • ABA là một chất 15 cacbon, có cấu trúc hoá
học giống với phần đầu của các chất nhóm
carotenoid.

15. ABA – một chất điều hòa sinh trưởng thực
vật vừa có vai trò ức chế, vừa có vai trò kích
thích sự phát triển đối với một quá trình sinh
học như: kiểm soát sự rụng lá, cảm ứng
trạng thái ngủ của chồi và hạt vào mùa thu
để đợi đến mùa xuân, giúp đóng các khí
khổng khi cây chịu hạn.
Vận chuyển không phân cực, chủ yếu qua
mô libe.

16. Chính vai trò rất đặc biệt này của
ABA mà người ta đã nghiên cứu tìm
ra cơ chế tương tác thích hợp giữa
mô và các giai đoạn phát sinh hình
thái nhằm kích thích sự tái sinh
chồi từ mô sẹo lá chè.

17. Phương pháp tiến hành
1)Sự khởi đầu nuôi cấy mô sẹo
• Quá trình vô trùng vào mẫu được tiến
hành trong erlen 100 ml có bổ sung 20
ml môi trường MS với 8 g.l-1 agar, 1 g.l-1
TDZ (Thidiaruzon) và 30 g.l-1 đường
sucrose.

18. THÍ NGHIỆM 1
• Các lá thứ 3 tính từ đỉnh cây xuống
được cắt thành mẫu cấy có kích thước
(5,0x1,0 mm2 ) được dùng làm vật liệu
thí nghiệm.
• Sau đó, các phản ứng phát sinh hình
thái mô được thử nghiệm trên môi
trường MS1 có bổ sung 30g.l-1sucrose và
các nồng độ khác nhau của tổ hợp giữa
IBA và BA.

19. Tạo callus trên môi trường MS1

20. Bảng 1. Ảnh hưởng của các nồng độ IBA và BA lên sự cảm ứng mô sẹo từ
nuôi cấy lá

22. THÍ NGHIỆM 2
• Các mô sẹo được hình thành sau 20 ngày
nuôi cấy trên môi trường MS1được chuyển
sang môi trường MS2 có bổ sung các nồng
độ khác nhau của ABA và tổ hợp của BA
và IBA để tái sinh chồi.(bảng 2)

23. Tái sinh chồi trong môi trường MS2

24. Tạo cụm chồi

25. CV=0.01 và LSD=1.456

27. 2) Tái sinh rễ in vitro và chuyển cây con
ra vườn ươm
THÍ NGHIỆM 3
Các chồi được tái sinh từ mô sẹo lá
được tách ra và tiến hành nuôi cấy trên
các môi trường MS3, MS4 nhằm kích thích
cây tạo rễ.(sử dụng hộp nhựa )
Các chồi cao khoảng 4-5cm với bộ rễ
khoẻ mạnh được chuyển ra trồng thử
nghiệm ngoài vườn ươm.

28. Phân tích TN3

30. Cây chè được chuyển ra vườn ươm

31. Kết quả
1) Sự hình thành mô sẹo và tái sinh chồi(TN1,2)
Sau 14 ngày nuôi cấy trên các nồng độ khác
nhau của IBA và BA(hình a)
Tuy nhiên, mô sẹo đã không cho thấy bất kì
phản ứng phát sinh hình thái khác trong suốt
quá trình nuôi cấy trên cùng môi trường MS1
cũng như cấy truyền sang môi trường có
cùng đặc tính. Mặc dù mô sẹo được phát
sinh ở tất cả các nồng độ giữa IBA và BA
nhưng cho đến khi được đưa vào MS2 thì
quá trình tái sinh chồi mới diễn ra(hình b)

32. Sự tái sinh chồi
• Nghiệm thức L14 có sự khác biệt có ý
nghĩa với tất cả các nghiệm thức còn lại:
số chồi/mô đạt cao nhất(hình b). Điều này
khuyến cáo áp dụng L14 sẽ có hiệu quả
kinh tế nhất.
• Sự tái sinh chồi bất định thông qua mô
sẹo từ nuôi cấy in vitro được báo cáo lần
đầu tiên và duy nhất cho đến nay bởi
Sandal và cộng sự(2005).

33. Trong nghiên cứu đó, Sandal dùng 2.4-D
làm chất ĐHSTTV duy nhất trong quá
trình tái sinh chồi bất định đạt kết quả tối
ưu(14±1,6 chồi/mô) sau 24 tuần nuôi cấy.
Tuy nhiên, ông sử dụng nồng độ 2.4-D
quá cao và trong thời gian quá dài, còn
trong TN này chỉ mất 10 tuần mà đạt kết
quả không chênh lệch bao nhiêu và nồng
độ chất ĐHSTTV thấp hơn nhiều.

34. Nghiên cứu cơ quan khí khẩu
cây chè

35. Hình thái khí khổng trong 3 môi trường khác
nhau dưới KHV độ phóng đại 600 lần

36. • Hình a: lá ngoài tự nhiên
• Hình b: lá in vitro môi trường rắn
• Hình c: lá in vitro trong môi trường lỏng
Các lá in vitro có lượng khí khổng nhiều
hơn các lá ex vitro, nhưng ngược lại thì
sức sống kém hơn do có nhiều nước hơn
và không có lớp biểu bì sáp bao bên
ngoài.

37. KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này, có lẽ ABA đa
ức chế sự tăng sinh khối mô sẹo khi
được bổ sung vào môi trường nuôi
cấy, nhưng đồng thời cũng kích thích
sự phát triển các phát thể chồi từ mô
sẹo.

38. Từ công bố này ta có được một mô
hình chung về nồng độ ABA cần thiết
trong quá trình nuôi cấy mô lá cây chè
để đạt hiệu quả tái sinh chồi cao nhất.
Điều này có một ý nghĩa lớn lao trong
ngành công nghiệp chè nói riêng và
trong nền kinh tế nước nhà nói riêng.
Hy vọng là trong thời gian tới, kĩ thuật
trồng chè bằng công nghệ vô tính sẽ
được áp dụng rộng rãi trong cả nước.

39. Phụ lục
• MS:Môi trường MS • D.Vi lượng 2 (g/l)
(Murashige and Skoog) KI (Kali iodua) 0.83
Môi trường được pha thành 7 Na2MoO4.2H2O 0.25
dung dịch mẹ như sau: E.Vi lượng 3 (g/l)
A.Đa lượng (g/l) CuSO4.5H2O 0.25
KNO3 19.0 CoCl2.6H2O 0.25
NH4NO3 16.5 F.Sắt/EDTA (g/100ml)
CaCl2.2H2O 4.4 Na2EDTA 0.372
MgSO4.7H2O 3.7 FeSO4.7H2O 0.278
B.Phosphat (g/l) G.Vitamin (mg/100ml)
KH2PO4 1.7 Glycin 200
NaH2PO4 1.7 Nicotinic acid 50
C.Vi lượng1 (g/l) Pyridoxin-HCl 50
H3BO3 0.62 Thiamin-HCl 10
MnSO4.H2O 1.69 Myo-inositol 10.000
ZnSO4.2H2O 0.86

40. Muốn có 1 lít môi trường làm việc
MS dùng trong NCM
-Chuẩn bị một bình dung tích 2 lít, chứa
sẵn 400ml nước cất
-Thêm 100ml A và 100ml B
-Thêm 10ml C và 10ml F
-Thêm 1ml D và 1ml G
-Thêm 0,1ml E
-Thêm nước cất cho đủ 1 lít.

41. Tài liệu tham khảo
• Tài liệu chính dựa trên nghiên cứu của Th.s
Nguyễn Thanh Mai và SV Nguyễn Sĩ Tuấn( ĐH
Mở TP.HCM).
• Kato M (1996) Somatic embroygenesis from
immature leaves of in vitro grown tea shoots.
Plant Cell Rep. 15: 920-923.
• Nghiên cứu vai trò ABA trong việc tăng cường
khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo(Liu và cộng
sư, 1997, Modal và cs, 2004, Peterson và Smith,
2004, …).etc..

42. THE END