Khóa luận tốt nghiệp đại học Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây Tầm bóp (Physalis angulata)

Luận Văn Group hỗ trợ viết luận văn thạc sĩ,chuyên đề,khóa luận tốt nghiệp, báo cáo thực tập,
Assignment, Essay
Zalo/Sdt 0967 538 624/ 0886 091 915 Website:lamluanvan.net
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành báo cáo này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy TS.
Hoàng Lê Tuấn Anh, đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình viết luận
văn.
Em chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển, các anh, chị trong
phòng Nghiên cứu cấu trúc – viện Hóa sinh biển – viện Hàn lâm khoa học công
nghệ Việt Nam đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập, tận tình
truyền đạt kiến thức và kĩ năng cần thiếtcho em. Với vốn kiến thức được tiếp thu
trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu mà còn là
hành trang quý giá để em bước vào đời một cách vững chắc
Cuối cùng em kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong
sự nghiệp cao quý. Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Viện Hóa sinh
biển luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 4 năm 2017
Phạm Hồng Vân
3

Assignment, Essay
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận:
“Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây
Tầm bóp (Physalis angulata)”
Dưới sự hướng dẫn của TS. Hoàng
không trùng với kết quả của tác giả
Lê Tuấn Anh là hoàn toàn trung thực và
khác.
Sinh viên
Phạm Hồng Vân
4

Assignment, Essay
MỤC LỤC
1 LỜI CẢM ƠN......................................................................................................................1
2 LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................4
3 MỤC LỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU ...................................................................6
4 MỞ ĐẦU .............................................................................................................................7
5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...............................................................................................9
6 CHƯƠNG 2. MẪU THỰC VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................34
7 CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM.......................................................................................38
8 CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ ..........................................................................42
9 KẾT LUẬN.......................................................................................................................52
10 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................53
5

Assignment, Essay
MỤC LỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hình ảnh của cây, hoa, quả cây Tầm bóp……………………………4
Hình 1.2: Các hợp chất Flavonoids …………………………………………....8
Hình 1.3: Các hợp chất Withanolides …………………………………………15
Hình 2.1: Mẫu cây Tầm bóp …………..………………………………………28
Hình 3.1: Sơ đồ phân lập phân đoạn cây Tầm bóp ……………………………33
Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 1…36
Hình 4.1.2: Phổ proton 1
H của hợp chất 1………………………………………37
Hình 4.1.3: Phổ cacbon 13
C của hợp chất 1 ……………………………………38
Hình 4.1.4: Phổ HSQC của hợp chất 1 ……………………………...…………38
Hình 4.1.5: Phổ HMBC của hợp chất 1……………………………...…………39
Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 2.…41
H của hợp chất 2………………………………………42
C của hợp chất 2………………………..……………42
Hình 4.2.4: Phổ HSQC của hợp chất 2…………………………………………43
Hình 4.2.5: Phổ HMBC của hợp chất 2…………………...……………………43
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các hợp chất Withanolides…………………………………………8
Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất 1 và chất tham khảo…………….………39
Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất 2 và chất tham khảo……….……………44
6

Assignment, Essay
MỞ ĐẦU
Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có nhiều điều kiện cho các
sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều
hệ sinh thái khác nhau. Thiên nhiên thuận lợi là điều kiện cho sự phát triển đa
dạng của hệ thực vật. Từ xưa đến nay, cây cỏ đã xuất hiện trong các bài thuốc
dân gian và trong đời sống của con người.
Việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên là một nhiệm vụ quan
trọng đã và đang được các nhà khoa học trong nước và thế giới quan tâm với
mục đích phục vụ, đáp ứng nhu cầu về y tế, nông nghiệp và các mục đích khác
nhau trong sinh hoạt của con người.
Thiên nhiên không chỉ là nguồn cung cấp các “bài thuốc” quý hiếm mà
còn là nơi lưu trữ các chất dẫn đường để tổng hợp những bài thuốc mới. Trong
quá trình nghiên cứu các chất phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã chế
tạo ra những bài thuốc có khả năng phòng, chữa bệnh. Trong đó có cây tầm bóp
– Loại thực vật được sử dụng như dược liệu quý, sử dụng phổ biến có tác dụng
thanh nhiệt, tiêu đờm, chủ trị các chứng bệnh như cảm sốt, yết hầu sưng đau,…
là một dược liệu trong bài thuốc dân gian nên cần được nghiên cứu để giải thích
tác dụng chữa bệnh của cây và tạo cơ sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh.
Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp:
‘‘Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của
cây tầm bóp (Physalis angulata)’’
Với mục đích nghiên cứu thành phần diclometan từ lá cây tầm bóp và xác
định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập. Từ đó tạo cơ sở cho những
7

Assignment, Essay
nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm các phương thuốc mới cũng như giải
thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền Việt Nam. Đây là
yếu tố quan trọng có ý nghĩa to lớn đối với sự phát triển của nền y học.
Nhiệm vụ chính của đề tài là :
1. Thu mẫu cây tầm bóp (Physalis angulata), xử lý mẫu và tạo dịch chiết.
2. Phân lập một số hợp chất từ phân đoạn điclometan từ lá cây tầm bóp
(Physalis angulata).
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được.
8

Assignment, Essay
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Nghiên cứu tổng quan
1.1.1 Thực vật học
Giới thiệu về thực vật học
Tên thực vật : Physalis angulata
Tên thường gọi: Tầm bóp (Thù lù canh, bôm bốp, lồng đèn )
Phân loại khoa học
Giới
(không
(không
Bộ
Họ
Chi
Loài
phân hạng)
phân hạng)
Plantae
Angiospermae
Eudicots
Solanales
Solanaceae
Physalis
P. angulata
1.1.2 Mô tả thực vật
Tầm bóp là cây thân thảo hằng niên, mọc hoang quanh năm.
Thân: Thân cao 50 - 100 cm, phân nhiều cành. Đường kính thân tròn, 1-2
cm.
Lá: Lá mọc so le, hình bầu dục, chia thùy hay không, dài 30 - 35mm, rộng
20 - 40mm; cuống lá dài từ 15 - 30mm.
9

Assignment, Essay
Hoa: Hoa mọc đơn độc ở nách lá, có cuống mảnh, dài khoảng 1 cm. Đài
hình chuông, có lông, chia ra từ phía giữa thành 5 thùy, tràng hoa màu vàng tươi
hay màu trắng nhạt, có khi điểm những chấm màu tím ở gốc hoa. Đài đồng
trưởng bao lấy quả nên có tên là quả lồng đèn.
Quả: Quả mọng tròn, nhẵn, lúc non màu xanh, khi chín màu đỏ, có đài cùng
lớn với quả, dài 3-4 cm, rộng 2 cm, bao trùm lên ở ngoài như cái túi, hạt nhiều hình
thận. Ruột quả có nhiều không gian rổng, khi bóp quả vỡ phát ra tiếng “bộp”.
Hạt: Quả chứa nhiều hạt nhỏ nhỏ hình thận, hạt có ngoại nhũ khi chín ăn
có vị chua, ngọt. Cây ra hoa kết quả quanh năm. [1][3]
Hình 1.1: Hình ảnh của cây, hoa, quả cây Tầm bóp
10

Assignment, Essay
1.1.3 Phân bố và sinh thái
Các loài trong Chi Physalis thường là cây thân thảo đứng sống một năm
hay nhiều năm. Hầu hết các loài yêu cầu ánh nắng mặt trời đầy đủ và khí hậu khá
ấm áp và chịu nhiệt độ nóng. Một số loài rất nhạy cảm với sương giá, nhưng có
một số loài chẳng hạn như loài thù lù Trung Quốc, P. alkekengi, chịu đựng được
nhiệt độ rất lạnh và sống được qua mùa đông. Các loài trong Chi thù lù có đặc
trưng là quả khi chín có màu cam và tương tự về kích thước, hình dạng và cấu
trúc giống như quả nhãn lồng (chùm bao) với ruột quả có nhiều ngăn rộng và
một số loài có quả ruột đặt giống như quả cà chua, là loại quả ăn được với tên
gọi là quả anh đào đất (Groundcherry).
Ở Việt Nam, cây Tầm bóp không rõ xuất hiện từ lúc nào, nhưng đã từ lâu
nó đã trở thành cây mọc hoang dại trên mọi miền đất nước và được người dân
dùng làm rau ăn và dùng làm thuốc trong dân gian để chữa bệnh. Thực tế cho
thấy cây mọc ở vùng có độ cao so với mặt nước biển ăn bùi và thơm hơn cây
mọc ở vùng đồng bằng, đặc biệt là khi cần làm thuốc người ta thường tìm đến
cây rau Tầm bóp của các vùng núi cao.[2]
1.1.4 Tính vị và công dụng của cây tầm bóp
Tính vị: Toàn cây có vị đắng, tính mát, không độc. Quả có vị chua.
Công dụng :
Bộ phận sử dụng làm thuốc là toàn cây có tác dụng kháng khuẩn, chống
ung thư, chống đông máu, chống bệnh bạch huyết,chống nấm và vi khuẩn, chống
loại nấm nguyên sinh antimycoplasmique, ( loại vi khuẩn không có vách tế bào ),
chống co thắt, chống ung bướu, kháng virus, hạ đường máu , hạ huyết áp , điều
11

Assignment, Essay
hòa miễn dịch ( điều hòa biến đổi một số tế bào miễn nhiễm hoạt động quá mức),
kích thích miễn dịch, thường dùng trị cảm sốt, yết hầu sưng đau, ho nhiều đờm,
phiền nhiệt nôn nấc
Quả Tầm bóp ăn được và dùng chữa đờm nhiệt sinh ho, thủy thũng và
đắp ngoài chữa đinh sang, rễ tươi nấu với tim lợn, chu sa dùng ăn chữa được
chứng đái đường. [3][4]
Một số bài thuốc khác
Dùng ngoài trị nhọt vú, đinh độc, đau bìu dái: dùng 40-80g cây tươi
giã vắt lấy nước cốt uống, bã thì dùng đắp; hoặc nấu nước rửa.
Dùng trị viêm họng, khan tiếng, ho khan, ho có đờm đặc [4], trị tiểu ít,
ban đỏ, thủy đậu (trái rạ), bệnh tay chân miệng, cúm gia cầm: liều dùng 15 - 30 g
cành mang hoa lá khô (tươi 50 - 100 g) sắc uống trong ngày. Dùng 3 - 5 ngày liền.
Lá cây tầm bóp rất tốt cho dạ dày, do đó ngoài việc dùng tầm bóp làm
thuốc chữa bệnh người ta còn dùng thứ cây này như một vị rau ăn hàng ngày.
Rau tầm bóp ăn hơi đắng nhưng thanh mát dễ ăn.
Những người hay lênh đênh sông nước nên ăn quả này thường xuyên
vì lượng Vitamin C và B1, tiền vitamin A trong quả tầm bóp rất cao nên rất tốt
cho cơ thể, có thể chữa bệnh Scorbut vì trên biển không có hoa quả. Ngoài ra
quả tầm bóp còn có thể phòng ngừa các bênh về đường tiết niệu và viêm thận ví
dụ sỏi thận, sỏi bàng quang và chữa bệnh gút rất tốt.
Ở Ấn Độ, toàn cây được sử dụng làm thuốc lợi tiểu; lá được dùng trị
các rối loạn của dạ dày.
Ở Africa, họ ăn lá cây đã được nấu chín hoặc dùng như một tấm băng
để băng các vết thương bị nhiễm trùng.
1.1.5 Thành phần hóa học
12

Assignment, Essay
Theo nghiên cứu của Chothani và Vaghasiya chỉ ra rắng quả tầm bóp có
chứa 61,4% nước trái cây và 76,7% độ ẩm. Nó cũng chứa đường, tannin, khoáng
chất, protein, pectin và một lượng vitamin tốt cho cơ thể (24,45 mg / 100 ml
nước trái cây). Hạt giống gồm 2 phần là dầu và protein. Phần dầu có chứa axit
béo, tức là palmitic, stearic, oleic, linoleic và chứa một lượng nhỏ axit béo
hexadecen và axit béo hydroxyl [19].
Thành phần khi chiết dịch cây cho thấy, cây có chứa một số hợp chất
loại Flavonoid và Withanolides. Ngoài ra còn có chlorogenic acid, cholin,
xocarpanolid, myricetin, phygrin. [20]
1.1.5.1. Các hợp chất Flavonoids
Nghiên cứu về thành phần Physalis angulata đã phân lập được 6 hợp chất
(1-6): Myricetin 3-O-neohesperidoside (1) [13], Luteolin-7-O--d-glucopyranosideH
(2) [14], Quercetin (3), Querc444etin 3-O-methyl ether (4), Kaempferol 7-OH-
rhamnoside (5), Isoquercetrin (6) [7].
(1) OH (2)
Glc
H
13

Assignment, Essay
(3) R1
=R2
=R3
=H
(4) R1
=R2
=H,R3
= MeO
(5) R1
=Rha, R2
=R3
=H
(6)
Hình 1.2: Các hợp chất Flavonoids
1.1.5.2. Các hợp chất Withanolides
Phân lập được 33 hợp chất (7-39) từ thành phần Physalis angulata
gồm có :
Bảng 1.1: Các hợp chất Withanolides
KH Chất TLTK
7 Aminophysalin A 20
8 Physangulidine A 20
9 Physangulidine B 20
10 Physangulidine C 20
11 Physagulin P 9
14

Assignment, Essay
12 Physagulin Q 9
13 Physagulin I 6
14 Physagulin M 6
15 Physagulin L 11
16 Physagulin O 11
17 Physagulin K 11
18 Physagulin N 6
19 Physagulin H 20
20 14e-Physagulin P 9
21 Physagulins J 20
22 Physagulins N 11
23 Physanolide A 20
24 Physalin P 20
25 Physalin D 20
26 Physalin H 20
27 Physalin G 20
28 Physalin W 8
29 Withangulatin G 8
30 Withangulatin D 8
31 Withangulatin I 20
32 Withangulatin F 8
33 Withagulatin B 8
34 Withagulatin C 8
35 Withagulatin E 8
15

Assignment, Essay
36 Withagulatin H 8
37 6a-Chloro-5,6-dihydro-5b-hydroxyphysalin B 20
38 5a-Ethoxy-5,6-dihydro-6b-hydroxyphysalin B 20
39 (6a,14b,15a,17a,22R)-22,26-Epoxy-6,14,17-trihydroxy- 11
1,26-dioxoergosta-2,4,24-trien-15-ylacetate
(7)
(8)
(9) (10)
16

Luận Văn Group hỗ trợ viết luận văn thạc sĩ,chuyên đề,khóa luận tốt nghiệp, báo cáo thực
tập, Assignment, Essay
(11)
(12)
(13) (14)
(15) (16)
17

MeO
H
(17)
(19)
H
AcO
(18)
R= β-H
(20)
(21)
(22)
18

(23) MeO
H
(25)
H
(24)
(28)
(31)
19

(33)
OH
(34)
H
H (35)
(32)
OH
MeO
H
(36) (39)
20

Assignment, Essay
(37)
(38)
Hình 1.3: Các hợp chất Withanolides
1.1.6 Hoạt tính sinh học
- Hoạt tính chống viêm , giảm đau và hạ sốt : Theo nghiên cứu Murad và các
cộng sự đã nghiên cứu về chiết xuất thô và phân đoạn chloroform của các cây
thuộc chi Physalis cho thấy khả năng chống viêm giảm đau rất tốt. Khả năng hạ
sốt của chiết xuất thô và phận đoạn chloroform không đáng kể [13]
- Hoạt tính gây độc tế bào: Kheng Leong Ooi, Tengku Sifzizul Tengku
Muhammad, Shaida Fariza Sulaiman thử nghiệm độc tính của physalin F cho thấy
hiệu quả ức chế đáng kể phụ thuộc vào liều lên tế bào T-47D với giá trị EC50 thấp
hơn (3,60 μg / ml) so với chiết xuất thô. Phân tích biểu hiện mRNA cho thấy sự
đồng điều chế gen c-myc và caspase-3-apoptotic trong các tế bào đã được điều trị
với mức biểu hiện tại 9 và 12 giờ điều trị. Cơ chế gây độc này được khẳng định
lại bởi quá trình phân mảnh DNA và phosphatidylserine bên ngoài.[ 15]
- Hoạt tính “in vitro”: Theo nghiên cứu của Kashima và các cộng sự chỉ ra
rằng các chiết xuất dầu thô của cả hai bộ phận trên không và rễ từ dịch chiết của
cây Tầm bóp có tác dụng chống lại các siêu vi khuẩn bại liệt, sởi,… [16]. Riêng
21

Assignment, Essay
tại Nhật có một số nghiên cứu chú trọng đến các hoạt tính “in vitro” chống lại
các siêu vi khuẩn bại liệt, Herpes simplex I, sởi, ban hồng, trái rạ và cả HIV-I
(do ức chế sao chép ngược).
- Hoạt tính chống ung thư: Nghiên cứu tại Viện khảo cứu các hợp chất thiên
nhiên thuộc ĐH y khoa Kaohsiung (Thượng Hải) về hoạt tính chống ung thư gan
của Physalis angulata ghi nhận các dịch chiết toàn cây bằng nước và bằng
ethanol được đánh giá về hoạt tính chống ung thư gan trên các dòng tế bào Hep
G2, Hep 3B, PLC/PRF/5 ghi nhận hoạt tính chống ung thư do gây ra hiện tượng
tế bào tự hủy (apoptosis) phối hợp với những rối loạn chức năng của các
mitochondria nơi màng tế bào bị ung thư. Tác dụng diệt bào này không xảy ra
nơi các tế bào gan lành mạnh .
- Nghiên cứu tại khoa vi trùng và miễn dịch học, ĐH y khoa quốc gia Cheng
Kung (Thượng Hải) ghi nhận các dịch chiết từ Physalis angulata có những hoạt
tính điều hòa hệ miễn dịch như cải thiện đáp ứng blastogenesis (lý thuyết cho
rằng các đặc điểm di truyền được chuyển từ cha mẹ sang con cái bằng mầm
nguyên sinh); kích hoạt các tế bào T; gia tăng đáp ứng kháng thể… [5].
- Nghiên cứu tại Nhật (khoa dược, ĐH Fukuoka) ghi nhận phần trên mặt đất của
cây Tầm bóp (Physalis angulata) có hoạt tính diệt được một số ký sinh trùng,
đặc biệt nhất là Trypanosoma cruzi - tác nhân gây bệnh Chagas do con Rệp hun
lây truyền
- Ngoài ra , cây Tầm bóp còn có một số hoạt tính : chống oxy hóa, chống sốt
rét và hoạt tính NF-κB [12].
22

Assignment, Essay
1.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật
1.2.1 Chọn dung môi chiết
Chọn dung nôi khả năng hoà tan tối đa các hoạt chất và tối thiểu các tạp
chất trong dược liệu.
Chất lượng của dung môi
- Dễ thấm và hoà tan chọn lọc (hoà tan nhiều dược chất, ít tạp chất).
- Trơ về mặt hoá học: không làm biến đổi hoạt chất, không gây khó khăn
trong quá trình bảo quản
- Không bị phân huỷ bới nhiệt độ cao và không gây cháy nổ
- Phải bay hơi được khi cần cô đặc dịch chiết.
- Không làm thành phẩm có mùi vị đặc biệt
Các dung môi hay được sử dụng
- Những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một
phần của cây (lá, thân, rễ, hoa, quả, củ…) chủ yếu là clorofoc, metylen clorit và
methanol
- Người ta sử dụng dung dịch nước của methanol thay vì dùng nước để
chiết dịch thô từ cây.
- Axeton có thể tạo thành axetonit nếu 1,2- cis- diol có mặt trong môi trường
axit. Quá chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân
tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit, bazơ để tạo ra những
sản phẩm mong muốn.
- Dietylete hiếm khi được dùng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay
hơi, dễ bốc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ. Peroxit
23

Assignment, Essay
của dietylete dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo
cholesterol như các carotenoid.
Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30
- 40ºC với một vài hóa chất chịu nhiệt để có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
1.2.2 Quá trình chiết
Các quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm
- Chiết sử dụng bình chiết Xoclet
- Chiết sắc với dung môi nước
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước
Thông thường bình chiết ngâm không sử dụng như phương pháp chiết
liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong bình chiết khoảng 24 giờ sau đó
mới lấy chất chiết ra. Cần lưu ý, sau một quá trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu
được sẽ không chứa những chất giá trị nữa. Việc kết thúc quá trình chiết được
xác định bằng một số cách như sau:
- Với các ankaloit , có thể kiểm tra sự xuất hiện của các loại hợp chất này
bằng phản ứng tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như: Dragendorff, Mayer,…
- Với các flavonoid thường là những hợp chất màu nên khi dịch chảy ra
mà không có màu có nghĩa là đã rửa hết chất này trong quá trình chiết.
- Với các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất
hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
- Với các lacton của sesquitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng kedde
có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc sử dụng phản ứng với
24

Assignment, Essay
aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hidrat cacbon. Từ đó có thể biết
được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tùy thuộc vào mục đích cần lấy chất gì để lựa chọn dung môi
thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí để đạt hiệu quả cao.
1.3 Các phương pháp sắc kí trong quá trình phân lập các hợp chất hữu cơ
Sắc ký là phương pháp được sử dụng rất nhiều và đóng vai trò quan trọng
trong nghiên cứu các chất tự nhiên.
1.3.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc kí
Sắc ký là phương pháp tách, phân ly, phân tách các chất dựa vào sự phân bố
khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của
chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, …). Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha
động mới chuyển động dọc theo hệ thống sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực
khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc
ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ,
phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm
hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm
này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.
1.3.2 Cơ sở phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai
pha động và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các
chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các
chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của
việc tách sắc ký.
25

Assignment, Essay
Ta có định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh có nồng độ n1∞ (nồng độ của dung
dịch ) khi nhiệt độ không đổi
n = N∞ .b.C
1+b.C
n: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh.
N∞ : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên chất hấp phụ nào đó.
b: Hằng số.
C: Nồng độ của chất bị hấp phụ.
1.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký
• Phân loại theo trạng thái liên hợp của pha động và pha tĩnh: sắc ký lỏng
và sắc ký khí.
• Phân loại theo cơ chế của quá trình tách : Sắc ký hấp phụ, sắc ký phân
bố, sắc ký trao đổi ion và Sắc ký rây phân tử.
• Phân loại theo cách hình thành sắc đồ: phương pháp tiền lưu, phương
pháp đẩy,phương pháp rửa giải.
• Phân loại theo thiết bị hình thành sắc đồ: sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng.
1.3.3.1 Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc ký
được dùng để tách các chất trong hỗn hợp[1]. Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao
gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium
oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm
dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút
26

Assignment, Essay
lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực
của các thành phần trong dung dịch.
1.3.3.2 Sắc ký cột
Đây là phương pháp sắc ký được sử dụng nhiều nhất.
Chất hấp phụ (pha tĩnh) bao gồm các loại silicagen (độ hạt khác nhau). Pha
thường cũng như pha đảo YMC, ODS, Dianion,… chất hấp phụ được nhồi vào cột
(chủ yếu là cột thủy tinh, ngoài ra còn có cột kim loại inox). Độ mịn của chất hấp
phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp
phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng lớn thì số đĩa lí thuyết càng nhỏ , khả năng tách
càng thấp và ngược lại. Có thể điều chỉnh tốc độ chảy tăng lên hoặc giảm đi tùy
theo độ hạt chất hấp phụ (Độ hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy cũng giảm đi). Trong một
số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung
môi không chảy được), giải pháp khi đó để hết hiện tượng tắc người ta phải sử dụng
áp suất với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Tỷ lệ L/D rất quan trọng, thể hiện khả năng tách cột (với L- chiều cao cột
và D- Đường kính cột). Nó phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn
hợp nhất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với
quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác
nhau. Chính nhờ sự khác nhau này mà người ta tách được từng chất ra khỏi hỗn
hợp chất.
Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng tùy thuộc vào yêu
cầu tách. Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp từ 1/5 đến 1/10, còn nếu tách tinh thì tỷ
lên này cao hơn và tùy thuộc vào hệ số tách.
27

Assignment, Essay
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tùy thuộc vào
lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp
khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silicagen
rồi làm khô, tơi hoàn toàn sau đó đưa lên cột. Nếu tách tinh, người ta đưa trực tiếp
chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Việc nhồi cột bằng chất hấp phụ cũng hết sức quan trọng, có hai cách đưa
chất hấp phụ lên cột:
+ Nhồi cột khô: Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau
đó dùng que mềm gõ nhẹ lên thành cột để chấp hấp phụ sắp xếp chặt trong cột.
Tiếp theo, dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
+ Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột trước
với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết.
• Khi nhồi cột không được có bọt khí bên trong. Vì nếu có bọt khí sẽ gây nên
hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách.
• Tốc độ chảy của dung môi phải đảm bảo liên tục và vừa phải. Nếu tốc độ
dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá
thấp sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.4. Một số phương pháp hóa lí xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ
1.4.1. Phổ IR
Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuật phân
tích rất hiệu quả. Kĩ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chất hóa học
có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụ các bức
28

Assignment, Essay
xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc
dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại.
Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các
nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học. Ví dụ: dao
động hóa trị của nhóm cacbonyl C=O trong andehyt/xeton là 1650 - 1800 cm-1
,
trong anhydrit là 1750 - 1870 cm-1
; nhóm C=C của anken là 1600 - 1650 cm-1
;
nhóm C≡C của ankin là 3150 cm-1
; nhóm OH tự do trong các hydroxyl là 2500 -
3500 cm-1
; nhom C-O-C là 1150 - 1250 cm-1
. Bởi vậy phổ hồng ngoại của một hợp
chất hóa học coi như “ dấu vân tay’’, có thể căn cứ vào đó để nhận dạng chúng.
Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, lượng
chất cần cho phép đo là 2-3 mg và khó thu hồi lại. Do đó, với lượng chất thu
được ít từ các hợp chất thiên nhiên thì phổ hồng ngoại thường được đo sau khi
hoàn chỉnh các phép đo khác.
1.4.2 Phổ khối lượng
Cơ sở của phương pháp phổ khổi lượng đối với các hợp chất hữu cơ là sự
bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện
tích dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phần tử mang
năng lượng cao. Sau đó, phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận thu được
phổ khối lượng. Dựa vào phổ khối này có thể xác định được phân tử khối và cấu
tạo phân tử của chất nghiên cứu.
Khi ion hóa mẫu theo các phương pháp khác nhau sẽ thu được các phổ
khối lượng các nhau. Một số phương pháp thường được sử dụng:
29

Assignment, Essay

Phổ EI - MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) phương pháp
va chạm electron. Sử dụng chùm electron để “bắn phá’’ phân tử mẫu ở trạng
thái hơi. Electron va chạm với các phân tử trung hòa làm bật ra electron và
phá vỡ phân tử thành các mảnh ion, mảnh gốc hay phân tử trung hòa nhỏ.
Điều kiện chuẩn để thực hiện EI là 70 eV.



Phổ ESI - MS (Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy) phổ phun điện
tử. Phổ này thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều phổ EI - MS.
Dung dịch mẫu sẽ được phun thành những hạt nhỏ vào một buồng chân
không dưới điện trường. Các giọt dung dịch bị tích điện và bay hơi dung môi
sẽ vỡ giọt thành các hạt nhỏ hơn và cuối cùng thành các ion. Các phân tử bị “
vỡ’’ nhẹ nhàng hơn tạo ra ít mảnh phân tử và có cường độ lớn hơn. Phổ thu
được chủ yếu là các pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các
liên kết có mức năng lượng thấp.



Phổ FAB - MS (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) phương pháp bắn phá
nhanh bằng nguyên tử ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu


được pic ion phân tử.


Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution mass spectroscopy) cũng cho
phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.

Ngoài ra, hiện nay còn sử dụng các phương pháp sắc kí kết hợp với khối phổ
như: GC - MS (sắc kí khí - khối phổ) dùng cho các chất dễ bay hơi như tinh dầu
trên cơ sở ghép máy sắc ký khí với máy phổ khối lượng, toàn bồ hệ thống GC -
MS được nối với máy tính để tự động điều khiển hoạt động của hệ, lưu trữ và xử
lí số liệu; LC - MS (sắc kí lỏng - khối phổ) cho các hợp chất khác. Các phương
pháp này rất hiệu quả khi phân tích thành phần hỗn hợp chất.
30

Assignment, Essay
1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp vật lí hiện đại nghiên cứu
cấu tạo của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp NMR nghiên cứu cấu trúc phân tử
dựa vào sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1
H và 13
C) dưới tác dụng
của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch
chuyển hóa học. Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào
tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). Các hạt nhân này là
một phần của nguyên tử và các nguyên tử lại tập hợp thành phân tử. Vì vậy, phổ
NMR có thể cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử mà khó có phương
pháp nào có thể nhận biết được. Có nhiều hạt nhân có thể nghiên cứu bằng NMR
, song Hidro và Cacbon là phổ biến nhất
Có nhiều kĩ thuật xác định NMR khác nhau được áp dụng nhưng mỗi kĩ
thuật dùng để xác định những đặc tính cộng hưởng từ nhất định của hạt nhân.
Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc người ta có thể đo một hay
nhiều loại phổ khác nhau. Người ta có thể xác định phổ của cùng một loại hạt
nhân (1
H và 13
C) trong các phổ một chiều (1
H - NMR, 13
C - NMR, DEPT), hay
trong các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY,
HETCOR, Long - range HETCOR, NOESY)
1.4.3.1. Phổ 1
H - NMR:
Phổ 1
H-NMR cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. Các
proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ có độ dịch chuyển khác nhau. Ví dụ:
các proton liên kết với cacbon thơm hay liên hợp thường chuyển dịch trong vùng 6-
8 ppm; các proton trong ankan thường chuyển dịch trong vùng 0-2 ppm…Trong
phổ 1
H-NMR độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang
31

Assignment, Essay
ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như
đặc trưng riêng của từng phân tử. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển
hóa học cũng như tương tác spin coupling mà người ta có thể xác định được cấu
trúc hóa học của hợp chất.
1.4.3.2. Phổ 13
C-NMR:
Phổ 13
C-NMR cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của cacbon.
Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín
hiệu phổ khác nhau. Ví dụ: cacbon lai hóa sp3
không liên kết với dị tố chuyển
dịch trong khoảng 0-60 ppm; cacbon liên kết với oxi (alcol, ether) chuyển dịch
trong khoảng 45-85 ppm. Thang đo cho phổ 13
C-NMR cũng được tính bằng ppm
và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm).
1.4.3.3. Phổ DEPT:
Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau.
Trên phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu phổ của CH,
CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350
. Còn trên
phổ DEPT 900
thì chỉ xuất hiện tín hiệu của các CH.
1.4.3.4. Phổ 2D – NMR
Đây là các kí thuật phổ cho phép xác định tương tác của của các hạt nhân
từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ thuật chủ yếu thường được
sử dụng như sau:
Phổ 1
H - 1
H COSY (HOMOCOSY) ( 1
H - 1
H Chemical Shif Correlation
Spectroscopy): đây là loại phổ cho biết mối tương quan giữa proton - proton với
nhau như: proton gem (geminal, hai proton cùng gắn trên một cacbon); proton
vic (vicinal, hai proton gắn trên hai cacbon kề nhau). Nhờ phổ này mà các phần
của phân tử được nối ghép lại với nhau.
32

Assignment, Essay
Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): sử dụng kĩ thuật ngược lại
với phổ HETCOR. Phổ HSQC khảo sát hạt nhân 1
H trục hoành ghép cặp với 13
C
trục tung. Các tín hiệu trên phổ cũng như cách giải phổ tương tự phổ HETCOR. Các
tương tác trực tiếp H - C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này.
Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): đây là phổ biểu
diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Nó dùng để xác định các proton
nhằm vào các tín hiệu tương tác qua hai và ba nối không xuất hiện tín hiệu qua
một nối. Phổ giúp gián tiếp biết được các khung sườn các cacbon thông qua các
tương tác proton.
Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): biểu diễn các
tương tác xa của các proton trong không gian chỉ tính đến khoảng cách nhất định
trong không gian.
Ngoài ra người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE
defferences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Kỹ thuật này được tiến
hành bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trưởng cộng hưởng của một proton
xác định, khi đó, các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về
không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và có tín hiệu phổ có cường độ mạnh hơn.
Như đã đề cập ở trên, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp
chất người ta cần sử dụng phương pháp phổ kết hợp với các phương pháp chuyển
hóa hóa học, phân tích, so sánh… Các phân tử càng phức tạp thì yêu cầu phối
hợp các phương pháp càng cao. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh
dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định được chiều dài các mạch
hay đối với phân tử có các đơn vị đường thì để xác định chính xác loại đường
cần sử dụng phương pháp so sánh GC - MS (sắc kí khí - khối phổ) dùng cho các
chất dễ bay hơi như t
33

Assignment, Essay
CHƯƠNG 2. MẪU THỰC VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mẫu thực vật
Mẫu cây tầm bóp được thu tại Tỉnh Thái Bình , Việt Nam vào tháng
8/2015. Mẫu được TS.Trần Thị Phương Anh, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam
giám đinh. Mẫu tiêu bản (TB14.2015) được lưu giũ tại Viện Hóa sinh biển, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hình 2.1: Mẫu cây Tầm bóp
34

Assignment, Essay
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất
Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các
hợp chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC,
dùng để khảo sát), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột pha đảo.
Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck); phát hiện chất bằng đèn tử ngoại
ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%
được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.
Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường
và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 - 0,063 mm (240 - 430
mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30 - 50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc hóa học của các hoạt chất được xác định bằng các phương pháp phổ
kết hợp như phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối lượng (MS) và
phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi
trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của Viện Hoá học, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan)
• Phổ1
H-NMR: Trong phổ1
H-NMR, đô ̣dicḥ chuyển hóa hoc ̣ (δ) của các
proton đươc ̣xác đinh trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tùy thuôc ̣vào
mức đô ̣lai hóa của nguyên tử cũng như đăc ̣trưng riêng của từng phân tử.
Mỗi loaịproton công̣ hưởng ởmôṭtrường khác nhau vàvìvâỵ chúng đươc ̣
biểu diêñ bằng môṭđô ̣dicḥ chuyển hóa hoc ̣khác nhau. Dưạ vào những đăc ̣
35

Assignment, Essay
trưng của đô ̣dicḥ chuyển hóa hoc ̣cũng như tương tác spin coupling mà
người ta cóthểxác đinḥ đươc ̣cấu trúc hóa hoc ̣của hơp̣chất.
• Phổ13
C-NMR: Phổnày cho tiń hiêụ vacḥ phổcủa cacbon. Mỗi nguyên tử
cacbon se ̃công̣ hưởng ởmôṭtrường khác nhau vàcho môṭtín hiêụ phổkhác
nhau. Thang đo cho phổ13
C-NMR cũng đươc ̣ tinh́ bằng ppm vàvới dải
thang đo rông̣hơn so với phổproton (từ o ppm đến 240 ppm).
• PhổDEPT : Phổnày cho ta những tiń hiêụ phổphân loaịcác loaịcacbon khác
nhau. Trên các phổDEPT, tiń hiêụ của cacbon bâc ̣bốn biến mất. Tín hiêụ
phổcủa CH vàCH3 nằm vềmôṭphía vàcủa CH2 vềmôṭphía trên phổ DEPT
1350
. Còn trên phổDEPT 900
thìchỉxuất hiêṇ tín hiêụ phổcủa các CH.
• PhổHMBC: Đây làphổbiểu diêñ các tương tác xa của H vàC trong phân tử.
Nhờvào các tương tác trên phổnày màtừng phần của phân tửcũng như toàn
bô ̣phân tử đươc ̣xác đinḥ vềcấu trúc.
• PhổNOESY: Phổnày biểu diêñ các tương tác xa trong không gian của các
proton không kểđến các liên kết màchỉtinh́ đến khoảng cách nhất đinḥ
trong không gian. Dưạ vào kết quảphổnày, cóthểxác đinḥ đươc ̣ cấu trúc
không gian của phân tử. Độ quay cực đo trên máy JASCO DIP -1000
KUY polarimeter.
2.3. Dụng cụ và thiết bị
2.3.1 Dụng cụ
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử
dụng bao gồm:
+ Bình chiết 30 lít
36

Assignment, Essay
+ Phễu chiết 2 lít
+ Máy cô quay chân không
+ Đèn từ ngoại 2 bước sóng 254nm và 368nm
+ Tủ sấy chân không
+ Máy sấy
+ Micropipet
+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế
+ Cột sắc ký pha thường và pha ngược các loại đường kính
+ Dung dịch thuốc thử
+ Bếp điện
2.3.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của hợp chất
Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectromecter.
2.4 Hóa chất
+ Silica gel 60 (0,04 – 0.063 nm) Merck.
+ Slica gel pha đảo ODS hoặc YMC RP18 (150 µm, FuJisilisa Chemical
Ldt).
+ Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715).
+ Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck).
+ Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
+ Các loại dung môi hữu cơ như metanol, etanol, etyl axetate, clorofoc,
hexan, axetone, v.v....
37

Assignment, Essay
CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM
3.1. Phân lập các hợp chất
Phân đoạn diclometan được hòa tan bằng lượng tối thiểu dung môi
metanol, bổ sung silica gel (tỉ lệ 1/1,5 về khối lượng), trộn đều rồi cất loại
metanol đến khô rồi nghiền mịn. Hỗn hợp này được tiến hành sắc ký trên cột sắc
ký sử dụng silica gel pha thưởng với hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng
dần diclometan/metanol (từ 0% đến 100% metanol, mỗi lần 1 lít) thu được 5
phân đoạn ký hiệu từ A1 đến A5.
Phân đoạn A2 (2,0 g) tiếp tục được phân tách thành 3 phân đoạn nhỏ hơn,
ký hiệu là A2A – A2C, trên cột sắc ký sử dụng silica gel pha thường với hệ dung
môi rửa giải diclometan/metanol (tỉ lệ 20/1 về thể tích, 4,5 L).
Phân đoạn A2A được phân tách thành 2 phân đoạn A2A1 và A2A2 bằng
cột sắc ký sử dụng silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải
diclometan/acetone (tỉ lệ 20/1 về thể tích, 2,0 L). Tiến hành tinh chế phân đoạn
A2A1 trên cột sắc ký sử dụng silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải
diclometan/metanol (tỉ lệ 30/1 về thể tích, 1,5 L) thu được hợp chất VPA30 (21
mg). Hợp chất VPA31 (25 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn A2A2 trên
cột sắc ký sử dụng silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexan/aceton
(tỉ lệ 5/1 về thể tích, 1,5L).
38

Phân đoạn Diclometan
Sắc ký cột pha thường
diclometan/metanol ( 0% đến 100% methanol)
A1 A2 A3 A4 A5
(2 g)
diclometanmetanol:201
A2A A2B
A2C
diclometan/acetone 20/1
A2A1
A2A2
Diclometan/methanol 30/1
n-hexan/aceton 5/1
Hợp chất 2 Hợp chất 1
VPA30 VPA31
(21 mg) (25 mg)
Hình 3.1: Sơ đồ phân lập phân đoạn cây Tầm bóp
39

Assignment, Essay
3.2. Hằng số vật lý và dự kiện phổ các hợp chất
3.2.1. Hợp chất 1 (Physalin B)
- Công thức phân tử: C28H30O9.
- Khối lượng phân tử: 510,54.
- Phổ proton 1
H-NMR ( MeOD, 500 MHz) H: 5,91 (1H, dd, J = 2,0, 10,0 Hz,
H-2); 6,78 (1H, ddd, J = 2,5, 5,0, 10,0 Hz, H-3); 2,86 (1H, d, J = 4,5 Hz, Ha-4);
3,27*(1H, Hb-4); 5,58 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-6); 2,37 (1H, m, Ha-7); 2,19*(1H, Hb-
7); 2,20*(1H, H-8); 2,92 (1H, m, H-9); 2,03 (1H, d, J = 2,0 Hz, Ha-11); 1,22*(1H,
Hb-11); 2,40 (1H, m, Ha-12); 1,60*(1H, Hb-12); 2,22 (1H, brs, H-16); 1,22 (3H, s,
H-19); 1,97 (3H, s, H-21); 4,55 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-22); 2,04 (2H, m, H-23); 2,45
(1H, d, J = 4,0 Hz, H-25); 4,51 (1H, dd, J = 4,5, 13,5 Hz, Ha-27); 3,79 (1H, d, J =
13,5 Hz, Hb-27); và 1,27 (3H, s, H-28). (* tín hiệu trùng lấp)
- Phổ cacbon 13
C-NMR (MeOD, 125 MHz) C: 205,7 (C-1), 127,4 (C-2),
146,2 (C-3), 32,7 (C-4), 134,0 (C-5), 124,5 (C-6), 24,2 (C-7), 40,4 (C-8), 33,2
(C-9), 52,7 (C-10), 24,8 (C-11), 25,8 (C-12), 79,67 (C-13), 107,5 (C-14), 208,1
(C-15), 5,.4 (C-16), 80,3 (C-17), 172,3 (C-18), 17,9 (C-19), 81,0 (C-20), 21,5 (C-
21), 76,9 (C-22), 33,1 (C-23), 31,1 (C-24), 51,0 (C-25), 166,7 (C-26), 60,7 (C-
27) và 26,5 (C-28).
3.2.2. Hợp chất 2 (Physalin F)
- Công thức phân tử C28H30O10
- Khối lượng phân tử M= 526,54
- Phổ proton 1
H-NMR ( MeOD, 500 MHz) H: 6,01 (1H, dd, J = 2,5, 10,0
Hz, H-2); 6,68 (1H, ddd, J = 2,5, 5,0, 10,0 Hz, H-3); 3,00 (1H, dt, J = 3,0, 15,5
40

Assignment, Essay
Hz, Ha-4); 2,06*(1H, Hb-4); 3,26 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-6); 2,57 (1H, dt, J = 3,5,
15,5 Hz, Ha-7); 1,85 (1H, dd, J = 11,5, 15,5 Hz, Hb-7); 2,26 *(1H, H-8); 2,63
(1H, dd, J = 9,5, 11,5 Hz, H-9); 2,26*(1H, Ha-11); 1,17 (1H, dd, J = 10,0, 15,0
Hz,, Hb-11); 2,34 (1H, dd, J = 5,0, 17,0 Hz, Ha-12); 1,52 (1H, dd, J = 12,0, 17,0
Hz, Hb-12); 2,19*(1H, H-16); 1,30 (3H, s, H-19); 1,95 (3H, s, H-21); 4,53 (1H,
d, J = 2,0 Hz, H-22); 2,05 (1H, d, J = 3,5 Hz, Ha-23); 2,01 (1H, brs, Hb-23);
2,43 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-25); 4,50 (1H, dd, J = 4,5, 13,5 Hz, Ha-27); 3,75 (1H,
d, J = 13,5 Hz, Hb-27) và 1,26 (3H, s, H-28). (* tín hiệu trùng lấp)
- Phổ cacbon 13
C-NMR (MeOD, 125 MHz) C: 205,9 (C-1), 127,8 (C-2),
146,3 (C-3), 33,3 (C-4), 61,7 (C-5), 64,8 (C-6), 37,4 (C-7), 34,3 (C-8), 50,0 (C-
9), 50,8 (C-10), 23,5 (C-11), 25,7 (C-12), 79,4 (C-13), 107,0 (C-14), 207,5 (C-
15), 56,2 (C-16), 80,1 (C-17),172,2 (C-18), 15,5 (C-19), 81,0 (C-20), 21,5 (C-
21), 77,0 (C-22), 33,0 (C-23), 31,1 (C-24), 50,8 (C-25), 166,7 (C-26), 60,7 (C-
27) và 26,5 (C-28).
41

Assignment, Essay
CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ
4.1. Xác định cấu trúc hợp chất 1
Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 1
Phổ proton 1
H-NMR của hợp chất 1 xuất hiện 3 tín hiệu proton olefin tại
5,91 (1H, dd, J = 2,0, 10.0 Hz); 6,78 (1H, ddd, J = 2,5, 5.0, 10,0 Hz) và 5,58 (1H, d,
J = 6,5 Hz); 3 tín hiệu nhóm methyl tại 1,26 (s), 1,30 (s) và 1,95 (s). Phổ cacbon
13C-NMR và HSQC cho phép xác định tín hiệu của 28 tín hiệu cacbon với 10 tín
hiệu cacbon không liên kết với hydro C (4 tín hiệu nhóm cacbonyl tại 205,7, 208,1,
172,3 và 166,7; 1 tín hiệu cacbon olefin 134,0; 4 tín hiệu cacbon liên kết với oxi tại
107,5, 81,0, 80,3, 79,7); 10 tín hiệu cacbon metin CH (3 tín hiệu cacbon olefin tại
146,2, 127,4, 124,5; 1 tín hiệu cacbon oximetin tại 76,9); 5 tín hiệu cacbon metylen
CH2 (1 tín hiệu cacbon oxymetylen tại 60,7) và 3 tín hiệu nhóm metyl CH3 tại
26,5, 21,5 và 17,9. Các số liệu cho thấy đây là 1 hợp chất dạng secosteroit (còn gọi
là các chất dạng physalin). So sánh số liệu phổ của hợp chất 1 với số liệu phổ của
hợp chất physalin B [10] thấy khá phù hợp (Bảng 4.1). Sự sai khác xảy ra
42

Assignment, Essay
là do dung môi đo phổ khác nhau, CDCl3 của 1 so với DMSO của hợp chất
physalin B. Các vị trí liên kết được khẳng định lại dựa vào tương tác HMBC
(Hình 4.1.1). Từ c ác bằng chứng phổ nêu trên có thể khẳng định hợp chất 1
chính là physalin B, 1 hợp chất có thành phần chính trong cây tầm bóp.
H của hợp chất 1
43

C của hợp chất 1
Hình 4.1.4: Phổ HSQC của hợp chất 1
44

Assignment, Essay
Hình 4.1.5: Phổ HMBC của hợp chất 1
Bảng 4.1: Số liệu phổ của hợp chất 1 và chất tham khảo
No, δC
d
δCa,b DEPT δH
a,c
(mult,, J in Hz) HMBC
1 202,6 205,7 CO
2 127,1 127,4 CH 5,91 (dd, 2,0, 10,0) 4, 10
3 146,4 146,2 CH 6,78 (ddd, 2,5, 5,0, 10,0) 1, 5
4 32,5 32,7 CH2 2,86 (d, 4,5)/ 3.27*
5 135.8 134.0 C
6 123.6 124.5 CH 5.58 (d, 6.5) 7, 8
7 24,6 24,2 CH2 2,19* /2,37 (m)
8 40,3 40,0 CH 2,20*
9 33,3 33,2 CH 2,92 (m) 11, 12
45

Assignment, Essay
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
52,2 52,7 C
24,6 24,8 CH2 1,22*/2,03 (d, 2,0)
25,7 25,8 CH2 1,60 /2,40 (m)
78,4 79,7 C
106,5 107,5 C
209,6 208,1 CO
54,4 56,4 CH 2,22 (br s) 14, 15
80,9 80,3 C
172,0 172,3 CO
17,0 17,9 CH3 1,22 (s) 1, 5, 9, 10
80,5 81,0 C
21,9 21,5 CH3 1,97 (s) 17, 20, 22
76,5 76,9 CH 4,55 (d, 2,0) 17, 20, 25, 26
31,6 33,1 CH2 2,04 (m)
30,7 31,1 C
49,6 51,0 CH 2,45 (d, 4,0)
167,5 166,7 CO
60,8 60,7 CH2 3,79 (d, 13,5)/ 4,51 (dd, 4,5, 13,5) 14, 25
24,6 26,5 CH3 1,27 (s) 16, 23, 24,
25,26
Đo trong a)
CDCl3, b)
125 MHz, c)
500 MHz, * tín hiệu bị trùng lấp;
46

Assignment, Essay
4.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2
Chất tham khảo
Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 2
Phổ 1
H-NMR, 13
C-NMR và HSQC của 2 cho thấy đây cũng là 1 hợp chất
dạng secosteroid (Bảng 4.2). So sánh số liệu phổ của 1 và 2 thấy sự khác nhau chủ
yếu xảy ra ở vị trí C-5 và C-6. Sự chuyển dịch về phía trường mạnh của 2 tín hiệu
C-5 (61,7) và C-6 (64,8) cho thấy nối đôi ở vị trí C-5 và C-6 của chất 1 đã chuyển
hóa thành cầu epoxy trong chất 2. Các vị trí liên kết được khẳng định lại bằng phổ
HMBC. Từ bằng chứng phổ trên, có thể khẳng định hợp chất 2 là physalin F, 1 hợp
chất đã được phân lập từ loài này [17]. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là lần đầu
tiên số liệu phổ đầy đủ của hợp chất physalin F được công bố.
47

H của hợp chất 2
C của hợp chất 2
48

Hình 4.2.4: Phổ HSQC của hợp chất 2
Hình 4.2.5: Phổ HMBC của hợp chất 2
49

Assignment, Essay
Bảng 4.2: Số liệu phổ của hợp chất 2 và chất tham khảo
No, δC
d
δCa,b DEPT δH
a,c
(mult,, J in Hz) HMBC
1 204,3 205,9 CO
2 127,1 127,8 CH 6,01 (dd, 2,5, 10,0) 4, 10
3 142,8 146,3 CH 6,68 (ddd, 2,5, 5,0, 10,0) 1, 5
4 35,1 33,3 CH2 2,24*/ 3,00 (dt, 3,0, 15,5)
5 76,3 61,7 C
6 72,5 64,8 CH 3,26 (d, 3,0) 7, 8
7 26,6 37,4 CH2 1,85 (dd, 11,5, 15,5)/
2,57 (dt, 3,5, 15,5)
8 38,2 34,3 CH 2,26*
9 29,8 50,0 CH 2,63 (dd, 9,5, 11,5) 11, 12
10 53,4 50,8 C
11 24,7 23,5 CH2 1,17 (dd, 10,0, 15,0)/ 2,26 *
12 25,7 25,7 CH2 1,52 (dd, 12,0, 17,0)/
2,34 (dd, 5,5, 17,0)
13 78,5 79,4 C
14 106,8 107,0 C
15 209,8 207,5 CO
16 53,8 56,2 CH 2,19*
17 80,4 80,1 C
18 171,8 172,2 CO
19 13,2 15,5 CH3 1,30 (s) 1, 5, 9, 10
20 80,6 81,0 C
21 21,6 21,5 CH3 1,95 (s) 17, 20, 22
22 76,3 77,0 CH 4,53 (d, 2,0) 17, 20, 24
23 31,2 33,0 CH2 2,01 (br s)/ 2,05 (d, 3,5)
24 30,4 31,1 C
50

Assignment, Essay
25 49,3 50,8 CH 2,43(d, 4,0)
26 167,3 166,7 CO
27 60,4 60,7 CH2 3,75(d, 13,5)/ 4,50 (dd, 4,5, 13,5) 25
28 24,4 26,5 CH3 1,26(s) 16, 23, 24, 25
Đo trong a)
CDCl3, b)
125 MHz, c)
500 MHz, * tín hiệu bị trùng lấp;
Nghiên cứu của Hsu và cộng sự chứng minh rằng physalin B có hoạt tính
với các dòng tế bào u ác tính A375 và A2058 (IC50 thấp hơn 4,6 µg/mL). Các
kết qủa cho thấy physalin B có thể gây chết tế bào ung thư theo chương trình
qua con đường trung gian NOXA, caspase-3 và mitochondria, nhưng không
gây ra chết theo chương trình với các tế bào nguyên sợi da người và các tế bào
myoblast. Do đó, physalin B có triển vọng để phát triển thành chất điều trị
hiệu quả u ác tính.
Hợp chất Physalin F (1 chất secosteroid) cũng được ghi nhận như 1 chất có
thể đóng vai trò là tác nhân ngăn ngừa và/hoặc điều trị ung thư bởi cơ chế kích
hoạt chết theo chương trình thông qua sự hoạt động theo con đường caspase-3
và c-myc trong tế bào T-47D. Trước đấy, năm 2012, Wu và cộng sự cũng đã
thông báo khả năng gây ra chết theo chương trình với dòng tế bào ung thư
thận người A498. Do đó, physalin F giống như 1 tác nhân kháng ung thư tiềm
năng cần tiến hành nghiên cứu lâm sàng.
51

Assignment, Essay
KẾT LUẬN
- Đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 02 hợp chất từ phân
đoạn điclometan của cây Tầm bóp
Physalin F
Physalin B
- Cấu trúc của các hợp chất này được xác định nhờ vào các phương pháp
phổ hiện đại như cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1
H-NMR (500 MHz), 13
C-
NMR (125 MHz), DEPT135, DEPT90), hai chiều (HSQC và HMBC), MS kết
hợp với so sánh tài liệu tham khảo.
Dựa vào những ứng dụng thực tiễn, hoạt tính của các lớp chất có trong
loài này và kết quả các phân đoạn nghiên cứu tôi mong muốn sẽ có những
nghiên cứu sâu hơn về cây tầm bóp
52

Assignment, Essay
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Tiến Bân, (2003), “Danh mục các loài thực vật Việt Nam”, Nxb Nông
nghiệp Hà Nội, tập 2.
2. Võ Văn Chi(1997), “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Y học .
3. Bùi Xuân Chương, Đỗ Bích Huy, Đặng Quang Trung, , Nguyễn Thượng Dong,
Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn,
Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn (2004) , “cây thuốc và động vật làm
thuốc ở Việt Nam”, Tập I, Nhà xuất bản Khoa học và Công nghệ Hà Nội, 875-876
4. Bùi Xuân Chương, Đỗ Bích Huy, Đặng Quang Trung, , Nguyễn Thượng Dong,
Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn,
Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn (2004), “Cây thuốc và động vật làm
thuốc ở Việt Nam”, Tập II, Nhà xuất bản Khoa học và Công nghệ Hà Nội.
Tiếng Anh
5. American Journal of Chinese Medicine 20-1992.
6. F. Abe, S. Nagafuji, M. Okawa, J. Kinjo, (2006) Chem. Pharm. Bull., 54, 1226.
7. A. A. Augustine, O. Ufuoma, Planta Med (2013), 79, PJ5.
8. A. G. Damu, P.-C. Kuo, C.-R. Su, T.-H. Kuo, T.-H. Chen, K. F. Bastow, K.-
H. Lee, T.-S. Wu, J. Nat. Prod. 2007, 70, 1146.
9. H. Ding, Z. Hu, L. Yu, Z. Ma, X. Ma, Z. Chen, D. Wang, X. Zhao, Steroids
2014, 86, 32.
53

Assignment, Essay
10. A.H. Januário, E.R. Filho, R.C.L.R. Pietro, S. Kashima, D.N. Sato, S.C.
França, (2002) “Antimycobacterial physalins from Physalis angulata L.
(Solanaceae)” Phytotherapy Research, 16, 445-448
11. Q.P. He, L. Ma, J.-Y. Luo, F.-Y. He, L.-G. Lou, L.-H. Hu (2007), “In vitro
antimycobacterial activities of Physalis angulata L.”, Chem. Biodiversity, 4, 443.
12. Murad Ali Khan, Haroon Khan, Sarwar Khan, Tahira Mahmood, Pir
Mohammad Khan & Abdul (June 2009), “Anti-inflammatory, analgesic and
antipyretic activities of Physalis minima Linn”, Journal of Enzyme Inhibition
and Medicinal Chemistry, 632–637.
13. N. Ismail, M. Alam, (2001), “Fitoterapia”, 72, 676.
14. X. Li, C. Zhang, W. Li, D. Wu, L. Tang, Y. Xin, (2013) “Fitoterapia” , 87, 43.
15. Md. Moniruzzaman, Shambhunath Bose, Young-Mi Kim, Young-Won Chin,
Jungsook Cho , (2016) , “ The ethyl acetate fraction from Physalis alkekengi
inhibits LPS-induced pro-inflammatory mediators in BV2 cells and
inflammatory pain in mice”, Journal of Ethnopharmacology , JEP9934.
16. Kheng Leong Ooi, Tengku Sifzizul Tengku Muhammad, Shaida Fariza
Sulaiman, (2013), “Physalin F from Physalis minima L. triggers apoptosis-based
cytotoxic mechanism in T-47D cells through the activation caspase-3- and c-
myc-dependent pathways”, Journal of Ethnopharmacology 150, 382–388.
17. R. C. L. R. Pierro, S. Kashima', D. N. Sato, A. H. januario', S. C. Franca,
Phytomedicine (2002) , Antimycobacterial Physalins from Physalis angulata L.
(Solanaceae),Vol. 7(4), pp. 335-338.
54

Assignment, Essay
18. L.R. Row, N.S. Sarma, K.S. Reddy, T. Matsuura, R. Nakashima, (1978)
“The structure of Physalins F and J from Physalis angulata and P. lancifolia”
Phytochemistry, Vol 17, 1647-1650
19. H U Vaghasiya, Daya L Chothani( December 2012), “A phyto-
pharmacological overview on Physalis minima Linn”, Indian Journal of Natural
Products and Resources Vol. 3(4), pp. 477-482.
20. Wen-Na Zhang, Wang-Yu Tong (2016), “Chemical Constituents and
Biological Activities of Plants from the Genus Physalis”, Chem. Biodiversity, 13,
48 – 65.
55

Khóa luận tốt nghiệp đại học Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây Tầm bóp (Physalis angulata)

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Khóa luận tốt nghiệp đại học Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây Tầm bóp (Physalis angulata)

Similar to Khóa luận tốt nghiệp đại học Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây Tầm bóp (Physalis angulata) (20)

More from lamluanvan.net Viết thuê luận văn

More from lamluanvan.net Viết thuê luận văn (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (6)

Khóa luận tốt nghiệp đại học Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn điclometan của cây Tầm bóp (Physalis angulata)