とある勉強会で当社の紹介と新しく始めるサービスについて少し話した時のスライドです。

1. 環境DNA分析の普及に向けて
半田 佳宏、中野†江一郎
(株式会社 生物技研)
2018年9月8日
水源地環境センター会議室
半蔵門勉強会

2. 生物技研はどんな会社？
設立：2015年12月4日
場所：神奈川県厚木市
業務内容：
・DNA解析サービス
- 菌叢解析(マイクロバイオーム解析)
- ゲノム解析
- 遺伝子発現解析
- ジェノタイピングシーケンシングなど
・DNA解析技術のコンサルティング
・Webページの作成
次世代シーケンサー MiSeq
(5000万配列,15０億塩基, 56時間)
次世代シーケンサー NextSeq 500
(8億配列, 120０億塩基, 29時間)

3. もともとは微生物を調べる会社
菌叢解析
(腸内細菌・土壌細菌)
16S rRNA
ライブラリー作製
↓
シーケンシング解析
↓
データ解析

4. もともとは微生物を調べる会社
菌叢解析
(腸内細菌・土壌細菌)
16S rRNA
環境DNA解析
(魚類)
12S rRNA
ライブラリー作製
↓
シーケンシング解析
↓
データ解析
環境DNA解析に
すぐ対応

5. (2016年3月) MiFishを使用した環境DNA分析
(2017年2月) 種特異的分析 (開始時: 数種 → 現在: 28種)
(2017年後期) gInsect(節足動物)やgSalamander(有尾類)、gFrog
(無尾類)、gClam(二枚貝)などのプライマーを開発
(2018年4月) 水生昆虫のDNAデータベースの整備
(2018年9月) 遺伝的多様性分析
(2018年9月) 人工核酸標準物質を用いた網羅的解析の定量化
環境DNA分析サービスの流れ

6. 水生昆虫のDNAデータベースの整備

7. 豊平川＠神奈川県 (河川水) 海の公園＠神奈川県 (海水)
gInsectを使用した節足動物相の解析
魚類と比較して、節足動物DNA配列
データベースは整備されていない。

8.
概要 配列数
生リード
3.8M
(平均100k
配列/サンプル)
97% OTU配列数
(生物種数)
939
配列
相同性
の結果
一致配列
(相同性95%以上)
163
未登録配列
(相同性95%以下)
349
非特異的配列
(ノーヒット)
427
環境中から未知のDNA配列を取得する
26地点38サンプルの
河川水及び海水

9. 未登録配列の系統推定
今後、さらに多くのサンプル地点
の解析を行うことで、節足動物
DNA配列を充実させる予定

10. イワナの遺伝的多様性分析

11. 遺伝的多様性とは？
同じ生物種(集団)におけるDNAレベルの違い。
見た目では判断できず、これまで遺伝的多様性を
解析するのは困難であった。
日本のイワナはミトコンドリアDNAタイプ
から32種類に分けられる。
(Yamamoto et al., 2008)
集団A
集団B
集団C
集団D
集団E
集団F

12. イワナの遺伝的多様性解析 ー方法ー
滋賀県水産試験場・亀甲博士と菅原博士との共同研究
試験場で養殖しているイワナはどこの集団？
・環境DNA解析
→試験場の水 (mtDNAコントロール領域)
・サンガー法による配列決定 (従来の方法)
→養殖イワナ個体(48匹)のヒレ

13. イワナの遺伝的多様性解析 ー結果ー
9/29 環境DNA学会 ポスター発表
集団名
(ハプロタイプ名)
地域
Hap73 養殖
Hap7/10 埼玉・栃木/新潟
Hap19 滋賀・栃木
Hap74 養殖
Hap14 奈良・富山

14. イワナの遺伝的多様性解析 ー結果ー
集団名
(ハプロタイプ名)
地域 出現回数 (48匹)
Hap73 養殖 28 (58.3%)
Hap7/10 埼玉・栃木/新潟 11 (22.9%)
Hap19 滋賀・栃木 8 (16.7%)
Hap74 養殖 1 (2.1%)
Hap14 奈良・富山 0 (0.0%)
遺伝的多様性を調べる上で、
環境DNA分析は非常に強力な
ツールである。

15. 人工核酸標準物質を用いた
網羅的解析の定量化

16. 引用：
https://www.aist.go.jp/aist_j/
p r e s s _ r e l e a s e / p r 2 0 1 6 /
pr20161214/pr20161214.html
産業技術総合研究所
先進バイオ計測研究グループ
関口 勇地 博士
産総研プレスリリース(2016.12.14)

17. これまでの網羅的解析の問題点
種名
リード数
地点A 地点B 地点C
アユ 1,000 100 0
カジカ 0 200 0
ウナギ 10 0 200
コイ 500 300 100
環境DNA溶液に含まれるPCR阻害物質の影響により、
サンプル間の比較は困難であった。
また、絶対定量できず、相対定量しかできなかった。
DNA
(各生物のDNA数は未定)
↓
ライブラリー作製
↓
シーケンシング解析
↓
データ解析
(各生物のリード数が決定)

18. 人工核酸標準物質とは？
※産業技術総合研究所が特許を持っている配列
MiFish領域 人工的に合成した領域※
(地球上無二のDNA配列)
500 コピー/反応
250 コピー/反応
20 コピー/反応
サンプルDNA
(各生物のDNA数は未定)
:
サンプルDNA
＋
人工核酸標準物質
↓
ライブラリー作製
↓
シーケンシング解析
↓
データ解析
各生物由来DNAを定量するために、標準となる人工的に合成した核酸(DNA)

19. 網羅的解析の定量化
種名
リード数
地点A 地点B 地点C
500コピー 1,000 500 50
２50コピー 500 250 25
２0コピー ４0 ２0 ２
アユ 1,000 100 0
カジカ 0 200 0
ウナギ 10 0 200
コイ
(コピー数)
500
(250)
300
(300)
100
(1,000)
反応阻害
コピー数
(サンプルに含まれた
DNAの数)
リード数
(NGSから出力
された配列数)
人工核酸標準物質を使用
することで、各魚類DNA
数の絶対定量も可能
DNA数とリード数の関係式

20. (１) 水生昆虫のDNAデータベースの整備
→26地点の環境サンプルから349の未登録配列を取得し、
これら配列の系統を推定した。
(２) 遺伝的多様性分析
→滋賀県水産試験場で養殖されているイワナが5集団である
ことを明らかにした。
(３) 人工核酸標準物質を用いた網羅的解析の定量化
→人工核酸標準物質の有効性をご紹介した。
まとめ
今後もお客様のご要望を聴きながら、
環境DNA分析の普及に向けて邁進します。

21. ご清聴ありがとうございました。
ご不明な点やお困りな点などありましたら、
以下のアドレスまでご連絡下さい。
E-mail: dna@gikenbio.com