Guía validación uv vis, fluo y aa versión 2019

Universidad de Buenos Aires
Facultad de Farmacia y Bioquímica
QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL
GUÍA DE ESPECTROSCOPIAS Y
VALIDACIÓN
AÑO 2019
AUTORES
Dra. Gisela Alvarez
Dra. Inés Alvarez Echazú
Bioq. Jessica Bertinatto
Dr. Paolo Catalano
Dra. María Lucía Foglia
Dr. Joaquín González
Dra. Silvia Iglesias
Dra. Andrea Mebert
Dr. Pablo Santo Orihuela
Dra. María Victoria Tuttolomondo
Dra. María Emilia Villanueva
Dr. Guillermo Copello
Dr. Sergio Giorgieri
Dr. Martín Desimone

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Índice
Introducción 4
Calibración, calificación y validación 7
Fases de una validación 11
Parámetros analíticos
Especificidad y selectividad 14
Linealidad 15
Exactitud 16
Precisión 16
Robustez 19
Sensibilidad 19
Límite de detección 20
Límite de cuantificación 22
Conclusiones 22
Problemas de aplicación 23
Anexo 25
Bibliografía 25

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VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
INTRODUCCIÓN
Antes de comenzar con el tema de esta guía “Validación de Métodos Analíticos” es
necesario definir algunos términos.
Para que un producto farmacéutico (comprimidos, cápsulas, suspensiones, etc.) pueda
liberarse para su venta, debe cumplir con una serie de requisitos. A través de ensayos
químicos, físicos y microbiológicos se comprueba si el producto cumple o no con los requisitos
establecidos.
Ahora vamos a definir Método Analítico:
Método Analítico: conjunto de ensayos necesarios para efectuar el análisis completo de una
sustancia.
Existen 3 tipos fundamentales de ensayos:
➢ Ensayos de identificación, para verificar la presencia de un compuesto en particular
contrastando con un patrón del mismo.
➢ Ensayos de pureza, se verifica la presencia del compuesto de interés y los posibles
contaminantes o excipientes que pueden estar presentes en la muestra.
➢ Ensayos de cuantificación, a través del cual verificamos que la concentración del
principio activo en la forma farmacéutica en ensayo (es decir, comprimidos, cápsulas,
suspensiones, etc.) sea la correcta.
Existen cuatro tipos fundamentales de Métodos Analíticos según su calidad:
➢ Métodos estándar (de referencia): son los de mayor calidad analítica. Son desarrollados
por organizaciones de prestigio y están rigurosamente validados (Standard Methods:
ASTM, AOAC).
➢ Métodos oficiales: son de uso exigido por organismos gubernamentales y satisfacen
regulaciones estatales. Los mismos han sido previamente validados (Official Methods:
EPA, NIOSH)
➢ Métodos de revistas científicas: (Literature Methods) deben usarse con suma precaución y
con previa validación.
➢ Métodos del propio laboratorio: (In-house Developed Methods) para su uso adecuado
deben estar perfectamente documentados y ser previamente validados.

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¿QUE SE VALIDA?
Podemos validar:
➢ Métodos Analíticos
➢ Métodos de control de limpieza
➢ Equipos e instalaciones
➢ Procesos
➢ Programas de computación
➢ Personal
VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
DEFINICIÓN:
Validar es el proceso de verificar que un método es adecuado para el objetivo para el que fue
diseñado, es decir, para resolver un problema analítico particular.
Aplicando esta definición a nuestro campo profesional podemos decir: “Se llama validación
a la obtención de pruebas (convenientemente documentadas) que demuestran que un método de
fabricación o un método de análisis es lo suficientemente confiable como para producir el
resultado previsto dentro de intervalos definidos.
Si bien los conceptos y términos que vamos a describir son de aplicación general están
dirigidos principalmente hacia los métodos analíticos de tipo químico e instrumental de uso
común en los laboratorios farmacéuticos.
Se podría validar todos los ensayos que conforman un método de análisis o podemos validar
solamente algunos ensayos de ese método de análisis. Por ejemplo, si el método de análisis de
un determinado producto consta de: ensayo de identificación, ensayo de disolución, ensayo de
determinación de impurezas y el ensayo de valoración, podemos validar cada uno de ellos con
lo que estaríamos validando el método de análisis completo o sino podemos validar solo el
ensayo de valoración.
¿POR QUÉ ES NECESARIO VALIDAR?
La validación es necesaria porque:
➢ Proporciona un alto grado de confianza y seguridad en el método analítico y en la
calidad de los resultados. Por ejemplo al validar el ensayo de valoración (es decir el

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ensayo que nos permite cuantificar la cantidad de principio activo que tiene por ejemplo
un comprimido) nos aseguramos que la técnica aplicada para cuantificar es confiable y
sirve para tal fin esto significa que si el contenido de principio activo en el comprimido
nos da por debajo de la especificación podemos decir que no es por que utilizamos una
técnica no confiable ya que fue previamente validada sino porque el comprimido
contiene menos principio activo del que debe contener. En cambio si no hubiéramos
validado la técnica el motivo de obtener resultados bajos en una valoración puede ser
porque el comprimido tenga menos droga de la que dice contener o que la técnica no es
la adecuada para valorar ese principio activo o droga. Pero al emplear una técnica
validada nos aseguramos de que esa técnica sirve para tal fin.
➢ Permite un conocimiento profundo de las características del método analítico
➢ Genera una disminución del número de errores y repeticiones con el consiguiente
ahorro de costos involucrados
➢ Facilita el cumplimiento de los plazos previstos de análisis
FARMACOPEAS:
“La Farmacopea es el texto oficial que codifica los principios activos, excipientes y
productos farmacéuticos y contiene las especificaciones que éstos deben cumplir para
demostrar su calidad y resguardar la salud de la población” (definición extraída de la
Farmacopea Argentina Séptima Edición Volumen I).
Los métodos descriptos en monografías de Farmacopeas u otros textos oficiales se
consideran validados. Hay que aclarar que ello se refiere solamente a métodos generales y a
materias prima. En cuanto a productos terminados (es decir la forma farmacéutica que se
vende en el mercado), puesto que los excipientes serán diferentes para cada fabricante, habrá
que proceder en cada caso a la validación del método analítico.
TIPOS DE VALIDACIÓN:
➢ Validación Prospectiva: para métodos nuevos.
➢ Validación Retrospectiva: para métodos repetidamente utilizados no validados
anteriormente y de los que se tiene documentación suficiente para probar la bondad del método.
➢ Revalidación: Repetición parcial o total de una validación debido a cambios efectuados
que pueden afectar la bondad del método validado.

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CALIBRACIÓN, CALIFICACIÓN Y VALIDACIÓN:
Tanto Calibrar, como calificar, así como validar son procesos meramente documentales.
Son procesos mediante los cuales se preparan documentos que certifiquen que la medición o
resultado que se va a obtener va a ser correcta o mejor dicho que va a estar “BAJO
CONTROL”.
¿Por qué “BAJO CONTROL”?
Porque, por ejemplo, si conocemos el error de un termómetro y realizamos una medición
que luego corregimos con un factor de corrección; se da el caso de que, si bien el valor
observado en el termómetro no es correcto, podemos corregirlo para obtener el resultado real,
lo cual significa que tenemos esa medición “BAJO CONTROL” ya que podemos corregir el
valor leído para que el resultado sea el correcto.
Calibrar:
Solo se aplica la calibración a instrumentos de medida. NO se calibran equipos y NO se
calibran sistemas.
Calibrar es dejar evidencia documentada de que un instrumento mide de a acuerdo a los
estándares de medida de la unidad de ese instrumento. Cuando un instrumento es calibrado su
unidad de medida se verifica y/o corrige frente a un estándar o patrón. Esto permite que todos
mis instrumentos muestren una medida real y no arbitraria según el instrumento utilizado.
● Si dos farmacéuticos nos miden la tensión arterial con dos tensiómetros de los cuales
solo uno esta calibrado obtendríamos dos mediciones distintas pero solo una de ellas
sería la real.
● De qué serviría una regla si midiera distinta al resto de las reglas del mundo.
Todo instrumento de medida debe estar referido a un estándar certificado para que esa
medición tenga valor y sea reproducible por otros instrumentos distintos. Solo entonces
están calibrados.
Ejemplos de instrumentos de medida a calibrar: timers, termómetros
Calificar:
Solo se aplica la Calificación a Equipos o Maquinarias. NO se califica un sistema.
Calificar es dejar evidencia documentada de que el equipo se encuentra instalado, operando
y desempeñándose de acuerdo a lo establecido por el fabricante y/o usuario del equipo.
Obsérvese que la calificación consta de tres etapas. Una de ellas habla de instalación, otra de
operación y la última de desempeño o performance.
Calibración, Calificación y Validación son conceptos que, ERRONEAMENTE
suelen emplearse de forma indistinta, sin embargo son diferentes.

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Etapas de la Calificación de Equipos (EQ)
Se podrá calificar un equipo solamente si sus instrumentos de medida y los instrumentos
utilizados para probarlo o instalarlo están previamente calibrados. Es imposible que un equipo
funcione adecuadamente y si sus instrumentos de medida están descalibrados o si por instalarlo
con equipos descalibrados lo instalamos de modo inadecuado.
Ejemplo: etapas de calificación de un cromatógrafo de gases (EQ)
Calificación de Instalación (IQ): los suministros de gas y de alimentación deben estar
accesibles y en condiciones en el laboratorio
Calificación de Performance (PQ): verifica que el equipo funciona en el entorno
operativo.
Calificación de Instalación (IQ): comprueba la correcta instalación del equipo
de acuerdo con las especificaciones de diseño o las instrucciones del proveedor.
Calificación Operacional (OQ): comprueba que lo solicitado y crítico para la
calidad funcional del equipo opera según lo previsto.
Calificación de Performance (PQ): verifica que el equipo funciona en el
entorno operativo.
Reporte de Calificación (QR): resume los resultados y los desvíos de las
actividades de calificación y define el estado de calificación del equipo

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Calificación Operacional (OQ): Verificación funcionamiento del detector (FID; TCD; etc),
Realización de pruebas de fuga de gases
Calificación de Performance (PQ): análisis de estándar y muestra

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Reporte de Calificación (QR): Describe los pasos realizados durante las calificaciones de
Instalación, de Operación y de Performance con sus respectivos resultados en forma escrita.
Esta documentación debe ser guardada para posteriores consultas y auditorías.
Validar es verificar documentalmente que un método o proceso hace lo que tiene que hacer
y que este resultado puede repetirse tantas veces como se desee en las condiciones adecuadas
de trabajo. Estas condiciones adecuadas de trabajo también serán estipuladas en la validación
ya que dentro de la validación se contempla las situaciones más adversas posibles.
Queda claro entonces que para poder realizar una validación debemos primero realizar pasos
previos tales como la CALIBRACIÓN de los instrumentos de medida y CALIFICACIÓN de
los equipos que se utilicen en esa técnica analítica.
Entonces, no se podrá nunca realizar una validación de una técnica analítica si previamente
no se calibran los instrumentos, esto es, termómetros, material de vidrio, y demás instrumentos
que sean componentes de algún equipo de control de calidad que vaya a ser utilizado para la
técnica en cuestión.
Tampoco se podrá realizar la validación sin el paso siguiente que es la calificación de
aquellos equipos que se utilicen para esa técnica analítica, esto es, HPLC, fluorómetro,
espectrofotómetro.

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FASES EN QUE CONSTA UNA VALIDACIÓN
PROTOCOLO DE
VALIDACIÓN
REALIZACIÓN DE LA
VALIDACIÓN
EVALUACIÓN DE LOS
RESULTADOS
ANALÍTICOS
INFORMES
TÉCNICOS

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CERTIFICADO DE
VALIDACIÓN
PROTOCOLO DE VALIDACIÓN
El primer paso es redactar el “Protocolo de Validación” que consiste en un plan
experimental diseñado para que brindar una evidencia de que el sistema ha sido validado.
El protocolo debe incluir una definición del sistema a validar e identificar los
parámetros a validar, el procedimiento y sus especificaciones es decir, sus límites de
aceptación.
El protocolo debe ser firmado y fechado por las personas responsables de la validación
y de su aprobación.
REALIZACIÓN DE LA VALIDACIÓN Y EVALUACIÓN DE LOS
RESULTADOS ANALÍTICOS
Todos los datos deben ser archivados en los cuadernos de laboratorios. Una vez
realizada la validación, se evaluarán los resultados obtenidos y si difieren de los esperados se
agregará un anexo explicando los cambio introducidos respecto al protocolo original y las
razones que lo justifican.
INFORMES TÉCNICOS
El informe técnico debe incluir:
➢ La descripción por escrito del procedimiento para la determinación de cada uno de los
parámetros a evaluar.
➢ Los resultados de las determinaciones de cada parámetro incluyendo esquemas, copias
originales de los espectros, cromatogramas, curvas de valoración, etc.

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➢ Conclusiones: se indicará la aceptación o no de la validación del método analítico.
También se puede aceptar un método analítico con limitaciones para un tipo de muestras
concreto.
CERTIFICADO DE LA VALIDACIÓN
Documento formal de aprobación firmado por las personas responsables. Los documentos
referentes a la validación se archivarán adecuadamente durante todo el tiempo de vida del
producto.
REVALIDACIÓN:
La revalidación de un método analítico puede realizarse por dos motivos:
✓ Cuando se ha introducido un cambio significativo en las condiciones originales en
las que se ha realizado la validación, como puede ser:
● Modificaciones en los aparatos o materiales utilizados: fase
estacionaria, fases móviles o detectores en HPLC; tipos de placas en
cromatografías en capa delgada.
● Modificaciones en la muestra problema: cambios cualitativos o
cuantitativos de excipientes en productos terminados, variación de
proceso de síntesis de materia prima, etc.
● Modificaciones en la técnica analítica; condiciones de extracción,
tiempo y temperatura de reacción.
El grado de revalidación requerido dependerá de la importancia de la modificación y
del criterio del analista.
✓ Cuando el método analítico lleva largo tiempo utilizándose, la revalidación
demostrará que el laboratorio sigue dando resultados confiables cuando analiza el
producto. En este caso puede utilizarse como un método retrospectivo.
¿CÓMO SE VALIDA UN MÉTODO?:
Como lo indica su definición la validación de un método implica la evaluación de una
serie de parámetros analíticos.

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✓ Especificidad
✓ Selectividad
✓ Linealidad
✓ Exactitud
✓ Repetibilidad
✓ Precisión intermedia
✓ Robustez
✓ Límites de detección y cuantificación del principio activo
Antes de la realización de cada ensayo correspondiente a la validación de una metodología
analítica, se debe realizar un test de adecuación. Por ejemplo en el caso que la técnica analítica
a validar sea un ensayo de valoración por la técnica de HPLC, el test de adecuación se realiza
de la siguiente manera:
Procedimiento:
a) Se corre una solución diluida de peróxido de hidrógeno para determinar el tiempo
muerto y así corroborar que todas las sustancias son retenidas es decir que ninguna sale al
tiempo muerto.
b) Se prepara una solución testigo de la sustancia a analizar según las especificaciones de
la técnica y se realizan 5 corridas, para así determinar:
❑ Asimetría
❑ Precisión
❑ Platos teóricos
❑ Resolución (en el caso que se trabaje con más de un principio activo.)
1. ESPECIFICIDAD Y SELECTIVIDAD:
Con este parámetro se evalúan las posibles interferencias.
➢ Algunos autores diferencian ambos términos y consideran la Selectividad como la
capacidad de detectar en forma exclusiva al analito en la muestra en presencia de otros
componentes que se espera puedan estar presentes como impurezas y productos de degradación
y las Especificidad como la capacidad de detectar el analito sin interferencias de ningún otro
compuesto.
En resumen, podríamos decir que cuando hablamos de Especificidad lo hacemos respecto
del Placebo,* es decir la capacidad de detectar el analito aunque existan otros compuestos
presente, y cuando hablamos de Selectividad lo hacemos respecto a los productos de
degradación e impurezas, es decir la capacidad de detectar el analito separado de los otros
componentes.
La selectividad de un método analítico denota el grado de ausencia de interferencias
debidas a otras especies contenidas en la matriz de la muestra. Las interferencias introducen un
error sistemático en el resultado. Pueden ser positivas (que causen un aumento de la señal) o
negativas (que causen una reducción de la señal).
*Nota: Definimos Placebo como: una preparación en la que se incluyen todos los
excipientes del producto terminado exceptuando al principio activo o analito.

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➢ Otros autores consideran equivalente los términos Selectividad y Especificidad y los
definen como la capacidad de un método analítico para medir exacta y específicamente el
analito, sin interferencias de impurezas, productos de degradación, compuestos
relacionados o excipientes que puedan estar presentes en la matriz de la muestra.
¿CÓMO SE DETERMINA?
Para determinar la Especificidad se mide una Solución preparada solo con el principio activo o
analito y otra Solución preparada solo con el Placebo y no se deben detectar interferencias y si
la hay ésta debe ser menor a un porcentaje límite especificado, es decir si estamos trabajando
con HPLC al tiempo de retención del principio activo no debe detectarse nada que no sea
principio activo.
La selectividad de un método analítico se investiga estudiando:
➢ La capacidad del mismo de medir el analito de interés en muestras sintéticas a las cuales
se les introducen deliberadamente determinados interferentes que se espera que puedan
estar presentes en la muestra a analizar (impurezas, sustancias relacionadas etc.) y se
compara la respuesta del método a dichas mezclas con respecto a soluciones que
contengan solamente el analito.
➢ Para estudiar la interferencia de productos de degradación del analito se lo somete a
condiciones de estrés suficientes para degradarlo en un 90 % como calor, luz, medios
ácidos o básicos, oxidantes, humedad, etc y se compara la respuesta del método (señal
en función de concentración), del producto de degradación con respecto a la del analito.
En el caso de haber señales que se deban a degradados éstos deben separarse bien del la
señal del analito en cuestión. Debe prepararse una solución blanco para cada
tratamiento, la cual se prepara con una alícuota de igual volumen de la muestra pero
empleando algún diluyente y no la muestra. Se debe someter a la Solución blanco al
mismo tratamiento de estrés al que es sometido la muestra.
➢ Otra manera de estudiar la selectividad es comparando la habilidad del método de medir
el analito en la muestra en comparación con otros métodos o técnicas. A la muestra se
le puede agregar deliberadamente productos de degradación o componentes que
comúnmente puedan estar presentes en la muestra. Cuando se compara con otros
métodos es conveniente que el método alternativo opere con principios
significativamente diferentes.
2. LINEALIDAD
Dentro de este término se incluye:
➢ La proporcionalidad entre concentración de analito y respuesta
➢ El intervalo o rango de concentraciones de analito para los cuales el método es
satisfactorio.
Se entiende como linealidad la capacidad de un método analítico de obtener resultados
linealmente proporcionales a la concentración de analito en la muestra, dentro de un intervalo
determinado.

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El ensayo de linealidad puede efectuarse tanto sobre soluciones patrón del analito, como
sobre muestras problema que contengan concentraciones crecientes de analito, efectuándose
posteriormente el tratamiento matemático de los resultados analíticos. Normalmente estos
cálculos se efectúan con programas de computación.
Las Fases de este ensayo son las siguientes:
➢ En primer lugar conviene asegurarse de que el sistema instrumental sea más amplio que el
intervalo de concentraciones a estudiar. Para ello puede efectuarse un tanteo previo con
unos cuantos patrones que abarque un intervalo de concentraciones a establecer (por
ejemplo 10 – 200 % del valor declarado). Si la sensibilidad es variable, es recomendable
efectuar el estudio de linealidad a dos niveles de concentración.
➢ Preparar una serie de patrones de analito de concentraciones crecientes. El número de
soluciones patrones puede estar comprendido entre 3 y 10 y el intervalo de concentraciones
se selecciona de acuerdo con las cantidades esperadas de analito en la muestra. Por
ejemplo:
✓ Valoración de una materia prima: Analizar entre 3 y 5 soluciones patrón en un
intervalo de concentraciones del 80 – 120 % de la teórica.
✓ Valoración de un principio activo en un producto terminado: Analizar entre 5 y 7
soluciones patrón con un intervalo de concentraciones del 50 – 150 % de la teórica.
✓ Si se supone que la concentración del analito puede variar ampliamente como ocurre
en los ensayos de impurezas o productos de descomposición, etc. las soluciones
patrones deberán abarcar todo el intervalo de concentraciones previsto (por ejemplo:
10 – 100 ppm para impurezas)
➢ El análisis se debe efectuar siguiendo exactamente el procedimiento descripto en la
Técnica Analítica. El ensayo se debe efectuar como mínimo por duplicado. En un
procedimiento cromatográfico se aconseja efectuar las inyecciones por triplicado.
➢ Determinar la curva de calibración que relaciona respuesta (áreas, alturas, absorbancia,
etc.) con concentración. Generalmente se halla la recta de regresión utilizando el método de los
cuadrados mínimos.
Si la recta no pasa por el origen de coordenadas el método a evaluar está afectado por un
error sistemático por defecto o por exceso. La ordenada al origen porcentual que se exige en
general es menor al 3 %.
➢ Tratamiento estadístico de los datos analíticos para evaluar la linealidad y la
proporcionalidad.
➢ Interpretación estadística de la regresión lineal: El coeficiente de regresión refleja el
grado de relación entre la variable X (concentración), Y (respuesta). Su valor máximo es 1 en
general se exige un coeficiente de regresión mayor o igual a 0.995.
3. EXACTITUD:

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La exactitud indica la capacidad del método analítico para dar resultados lo más próximos
posibles al valor verdadero. Si la diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero es
pequeña, la exactitud es buena. Una diferencia grande significa que la exactitud es inadecuada
y revela la existencia de errores sistemáticos o determinados que deberían corregirse.
No deben confundirse exactitud y precisión. La precisión está relacionada con la dispersión
de una serie de mediciones, pero no da ninguna indicación de lo cerca que están del valor
verdadero.
Podemos tener mediciones muy precisas pero poco exactas; sin embargo, para que un
método sea exacto se requiere un cierto grado de precisión
La exactitud de un método puede determinarse de cuatro formas:
➢ Se analiza un material de referencia (ver anexo) cuya concentración de analito se
conozca y se compara el valor medido con el real. Para ello se determina la media y la
desviación estándar de una serie de replicados y se los compara con el valor establecido del
material de referencia. El National Institute of Standards and Technology (NIST),
comercializa una amplia variedad de materiales estándar de referencia (SRMs) preparados
específicamente para la validación de métodos analíticos. Para la selección del material de
referencia apropiado es necesario tener en cuenta que la matriz del mismo sea lo más parecida
posible a la de las muestras que se van a analizar, y que la concentración del (de los) analito (s)
sea similar a la de las muestras a analizar. La desventaja de este método es que en muchas
ocasiones es difícil encontrar un material de referencia adecuado.
➢ Se comparan los resultados obtenidos por el método a validar con los obtenidos con
otro método alternativo bien caracterizado y cuya exactitud haya sido bien definida. En
muchas ocasiones es difícil disponer de dicho método alternativo.
➢ Se aplica el método analítico a muestras sintéticas preparadas con las sustancias que
conforman la matriz del material a analizar, blancos de muestra (ver anexo) a la cuales se le
agregan cantidades conocidas de analito en el rango de concentraciones del método. Este es el
método más utilizado siempre y cuando se puedan conseguir todos los componentes de la
matriz.
➢ Se agregan cantidades conocidas de analito a la muestra (adición de estándar). Esta
técnica se utiliza en caso de que sea imposible preparar blancos de muestra o placebos. La
muestra con el estándar adicionado se denomina material o solución fortificada. Las muestras
fortificadas se comparan con las mismas muestras sin fortificar. En este último caso la
exactitud se calcula como el porcentaje de recuperación:
Recuperación (%) = (4)
Dónde:
C1= concentración determinada en la muestra fortificada.
C2= concentración determinada en la muestra sin fortificar.

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C3= concentración de fortificación.
Es importante tomar la precaución de no agregar cantidades de analito a la muestra tal que la
concentración final alcanzada supere el rango de trabajo del método.
En todos los casos, un diseño habitual es evaluar la exactitud del método analítico en un
intervalo de 3 niveles de concentración del analito (por ejemplo: 80 %, 100 % y 120 % de la
concentración teórica) dentro del rango de linealidad. Para cada concentración se preparan 3
réplicas, haciendo un total de 9 muestras y cada muestra se analizan por triplicado.
Los límites de aceptación más empleados para evaluar la exactitud son: 98 – 102 % o 97 –
103 % del valor teórico con un CV % menor o igual a 2,0 %.
4. PRECISIÓN
Es el grado de concordancia entre un grupo de resultados obtenidos al aplicar
repetidamente (e independientemente) el mismo método analítico sobre una muestra
homogénea.
La precisión indica la capacidad del método para dar resultados semejantes cuando se
aplica repetidamente a una muestra.
Un estudio de precisión requiere la repetición del análisis sobre una muestra. La
precisión así obtenida se denomina “del método” puesto que incluye todo el método analítico,
desde la preparación de la muestra hasta la lectura instrumental.
La precisión mide el error aleatorio, o indeterminado, de un análisis. Matemáticamente
se expresa mediante la desviación estándar absoluta (σ ó SD), la desviación estándar relativa
(RSD) y el coeficiente de variación (CV).
(5) (6)
(7) (8)
El rigor en la definición de la precisión depende del número de réplicas (n) y de cómo
se obtiene el grupo de resultados.
Dentro del término precisión del método se puede distinguir tres tipos de estudios:
➢ Reproducibilidad: es cuando se realiza en un laboratorio distinto. La precisión se
expresa por la media para el valor central y la desviación estándar para la dispersión de los
resultados.
➢ Precisión intermedia: dispersión de resultados de ensayos mutuamente independientes
utilizando el mismo método aplicado a la misma muestra pero en diferentes condiciones: en

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condiciones diferentes es decir, diferentes analistas, aparatos, días, etc. En el mismo
laboratorio en que se hizo la Repetibilidad.
➢ Repetibilidad: dispersión de resultados de ensayos mutuamente independientes
utilizando el mismo método, efectuados en las mismas condiciones, por un mismo analista, en
el mismo laboratorio con los mismos equipos y reactivos y en el curso de la misma serie de
análisis en un intervalo corto de tiempo.
Las distintas definiciones de la precisión resaltan la independencia mutua de los ensayos, lo que
implica que se deben tomar n alícuotas, a cada una de las cuales se le realizan todas las
operaciones previas especificadas en el método, se realizan n mediciones y se obtienen así n
resultados independientes. Sin embargo en algunas ocasiones se estudia la precisión tomando
una alícuota a la que se le realizan las operaciones previas y posteriormente se realizan n
mediciones de la misma. En estas condiciones la precisión se está considerando con el mínimo
rigor y sólo se está teniendo en cuenta la variabilidad en la medición de la señal (además de la
introducción de la muestra en el instrumento).
La precisión de un método puede evaluarse ensayando un número suficiente de alícuotas
(seis a diez) de una muestra homogénea de manera de poder calcular estadísticamente la SD o
la RSD. Para que el estudio de la precisión sea significativo el mismo debe realizarse
utilizando la misma muestra y procedimientos de preparación que se utilizarán en el método a
validar.
Una manera de realizarla es preparar por sextuplicado muestras al 100 % de la
concentración de trabajo.
5. ROBUSTEZ
La robustez significa la resistencia de un método al cambio de respuesta cuando se
introducen pequeñas variaciones deliberadas a los parámetros del mismo como la
concentración de reactivos, pH, temperatura, modificaciones en la fase móvil, columna, flujo
etc.
Los estudios de robustez se efectúan durante el desarrollo del método. Se realizan
variaciones deliberadas en su procedimiento (Ej. concentración de reactivos, pH, temperatura,
instrumentos, analistas, etc.) y se estudia el efecto que tiene cada variable sobre su desempeño,
principalmente sobre su exactitud y precisión. Se trabaja con materiales de referencia,
muestras de composición conocida o materiales de referencia certificados. Se identifican
aquellas variables que afectan más al método asegurando que cuando el mismo sea usado, sean

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cuidadosamente controladas. Para ello en la redacción del método se especifican las etapas
críticas remarcando la necesidad de un estricto control de las mismas. Si las variables son muy
críticas se rediseña el método para aumentar su robustez.
Para el caso de una metodología en la que se emplea un HPLC, se toma el peor caso para
la asimetría, platos teóricos y resolución, es decir: la mayor asimetría, el número menor de
platos teóricos y la menor resolución.
6. SENSIBILIDAD
La sensibilidad se define cuantitativamente como la variación de la señal ( ) al variar
la concentración del analito (c)
(9)
Esto es la pendiente de la curva de calibración, la cual en la mayoría de las
determinaciones analíticas es constante ya que se utilizan curvas de calibración lineales.
7. LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
El objetivo de este ensayo es evaluar el método para bajas concentraciones de analito.
LÍMITES DE DETECCIÓN
El límite de detección (LoD) de un método es la menor concentración de analito en la
muestra que puede detectarse pero no necesariamente cuantificarse con una certeza
estadísticamente razonable por un método analítico dado.
Otra definición podría ser: es la menor concentración de analito en una muestra de ensayo
que puede ser confiablemente distinguida del blanco.
Es decir es la cantidad o concentración mínima de analito a partir del cual es factible realizar
el análisis. Este límite depende de la relación entre la magnitud de la señal analítica y el valor
de las fluctuaciones estadísticas del blanco. Es importante tener en cuenta la gran influencia
que tiene en el LoD la matriz en donde se encuentra el analito, por lo que para su determinación
es necesario contar con blancos de muestra.
La mínima señal analítica distinguible del blanco (XLoD) se define como:
(10)
Donde el la media de las medidas del blanco, la desviación estándar de las
medidas del blanco y k es un factor numérico que se elige en base al nivel de confianza
deseado.
Esta definición supone una distribución normal tanto de las señales del blanco como de la
muestra que contiene el analito, lo que implica que si un blanco y una muestra se analizan

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independientemente de forma repetida, las señales se distribuirán de forma Gaussiana alrededor
de (media de las señales del blanco) y de (media de las señales de la muestra)
Figura 1. Distribución Gaussiana
En general es aceptado un valor de k=3, lo cual implica que si se produce una señal superior
a la del blanco en 3 desvíos estándar, es muy poco probable (1% de probabilidad ) que la
misma se deba solo al blanco y por lo tanto es muy probable (99 % de probabilidad) que se
deba al analito (esta aproximación se basa en que considerando una distribución normal de las
señales del blanco, la probabilidad de que una señal superior a 3 veces la SD de la señal del
blanco sea sólo debida al blanco es de un 1 %)
Figura 2. Distribución de los datos del blanco y de la muestra con una concentración de
analito correspondiente al LoD.
El límite de detección puede expresarse en forma de concentración (LoD) según:
(11)
donde S es la sensibilidad o pendiente de la curva de calibración.

22
Otra manera de calcular matemáticamente el límite de detección es como la menor
concentración de analito cuya medida produzca una señal con un coeficiente de variación del 2
%.
También puede calcularse como la menor concentración de analito en la muestra que
produzca una señal 2 ó 3 veces superior al ruido o blanco: Este método se llama Medición de
la Relación Señal – Ruido.
(12)
La manera de determinar el LoD depende de la definición que se utilice.
A) El límite de detección puede determinarse realizando 10 medidas independientes del
blanco de muestra. Posteriormente los datos se tratan estadísticamente y se calculan la media y
la desviación estándar de la señal del blanco. El límite de detección se calcula utilizando las
ecuaciones 10 y 11.
B) Se preparan una serie de blancos de muestra fortificados con concentraciones crecientes
de analito, realizando para cada concentración varios replicados. Se trabaja en la zona de
menor concentración de la curva de calibración. Se miden las señales correspondientes y se
calcula la media y el coeficiente de variación (CV) y se grafican en función de la
concentración de analito en la muestra. El LoD será la menor concentración de analito en la
muestra que de una señal con un CV igual al 2%.
LÍMITES DE CUANTIFICACIÓN
El límite de cuantificación (LoQ), es la mínima concentración de analito en la muestra
que puede ser determinada con una precisión (repetitividad) y exactitud aceptable.
La mínima señal analítica cuantificable (XLoQ) se define como:
(13)
Donde es la media de las medidas del blanco y la desviación estándar de las
medidas del blanco.
El límite de detección puede expresarse en forma de concentración (LoQ) según:
(14)
dónde S es la sensibilidad o pendiente de la curva de calibración.
Otra manera de calcular matemáticamente el límite de detección es como la menor
concentración de analito cuya medida produzca una señal con un coeficiente de variación igual
al 10 %.

23
También puede calcularse como la menor concentración de analito en la muestra que
produzca una señal 10 veces superior al ruido o blanco. Este método se llama Medición de la
Relación Señal – Ruido.
(15)
A) El LoQ puede determinarse realizando 10 medidas independientes del blanco de
muestra. Posteriormente los datos se tratan estadísticamente y se calculan la media y la
desviación estándar de la señal del blanco. El límite de detección se calcula utilizando las
ecuaciones 13 y 14.
B) Se preparan alícuotas de blancos de muestra fortificados con varias concentraciones de
analitos cercanas al LoD. Se miden varios replicados para cada concentración. Se grafica la
y el CV en función de la concentración. El LoQ será la menor concentración de analito en
la muestra que de una señal con un CV igual a 10%.
CONCLUSIONES
Si bien la validación de un método es un proceso tedioso, garantiza la calidad de los
resultados analíticos. Muchas veces las limitaciones de tiempo no permiten una buena
validación del método. Sin embargo varios investigadores han experimentado las
consecuencias del uso de un método invalidado en los que aparecen problemas inesperados que
originan una gran pérdida de tiempo, recursos y dinero.
Problemas de Aplicación:
Preguntas teóricas:
1) En la validación de un método analítico se obtuvieron los siguientes resultados
parciales:
Muestra Buffer H2O
c.s.p.
Lectura Temperatur
a de trabajo
Solución 1 5 ml 30 ml 100 ml 0.478 25 °C
Solución 2 5 ml 30 ml 100 ml 0.240 15 °C
Evaluando sólo estos resultados parciales ¿puede decir que esta metodología presenta
alguna limitación? ¿Cuál? Justifique.

24
2) ¿Por qué el Límite de detección (LoD) y el Límite de cuantificación (LoQ) en
espectrofluorometría son inferiores al LoD y LoQ en espectrofotometría?
3) ¿Qué entiende por robustez de un método analítico? Indique como evaluaría este
parámetro en el análisis de un compuesto orgánico fluorescente y que información
relevante brinda.
4) Se evaluó la exactitud del método de cuantificación de ácido acetilsalicílico en
comprimidos por espectrofotometría UV-Visible mediante la técnica de adición de
estándar. Para ello se pulverizaron varios comprimidos y 50.0 mg de polvo se
disolvieron en 25.0 ml de agua destilada. Se transfirieron 2.0 ml de la solución
concentrada a un matraz y se llevó a 10.0 ml. La absorbancia de dicha solución a 274
nm fue de 0.4374. Luego se tomaron otros 2 ml de la solución concentrada y se agregó
1.0 ml de solución patrón de ácido acetil salicílico 130 mg/100 ml y se llevó a 10.0 ml
con agua destilada. La absorbancia de la solución fortificada fue 1.0266. Teniendo en
cuenta que en base a los estudios de linealidad, la ecuación de la recta que describe la
absorbancia en función de la concentración resultó:
a. A=8.2343 x 102 M-1 cm-1 x b (cm) x C(M) + 0.0006
y que en todos los casos se utilizó una celda de 1 cm, calcule el % de recuperación .
PM: ácido acetil salicílico: 180.15 g/mol
RTA: 99.15 %
5) Se desea evaluar el límite de detección y de cuantificación de un método
espectrofotométrico para la valoración de eugenol en un producto odontológico.
Se cuenta con los siguientes datos:
Tabla 1: Medidas independientes del blanco de muestra
Número de mediciones Absorbancia 274 nm
1 0,009
2 0,010
3 0,001
4 0,005
5 0,002
6 0,007
7 0,005
8 0,009
9 0,004
10 0,004
Curva de calibración: y=0,0049 ppm-1cm-1 x b (cm) x C (ppm) + 0,005
Se considera b=1 cm

25
¿Cuáles son los límites de detección y de cuantificación del método espectrofotométrico? Si la
absorbancia de una muestra a 274 nm es 0,034 frente al blanco. ¿Cuál sería su concentración de
eugenol?
ANEXO
❖ Blanco de muestra:
Son matrices sin el analito. En blanco de muestra es necesario para realizar una estimación
realista de las interferencias que puedan ser encontradas en la muestra. Sin embargo en muchas
ocasiones son difíciles de conseguir.
❖ Material de referencia (RM):
Material o sustancia que tiene una o varias de sus propiedades suficientemente bien
establecidas que permita su uso para:
▪ Calibrar un aparato
▪ Validar un método analítico
▪ Asignar valores a un material o sistema
❖ Material de referencia certificado (CRM):

26
Material de referencia que tiene certificados uno o varios valores de una o más de sus
propiedades por procedimientos técnicamente validados llevados a cabo por un organismo
competente.
BIBLIOGRAFIA
1. Mark Green, J. (1996) “A practical guide to analytical method validation” Analytical
Chemistry 68, 305A-309A.
2. Pharmacopoeia of United States (2000) “General information/(1225) Validation of
compendia methods” 2149-2152.
3. Skoog, D. A y Leary, J. L. (1994) “Características de funcionamiento de los
instrumentos; parámetros de calidad” En: Análisis instrumental, 6-11. Skoog A. A. Y
Leary, J. J. (eds.). McGraww-Hill, España. (Cuarta edición)
4. ISO 8402:1994. Quality-Vocabulary
5. EURACHEM Working group "Eurachem Guide: The fitness for purpose of analytical
methods. A laboratory guide to method validation and related topics". First Internet
Version, December 1998. English edition. Copyright LGC (Teddington) Ltd, 1998.

27
ESPECTROSCOPÍA DE
ABSORCIÓN MOLECULAR
ULTRAVIOLETA Y VISIBLE

28
Índice
Transmitancia y absorbancia 28
Ley de Lambert y Beer. Absortividad 28
Calibración de un espectrofotómetro 29
Limitaciones a la aplicabilidad de la Ley de Lambert y Beer 30
Análisis cuantitativo y cualitativo 34
Determinación de elementos por medio de agentes complejantes 36
Titulaciones espectrofotométricas 38
Determinación de constantes de disociación de indicadores ácido-base 38
Bibliografía 44
Problemas 45

29
ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA Y VISIBLE
TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA
Sabemos que la transmitancia T de una especie absorbente es la fracción de radiación incidente
transmitida por esta:
T = P / P0
Y que su absorbancia A viene definida por la ecuación:
A = - log T = log (P0 / P)
LEY DE LAMBERT Y BEER. ABSORTIVIDAD
De acuerdo con la Ley de Lambert y Beer, la absorbancia es proporcional al paso óptico, b, de
la capa absorbente atravesada por la radiación y a la concentración, c, del analito:
A = kbc
La constante de proporcionalidad, k, asume distintas denominaciones según las unidades en
que b y c son expresadas:
Absortividad (a): es la absorbancia de una solución cuya concentración, c, es de 1 g por litro,
medida en una celda de paso óptico, b, de 1 cm.
a = A / cb
Sus unidades son L g-1cm-1.
Coeficiente de extinción específica [E (1 %, 1 cm)]: es la absorbancia de una solución cuya
concentración, c, es del 1 % (1g/100 mL), medida en una celda de paso óptico, b, de 1 cm.
E (1 %, 1 cm) = A / cb = 10 a
Sus unidades son g%-1 cm-1.
Absortividad molar (ε): es la absorbancia de una solución cuya concentración es 1 mol por
litro, medida en una celda de paso óptico, b, de 1 cm. Puede calcularse como el producto de la
absortividad por el peso molecular (PM) del analito.

30
ε = a PM
Sus unidades son M-1 cm-1.
Los valores de a, E (1 %, 1 cm) y ε, a una longitud de onda específica y en un solvente
determinado, son característicos del analito.
ASPECTOS PRÁCTICOS
CALIBRACIÓN DE UN ESPECTROFOTÓMETRO
Procedimientos generales para la calibración de un espectrofotómetro, para medidas habituales
de concentración:
Cuando son usados instrumentos de un sólo haz de luz, el procedimiento consiste en ajustar:
1. el nivel 0% de transmitancia con el obturador del instrumento cerrado
2. el nivel del instrumento al 100% de transmitancia (cero de absorbancia) usando una cubeta
conteniendo todos los componentes de la solución a ser medida, menos la sustancia de interés
("blanco").
Las demás medidas serán hechas con relación al blanco, substituyéndolo por las muestras.
Para instrumentos de doble haz, la radiación proveniente del monocromador es igualmente
dividida en dos haces, que inciden en dos compartimientos, el de referencia y el de muestra. El
ajuste inicial es hecho colocándose el "blanco" en los dos compartimientos y regulándose el
instrumento para absorbancia cero. Las lecturas son hechas sustituyéndose el "blanco" del
compartimiento de la muestra por las muestras que serán medidas.

31
Fotómetros de un solo haz y de doble haz.
LIMITACIONES A LA APLICABILIDAD DE LA LEY DE LAMBERT Y BEER
Estas limitaciones se deben a la desviación de la linealidad entre absorbancia y concentración
cuando el paso óptico (b) es constante.
Las desviaciones a la Ley de Beer caen en tres categorías: reales, instrumentales y químicas.
Dichas desviaciones pueden ser positivas, si la absorbancia medida es mayor que la real, o
negativas si la absorbancia medida es menor que la real y llevan a que no se obtengan
relaciones lineales entre la absorbancia y la concentración.
a) Desviaciones reales
La Ley de Beer sólo describe bien el comportamiento de la absorción en soluciones diluidas; en
este sentido es una ley límite. A concentraciones elevadas (en general > 0,01 M), la distancia
promedio entre las especies absorbentes disminuye hasta el punto en que cada una afecta la
distribución de carga de la vecina. Esto a su vez, altera la capacidad de absorber a una λ dada,
con lo que se produce una desviación de la linealidad.
Este efecto también puede encontrarse en soluciones diluidas de la sustancia a medir, pero
concentradas en contaminantes no absorbentes, como electrolitos en particular. La proximidad
de iones altera, mediante interacciones electrostáticas, la absortividad (a) del absorbente.

32
Otras desviaciones reales provienen de los cambios en el índice de refracción del sistema
analítico, pues como a depende del índice de refracción de la muestra, la Ley de Beer sólo se
cumple para bajas concentraciones, en donde el índice de refracción es esencialmente
constante, ya que no es la absortividad la que es constante sino la expresión:
donde n es el índice de refracción de la solución.
A concentraciones 0,01 M o menores, el índice de refracción es esencialmente constante. Y lo
mismo sucede con la absorbancia específica. Esto no elimina la posibilidad de análisis
cuantitativos a concentraciones elevadas, pues el uso de soluciones patrón y una curva de
calibración pueden proporcionar una exactitud suficiente.
b) Desviaciones instrumentales
Radiación policromática
Las desviaciones instrumentales provienen, en primer lugar de la utilización de luz no
monocromática, ya que la pureza espectral del haz de radiación proveniente de la fuente,
depende del ancho de banda espectral del monocromador. La deducción de la Ley de Beer
supone radiación monocromática y los monocromadores en realidad proporcionan una banda
de longitudes de onda.
Cuando se hace una medida de transmitancia con luz de varias longitudes de onda, λ', λ''... la
potencia del haz que emerge de la solución de muestra será ( Pλ' + Pλ'' ...) y la potencia del haz
que emerge de la celda de referencia será ( P0λ' + P0λ '' ...) por lo que la absorbancia leída será:
A = log [( P0λ' + P0λ '' ...) / ( P0λ '10-a'bc + P0λ ''10-a''bc...)]
Cuando a' = a''..., esta ecuación se simplifica a A = a'bc y se cumple la Ley de Beer.
Entonces, la Ley de Beer puede cumplirse con pequeños intervalos de error, si la variación de
la absortividad con la longitud de onda es constante en el intervalo de longitudes de onda
que el selector del instrumento deja pasar, siempre que el ajuste de la longitud de onda nominal
sea muy reproducible.
Es decir, las desviaciones de la Ley de Beer resultantes de la utilización de un haz
policromático no son perceptibles, siempre que la radiación utilizada no abarque una región
espectral en la que el absorbente presente grandes variaciones de absorción en función de la
longitud de onda.
En el máximo de la curva del espectro de absorción, el coeficiente de absortividad varía más
lentamente que en el resto de la banda, igualmente la sensibilidad a la concentración es mayor
en el máximo de la banda de absorción, porque la absortividad tiene el valor máximo en ese
punto. Es por esto, que normalmente se selecciona la longitud de onda en el máximo de la
banda para realizar las medidas espectrofotométricas cuantitativas.

33
Efecto de la radiación policromática en la Ley de Beer. Las lecturas obtenidas a longitudes de
onda contenidas en la banda A dan una recta porque a no varía mucho en toda la banda. Las
correspondientes a la banda B, presentan desviaciones de la linealidad debido a que a
experimenta cambios significativos en esta banda.
Radiación espuria
El haz de salida de un monocromador suele estar contaminado con pequeñas cantidades de
radiación dispersada o espuria cuyas longitudes de onda son muy diferentes de las de la banda
de luz principal utilizada (cuando en los instrumentos se fija una longitud de onda nominal, λx,
el ancho de banda espectral del monocromador condiciona la banda de luz que pasa, que
corresponderá a la región λx ± ∆λ, llamada región de la luz útil).
La radiación espuria puede provenir de reflexiones procedentes de diversos componentes
ópticos y del monocromador, y llega al detector debido a la dispersión por partículas de polvo y
a las reflexiones en las superficies interiores, pudiendo no haber atravesado la muestra.
La luz que proviene de la celda de referencia induce una corriente fotoeléctrica en el detector al
igual que la luz que proviene de la muestra pero la luz espuria también induce una corriente
adicional en el detector, lo que lleva a una transmitancia falsa.
En presencia de este tipo de radiación la absorbancia viene dada por:
A´ = log (P0 + Ps)
(P + Ps)
donde Ps es la potencia de la radiación espuria no absorbida.

34
Desviación de la Ley de Beer producida por diversas cantidades de radiación espuria.
[Se representa Absorbancia en función de la Concentración (M x 103) para diferentes
Ps /P0 x 100]
A causa de las desviaciones instrumentales, tanto por radiación policromática como por
radiación espuria, se obtienen absorbancias menores que las teóricas. Por ello siempre
conducen a errores negativos.
c) Desviaciones químicas
Las desviaciones químicas a la Ley de Beer también se llaman desviaciones aparentes porque
dependen de la naturaleza química del sistema en estudio y si se trabaja bajo ciertas
condiciones (pH, concentración de reactivos, etc.) es posible hacer que el sistema cumpla dicha
ley. Las desviaciones son causadas, generalmente, por equilibrios en solución que involucran a
la especie absorbente y alteran su concentración originando desviaciones positivas o negativas,
ya que dan lugar a un producto que presenta un espectro de absorción diferente al del analito.
Si alguna reacción química que ocurra en el sistema origina un producto que absorba más
fuertemente que la sustancia ensayada, a la longitud de onda a la cual se hace la medida o
longitud de onda analítica, se producirá una desviación positiva. Si, al contrario, se origina un
producto que no absorbe a la longitud de onda analítica, la concentración de la sustancia se verá
disminuida y se originará una desviación negativa.
Entre los tipos de reacciones químicas que llevan a desviaciones de la Ley de Beer están:
reacciones de asociación-disociación, reacciones ácido-base, reacciones de polimerización,
reacciones de formación de complejos y reacciones con el solvente.

35
APLICACIONES
ANÁLISIS CUALITATIVO
Para el análisis cualitativo de una especie absorbente se utiliza su barrido espectral o espectro
de absorción. Consiste en la comparación del espectro obtenido de la muestra que contiene la
especie absorbente y el espectro de un estándar de dicha especie.
Requiere para ello un proceso de aislamiento o purificación de las especies absorbentes
contenidas en la muestra.
La espectrofotometría ultravioleta y visible tiene una aplicación algo limitada para el análisis
cualitativo ya que el número de máximos y mínimos de absorción es relativamente pequeño.
Además, diversas especies pueden presentar espectros de absorción semejantes. Es por ello que
el análisis del espectro UV-Visible no se utiliza como criterio único de identificación, sino
como análisis complementario, siendo necesario realizar un espectro IR (análisis de la zona de
“huellas dactilares”).
Sin embargo, a pesar de que no permite una identificación inequívoca de un compuesto
orgánico el espectro UV-Visible es útil para detectar la presencia de ciertos grupos funcionales
que actúan como cromóforos (carbonilo, anillo aromático, amina aromática, estructura fenólica,
etc.)
ANÁLISIS CUANTITATIVO
La espectroscopia de absorción es una de las herramientas más útil y ampliamente utilizada en
el análisis cuantitativo.
Entre sus características más importantes se incluyen:
● amplia aplicabilidad tanto a sistemas orgánicos como inorgánicos
● sensibilidades de 10-4 a 10-5 M (ampliable a 10-6 a 10-7 M con ciertas modificaciones)
● de moderada a alta selectividad
● buena precisión
● fácil y adecuada adquisición de datos
Procedimiento
Experimentalmente para el establecimiento de un método espectrofotométrico, después de
optimizar las condiciones químicas del sistema (pH, temperatura, control de interferentes,
concentración adecuada de reactivos, solvente apropiado, protección a la luz para evitar
reacciones fotoquímicas, etc.) que garanticen que se tiene la especie de interés en condiciones
adecuadas para la medida, se establecen los siguientes parámetros:
Selección de la longitud de onda
Las medidas espectrofotométricas se hacen normalmente a una longitud de onda
correspondiente a un pico de absorción, donde se alcanza la máxima sensibilidad. Además, la
curva del espectro de absorción es a menudo plana en esta región asegurando que se cumpla la
Ley de Lambert y Beer.

36
Determinación de la relación entre absorbancia y concentración
Consiste en la preparación de la curva de calibración a partir de series de soluciones estándares.
Estos deben aproximarse a la composición global de las muestras y deben cubrir un intervalo
de concentración razonable de analito. Se debe trabajar con concentraciones que permitan que
se cumpla la Ley de Beer, con el fin de obtener una curva de calibración que tenga una relación
lineal.
Método de la adición de estándar
Idealmente, los estándares de calibración deben aproximarse a la composición de las muestras a
analizar, no sólo respecto a la concentración de analito sino también respecto a la concentración
de otras especies de la matriz de la muestra, con el objeto de minimizar los efectos de estas
especies en la medida de absorbancia.
Cuando se analizan materiales complejos (suelos, minerales, cenizas de plantas, fluidos
biológicos), la preparación de estándares que reproduzcan las muestras es, muchas veces,
imposible o extremadamente difícil. Cuando ocurre esto, el método de adición de estándar es
útil para contrarrestar los efectos de matriz de la muestra.
Este método implica la adición de uno o más incrementos del mismo tamaño de la solución
estándar a las alícuotas de la muestra. Cada solución se diluye entonces a un volumen fijo antes
de la medida de su absorbancia.
Con el objeto de ahorrar tiempo o muestra, es posible llevar a cabo el análisis por adición de
estándar utilizando sólo un incremento de la solución estándar a la alícuota de muestra.
De esta manera:
A1 = ε b Vx Cx
Vt
A2 = ε b Vx Cx + ε b Vs Cs
Vt Vt
donde A1 y A2 son las absorbancias de la muestra diluida y de la muestra diluida más estándar,
respectivamente. ε es la absortividad molar de la especie absorbente en las condiciones de
medida (λ y solvente determinados) y b es el paso óptico.
Vx es el volumen de alícuota de la muestra con una concentración Cx (expresada en M)
desconocida, Vs es el volumen de solución estándar del analito adicionada a la muestra que
posee una concentración conocida Cx (expresada en M) y Vt es el volumen final al que son
llevadas estas soluciones.
Cabe aclarar que, la solución de muestra y la de muestra más estándar, pueden ser llevadas a
volúmenes finales (Vt) diferentes y que los volúmenes de alícuotas de muestra (Vx) también
pueden diferir entre ambas preparaciones.
Deberán tenerse en cuenta estos volúmenes (factores de dilución correspondientes) de tal
manera que Cx siempre esté referida a la misma situación experimental.
Por ejemplo:
Solución 1 con A1
Vx = 10 mL
Vt = 50 mL

37
Solución 2 con A2
Vx = 5 mL
Vt = 25 mL
Vs = 2 mL
Cs = 0.001 M
Entonces:
A1 = ε b 10 mL Cx
50 mL
A2 = ε b 5 mL Cx + ε b 2 mL 0.001 M
25 mL 25 mL
El problema se resuelve dividiendo miembro a miembro ambas expresiones. En estas
condiciones ε y b pueden simplificarse y la única incógnita será Cx.
Se verán más ejemplos de esta metodología en la resolución de los problemas correspondientes
a esta sección.
DETERMINACIÓN DE ELEMENTOS POR MEDIO DE AGENTES COMPLEJANTES
Muchos cationes metálicos absorben radiación débilmente o no absorben en la región visible.
Si este es el caso, para su determinación analítica utilizando la espectrofotometría visible o
colorimetría, se aprovecha la capacidad que poseen muchos de ellos para formar complejos
fuertemente coloreados por medio de agentes complejantes. Algunos autores denominan estas
reacciones como reacciones cromogénicas o formadoras de color. Los complejos de ciertos
elementos presentan en muchos casos ε ≥ 104 M-1cm-1 y absorberán fuertemente en el visible.
Algunos agentes complejantes muy utilizados en las determinaciones colorimétricas son:
ditizona, 8-hidroxiquinoleína, 1,10 fenantrolina, N-benzoilhidroxilamina, ditiocarbamato de
sodio, difeniltiocarbazona, 2, 2´ dipiridilo, ion tiocianato entre otros.
Algunos de estos agentes complejantes pueden formar complejos con un gran número de
metales y por tanto no presentan gran selectividad o especificidad, por lo que otros metales
pueden interferir con el metal que se desea determinar. Un reactivo se dice que es selectivo si
reacciona con un número limitado de elementos y específico si produce la reacción deseada de
color con solamente un elemento bajo ciertas condiciones de reacción.
Así la selectividad de una reacción de color depende del reactivo escogido, el número de
oxidación del elemento, el pH y sobre todo de la constante de estabilidad del complejo; ésta
constante es de gran importancia ya que complejos débiles pueden ser convertidos en otros más
estables por recomplejación. Las constantes de estabilidad de los complejos son también
utilizadas en la técnica de enmascaramiento para controlar los elementos interferentes (en
colorimetría, por ejemplo, mediante la formación de complejos incoloros de los interferentes)
con el fin de aumentar la selectividad y especificidad de los métodos espectrofotométricos.

38
Las determinaciones espectrofotométricas de elementos químicos mediante la formación de
complejos que absorben en el visible o en el ultravioleta es de gran importancia en diferentes
campos de la química, la biología, la bioquímica, la geología, en estudios ambientales,
farmacológicos, toxicológicos, en la industria minera, metalúrgica, de alimentos, etc.
Generalmente, debido a los altos coeficientes de absortividad molar de muchos de estos
complejos es posible la determinación de concentraciones del orden de mg/L o partes por
millón (ppm), siendo aplicables en las determinaciones de especies químicas a nivel de trazas
(contenidos de una especie en un material menores que 0.01 %). En algunos casos para
aumentar la sensibilidad de estos métodos se utiliza la formación de los complejos y extracción
del complejo con solventes orgánicos que permiten determinar concentraciones de partes por
billón (ppb) o μg/ L.
Muchos aniones, entre ellos, fosfato, silicato, nitrato, nitrito, cianuro, sulfuro, sulfatos,
tiocianato, etc. también se determinan espectrofotométricamente, así como muchas sustancias
orgánicas y otras de interés en bioquímica.
2, 2´ Dipiridilo
1,10 fenantrolina
8-hidroxiquinoleína
Ditizona
Difenilcarbacida Difenilcarbazona
Fórmulas de algunos agentes complejantes utilizados en colorimetría

39
TITULACIONES O VALORACIONES ESPECTROFOTOMÉTRICAS
Las medidas espectrofotométricas pueden utilizarse en la localización del punto de
equivalencia de una valoración, siempre que el analito, el reactivo o el producto de la
valoración absorban radiación. Alternativamente, un indicador absorbente puede proporcionar
el cambio de absorbancia necesario para la localización del punto de equivalencia.
Con el objeto de obtener un punto final espectrofotométrico satisfactorio, es necesario que el
sistema absorbente obedezca a la Ley de Lambert y Beer. Si no, la curva de valoración carecerá
de las regiones lineales necesarias para la extrapolación del punto final.
Debajo se muestra una curva de valoración posible: una especie no absorbente es valorada con
un valorante coloreado que es decolorado en la reacción. Ello da lugar a una línea horizontal en
las etapas iniciales, seguido por una rápida subida de la absorbancia pasado el punto de
equivalencia.
Volumen de valorante
Una curva de valoración fotométrica posible. Las absortividades molares de la sustancia
valorada, del producto y del valorante son εs, εp, εt, respectivamente. En este caso resulta: εs =
εp = 0 y εt > 0.
DETERMINACIÓN DE CONSTANTES DE DISOCIACIÓN DE INDICADORES
ÁCIDO-BASE
Muchos indicadores utilizados en las valoraciones ácido-base son moléculas orgánicas que
poseen uno o más protones que pueden ser cedidos o bien poseen grupos que pueden aceptar
protones, comportándose como ácidos o bases. Según sea el medio en el que se encuentren en
solución, la especie ácida o básica predominante en solución depende del pH del medio que los
contiene. Generalmente estas sustancias son ácidos o bases débiles y se utilizan como
indicadores debido a que sus iones presentan un color diferente (o longitud de onda de
absorción diferente) al de la forma sin disociar.
En forma general un indicador ácido en medio acuoso, se puede representar por el equilibrio:
H In + H2O H3O+ + In-
Forma ácida Forma básica
Especie absorbente a λa Especie absorbente a λb

40
λa ≠ λb
Cuya constante de equilibrio o constante de acidez, sería:
Ka = [ In- ]eq [ H+ ]eq .
[ H In ]eq
Y cuyo pKa sería:
pKa = - log [ In- ]eq [ H+ ]eq . = pH – log [ In- ]eq .
[ H In ]eq [ H In ]eq
En el caso del indicador ácido si se hallan las concentraciones de In- e HIn en el equilibrio y se
mide el pH de dicha solución del indicador es posible calcular la constante.
Experimentalmente la metodología seguida consiste de varios pasos a seguir que se irán
detallando con la ayuda de un ejemplo: la determinación espectrofotométrica del pKa del Rojo
de Metilo. Este indicador posee una forma al estado básico (In-) que se presenta de color
amarillo y una forma al estado ácido (HIn) que se presenta de color rojo.
(1) El primer paso consiste en determinar la longitud de onda de máxima aborción para cada
una de las dos formas (In- y InH). Para ello deberán preparase dos soluciones de indicador con
diferentes pH: una solución ácida, donde todo el indicador estará en su forma InH y una
solución básica, donde todo el indicador estará en su forma In-.
En el caso de nuestro ejemplo:
Solución ácida
Solución de Rojo de Metilo 0,01% en etanol 50º 10,00 mL
ClH 0,1 F 10,00 mL
Agua destilada c.s.p. 100,00 mL
Solución básica
Solución de Rojo de Metilo 0,01% en etanol 50º 10,00 mL
AcNa 0,04 F 26,00 mL
Agua destilada c.s.p. 100,00 mL
Utilizando agua destilada como blanco se efectúan las lecturas de absorbancia de ambas
soluciones desde 400 hasta 580 nm, en el caso de nuestro ejemplo.
Posteriormente se grafica Abs = f (λ) para ambas soluciones y se obtienen las longitudes de
onda de máxima absorción (λInH y λIn-).
Para el Rojo de Metilo:

41
Barrido espectral del Rojo de Metilo entre 400 y 700 nm.
λHIn : 520 nm
λIn-: 430 nm
En el caso del Rojo de Metilo, los espectros de absorción de ambas formas del indicador se
solapan. Esto significa que la forma ácida absorbe a la longitud de onda de máxima absorción
de la forma básica y está ultima también absorbe a la longitud de onda de máxima absorción de
la forma ácida. Es un ejemplo del caso más complejo donde ambas formas absorben a ambas λ
máximas de absorción.
Existen casos más sencillos donde sólo una forma del indicador absorbe a la λ máxima de
absorción de la otra forma, o donde no existe solapamiento alguno de los espectros de
absorción.
(2) El segundo paso consiste en verificar la Ley de Lambert y Beer para ambas formas del
indicador. La metodología consiste en preparar soluciones de distintas concentraciones de la
forma ácida (HIn) y de la forma básica (In-) trabajando a pH extremos de tal manera de
asegurar en ambos casos la existencia de sólo una de las formas del indicador. Luego se grafica
Abs = f (concentración) y se obtiene de dicha curva de calibración los valores de absortividad
de ambas formas (HIn y In-), a las dos longitudes de onda máximas de absorción.
Veamos cómo se procede en el ejemplo del Rojo de Metilo:
Para la forma ácida HIn:
Solución de
Rojo de Metilo
0,01%
2,00 mL 4,00 mL 6,00 mL 8,00 mL
ClH 0,01 F
c.s.p.
100, 00 mL 100, 00 mL 100, 00 mL 100, 00 mL
cc. (g/L) 0,002 0,004 0,006 0,008
Abs a 520 nm 0,319 0,620 0,921 1,222
Abs a 430 nm 0,046 0,065 0,081 0,108
Trabajando a pH ácido, en estas soluciones el indicador sólo existe en la forma InH.

42
La representación de Abs = f (cc.) será:
De esta representación (trabajando con una cubeta de 1 cm de paso óptico) se obtiene que:
Absortividad de HIn a 520 nm (a520 HIn) = 150,50 L g-1cm-1
Absortividad de HIn a 430 nm (a430 HIn) = 10,10 L g-1cm-1
Para la forma básica In-:
Solución de
Rojo de Metilo
0,01%
1,50 mL 2,50 mL 5,00 mL 7,00 mL
AcNa 0,01 F
c.s.p.
100,00 mL 100,00 mL 100,00 mL 100,00 mL
cc. (g/L) 0,0015 0,0025 0,0050 0,0070
Abs a 520 nm 0,022 0,041 0,055 0,081
Abs a 430 nm 0,097 0,200 0,366 0,509
Trabajando a pH básico, en estas soluciones el indicador sólo existe en la forma In-.

43
La representación de Abs = f (cc.) será:
De esta representación (trabajando con una cubeta de 1 cm de paso óptico) se obtiene que:
Absortividad de In- a 520 nm (a520 In-) = 9,81 L g-1cm-1
Absortividad de In- a 430 nm (a430 In-) = 73,00 L g-1cm-1
Los valores de las absortividades calculadas para cada forma a cada longitud de onda máxima
de absorción se utilizan luego para calcular la concentración de las dos formas (HIn y In-) a
distintos pH, los cuales deben ser cercanos al valor de pKa que se desea determinar.
(3) El tercer paso, entonces, consiste en la determinación de la concentración de ambas formas
HIn y In- a distintos pH cercanos al pKa. Para ello se preparan soluciones de la misma
concentración total del indicador con distintos pH, y se mide la absorbancia a las dos
longitudes de onda máximas de absorción de ambas formas del indicador, de tal manera de
poder determinar la concentración de las formas HIn y In- en cada una de las soluciones
preparadas.
En el caso de nuestro ejemplo:
Solución de
Rojo de Metilo
0,01 %
10,00 mL 10,00 mL 10,00 mL 10,00 mL
AcNa 0,04 F 25,00 mL 25,00 mL 25,00 mL 25,00 mL
AcH 0,02 F 50,00 mL 25,00 mL 10,00 mL 5,00 mL
Agua destilada
c.s.p.
100,00 mL 100,00 mL 100,00 mL 100,00 mL
pH 4,70 5,05 5,45 5,90
Abs a 520 nm 1,097 0,796 0,456 0,276
Abs a 430 nm 0,356 0,432 0,585 0,658

44
En estas soluciones, dado que no se trabaja a pH extremos sino a pH cercanos al pKa, el
indicador existe en ambas formas HIn e In-. Y las absorbancias a las dos λ máximas de
absorción se deben a la contribución de absorbancia de ambas formas presentes:
Abs520 nm = a520HIn.b.(cc HIn) + a520In-.b.(cc In-)
Abs430 nm = a430In-.b.(cc In-) + a430InH.b.(cc HIn)
Con los resultados de las absorbancias a ambas λ máximas de absorción y las absortividades
calculadas previamente es posible calcular las concentraciones de HIn y In- en las soluciones
preparadas con distintos pH.
En el ejemplo del Rojo de Metilo, dado que ambas formas absorben a las dos λ máximas de
absorción, se debe resolver un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas. La resolución de
este sistema es:
Cc HIn = . (a430In- . Abs520) – (a520In- . Abs430) .
(a520HIn . a430In-) – (a520In- . a430HIn)
Cc In- = . (a520HIn . Abs430) – (a430HIn . Abs520) .
(a520HIn . a430In-) – (a520In- . a430HIn)
Donde:
a520HIn y a520In- son las absortividades de ambas formas del indicador a 520 nm,
a430HIn y a430In- son las absortividades de ambas formas del indicador a 430 nm,
Abs520 es la absorbancia de la solución a 520 nm y
Abs430 es la absorbancia de la solución a 430 nm.
Conociendo el pH y la concentración de HIn y In- en el equilibrio planteado, puede calcularse
experimentalmente el valor de pKa del indicador para cada solución preparada.
pKa = pH – log [ In- ]eq .
[ HIn ]eq
Luego a partir de los valores de pKa se calculan los valores de Ka experimentales para cada
solución preparada, los cuales se esperan que sean similares.
Para el caso de nuestro ejemplo:
pH Cc. HIn (g/L) Cc. In- (g/L) pKa Ka
4,70 0.007034574 0.003903436 4.955790781 1.10716 x 10-5
5,05 0.004947885 0.005233238 5.025649132 9.42651 x 10-6
5,45 0.002530314 0.007663614 4.968740821 1.07463 x 10-5
5,90 0.001257633 0.008839697 5.053116441 8.84878 x 10-6
Se calcula entonces la media de los valores de Ka obtenidos.
Para el caso del ejemplo resulta:
Ka media = 1,0023 x 10-5

45
Y luego el pKa que es igual a: –log Ka.
En el ejemplo:
pKa = 5,00
De esta manera es posible calcular la constante de disociación de un indicador ácido-base
mediante el empleo de espectrofotometría.
BIBLIOGRAFÍA
1. Skoog, D y J. Leary. Análisis Instrumental. Cuarta Edición. Mc.Graw Hill. 1994,
Madrid. Caps.7 y 8.
2. Programa Universidad Virtual: http://www.virtual.unal.edu.co (Colombia), donde se
incluye la siguiente bibliografía:
➢ Harris, D. Análisis Químico Cuantitativo, tercera edición, Grupo Editorial
Iberoamericana, 1992, pag. 826.
➢ Lee, J.D. Concise Inorganic Chemistry. 4ta Ed. Chapman & Hall, Londres,
1991.
➢ Meites, Louis. Handbook of Analytical Chemistry.
➢ Ayres. G., Análisis químico cuantitativo, Ed Harla, pag. 325.
➢ Willard. H, Lynne. L., Métodos Instrumentales de Análisis, Grupo editorial
Iberoamericana. México. 1991. pags. 82-83, 93-94.

46
PROBLEMAS DE ESPECTROFOTOMETRÍA
1) La forma básica de un ácido monobásico muestra una máxima absorción a 450 nm (log ∈ = 4,20),
mientras que la forma ácida no absorbe a dicha longitud de onda. Una solución 2,55 x 10-5 M del
ácido que presenta un pH de 4,85, medido con un electrodo de vidrio combinado, posee una
absorbancia de 0,201 a 450 nm. Calcular el pKa y el Ka del ácido en cuestión. Tome en cuenta que
se utilizó para todas las mediciones el mismo espectrofotómetro y la misma celda.
2) Se pesan 3,2033 g de un pulverizado de unos comprimidos cuyo peso medio es 0,4025 g. El polvo
se extrae con agua llevándose a 100 mL. De esta dilución se toman 2,00 mL y se llevan a 50 mL.
La lectura de ésta solución da un valor de A = 0,4728. Paralelamente se pesan 0,1325 g de la
droga patrón y se llevan a 100 mL. Se toman 5.0 mL de esta dilución y se llevan a
100 mL. La lectura de ésta solución da un valor de A = 0,3925.
Calcular los gramos de droga por comprimido.
3) Un barbitúrico presenta un máximo de absorbancia a 245 nm en medio fuertemente alcalino.
Trabajando con una celda de 1 cm de espesor se obtienen los siguientes datos:
Concentración (M) Absorbancia
2,05x 10-5 0,179
4,10 x10 -5 0,356
8,2 x10-5 0,718
16,40 x 10 -5 1,430
Indicar si se encuentra dentro del rango de trabajo.
4) El principio activo de un jarabe se determina de la siguiente manera:
Se miden 5,0 mL del jarabe, se adicionan 15,0 mL de agua, 3 mL de reactivo (que forma un
complejo coloreado soluble con el principio activo) y se lleva a 100,0 mL. El blanco se prepara
midiendo 5,0 mL del jarabe y llevando 100,0 mL con agua. Se leyeron los siguientes valores de A
= 0,4632 y 0,0083 respectivamente. La solución patrón se preparó pesando 0,0849 g del principio
activo puro y disolviéndolos en 20 mL de agua, agregando el reactivo y llevándolos a 100.0 mL
con agua. Se leyó un valor de A = 0,5331.
Calcular el % de principio activo en el jarabe.
5) Se halló que la sustancia coloreada M posee un pico de absorción a 405 nm y que una solución
patrón que contenía 3,0 mg de M/litro poseía una absorbancia de 0,842 examinada en una cubeta
de 2,50 cm: Si el peso formula de M es 150:
a) Calcular la absortividad de M a 405 nm
b) ¿Cuál es la absortividad molar de M a 405 nm?
c) ¿Qué peso de M estará contenido en 100,0 mL de una solución cuya absorbancia es de 0,760
a 405 nm, examinada en una cubeta de 1,50 cm?
6) La hemoglobina de la sangre se determina midiendo su absorbancia a 430 nm. Al realizar una
curva de calibración se ha hallado una relación lineal entre absorbancia y concentración en un
rango de 0% (T = 1,000) a 35% (T = 0,1200) de hemoglobina por 100 mL de sangre. Si las
mediciones fueron realizadas en una cubeta de 1cm de espesor, calcule el volumen de solución al
35% para que diluidos a 25,0 mL de agua exactamente permita obtener una transmitancia de 0,37
cuando se mide en la misma celda.
Si la hemoglobina tiene un peso molecular de 68000, calcular su absortividad molar a esa longitud
de onda.

47
7) Se halló que una solución de 4,0 x 10-4 M de la sustancia X (PM: 125) poseía una absorbancia de
0,636 a 500nm, examinada en una cubeta de 1,5 cm.
a) Calcular la absortividad molar de X a 500 nm.
b) Calcular la absortividad de X a 500 nm.
c) ¿Qué peso de la sustancia se encuentra contenido en 400 mL de una solución que posee una
transmitancia de 34,8%, medida en una cubeta de 2,00 cm?
8) Se disolvió una muestra de 4,00 g de un acero que contenía manganeso. Se oxidó con periodato y
se diluyó a 500 mL. La solución resultante se comparó con una solución 2,07 x 10-3 F de KMnO4
obteniéndose visualmente la igualdad de intensidad de las coloraciones cuando la longitud del
recorrido óptico a través del patrón fue de 5,35 cm mientras que con la muestra problema fue de 4,0
cm.
Calcular el % de manganeso en el acero.
9) Una solución contiene 3 mg de una especie química de PM: 75,03 en 250 mL. Esa solución tiene
una T = 0.290 medida en una celda de 5 cm de espesor.
Calcular :
● Absorbancia
● Absortividad
● Absortividad molar
10) 1,5239 g de un granulado preparado para comprimir se extraen cuantitativamente con agua y se
llevan a 100,0 mL. De esta dilución se toman 10,0 mL y se llevan a 50,0 mL con agua destilada.
Esta solución leída en un espectrofotómetro da una T = 54%. El patrón que contiene 0,05 mg/mL
da un valor de T = 48% cuando es leído en las mismas condiciones. Calcular el % del principio
activo en el granulado y el contenido en un comprimido si el peso de los mismos es 0,320 g.
11) El E (1%, 1 cm) del clorocresol en HCl 0,1 N a 279 nm es de 105. El E (1%, 1 cm) de la misma sustancia
en HCl 0,1 N a 257 nm es de 20. Calcular la absortividad del clorocresol a cada una de las
longitudes de onda.
12) La sustancia X tiene un ε = 3900 L.(mol.cm) -1 a 370 nm. ¿Cuál es la concentración molar de X en
una solución que tiene una T% = 30 a 370 nm medida con una cubeta de 2,50 cm?
13) Una capa de 1,05 cm de solución 0,0120% P/V de un compuesto de PM: 185 transmite el 12 % de
la luz de 490 nm. ¿Cuál es la ε para esa longitud de onda?
14) Una muestra de 0,3850 g se lleva a 100,0 mL con agua destilada obteniéndose un valor de A =
0,410. Paralelamente se procesa un standard tomándose un peso de 0,0867 g de una droga patrón
llevándose a 200,0 mL. La lectura del standard así preparado fue A: 0,395. ¿Cuál es el % de droga
en la muestra analizada?
15) Si la ε del permanganato de potasio a 520 nm es de 2235. ¿Cuál será la T% de una solución
0,00120% P/V en una celda de 1,50 cm medida a esa longitud de onda?
16) Se halló que una solución de 5,40 x 10-4 M (PM: 123) poseía una T: 47,4% a 450 nm examinada
con una cubeta de 1,00 cm.
● Calcular la a de X a 450 nm
● Calcular la ε de X a 450 nm
● ¿Qué peso de X está contenido en 250,0 mL de una solución que posee una A = 0,530
medida en una cubeta de 1,5 cm?
17) Una muestra de 0,2021g se diluye a 25,10ml y se lee obteniéndose una T = 0,112 en una celda de
1,50 cm de paso. ¿Cuánto debe pesarse de esta muestra para obtener una T = 0,32 con la misma
celda si se lleva ese peso a 250,0 mL?

48
18) Una muestra de 0,1224 g se lleva a 100 mL con agua, obteniéndose una A = 0,348, sabiendo que
el % de especie química absorbente en dicha muestra es alrededor del 10 %. ¿Qué cantidad de
patrón de 100,0 % de pureza habrá que pesar para que llevado a 200,0 mL dé una lectura similar?
19) Para efectuar una determinación de ácido úrico en suero se procede de la siguiente manera: se
toma 1,0 ml de la muestra y se desproteiniza con 9,0 mL de ácido túngstico estabilizado; se
centrifuga y se extrae el sobrenadante. El testigo de trabajo se obtiene diluyendo al centésimo una
solución stock de ácido úrico de 100,0 mg/100ml. Se trabaja según el siguiente esquema:
Agua Sobrenadante Testigo de Trabajo Na2CO3 14% Rvo. de color Abs
3,0 mL ------------- -------- 1,00 mL 1,00 mL 0,030
-------- 3,0 mL --------- 1,00 mL 1,00 mL 0,315
-------- -------------- 3,0 mL 1,00 mL 1,00 mL 0,330
Calcular las ppm de ácido úrico en el suero problema.
20) Para analizar una partida de supositorios que contiene el principio activo X se procede de la
siguiente manera:
Se pesan 3,0514 g de granulado del supositorio, se realizan sucesivas extracciones. Los extractos
reunidos quedando el principio en el residuo. Este se disuelve en etanol y se transfiere a un matraz
aforado de 100,0 mL llevándose a volumen y obteniéndose la solución A. Para determinar X se
llevan 10,0 mL de la solución A a 100,0 mL leyéndose al UV una absorbancia de 0,445. Un patrón
de X preparado llevando 0,1055 g de droga patrón 100,0 mL y diluyendo luego una alícuota de
10,0 mL a 100 mL. La absorbancia de esta última dilución dio A = 0,410. ¿Cuántos mg de X hay
por supositorio si el peso promedio de la partida es de 3,0104 g por supositorio?
21) Para determinar el contenido de urea en un suero desconocido se procede según el siguiente
esquema de trabajo:
Testigo/urea Suero Ureasa Rvo I Rvo. II Agua(c.s.p) Abs (525nm)
Testigo 0,02 mL --- 1 mL 1,0 mL 1,0 mL 10,0 mL 0,410
Blanco --- --- 1 mL 1,0 mL 1,0 mL 10,0 mL 0,030
Desconocido --- 0,02mL 1 mL 1,0 mL 1,0 mL 10,0 mL 0,430
El testigo de urea usado se preparó a partir de una solución madre que contenía 1,500g de urea
por cada 1000 mL; se tomaron 3,0 mL de la solución madre y se diluyeron a 10,0 mL con agua
destilada acidificada.
Si tomamos en cuenta que los valores normales en suero son de 20 a 40 mg/100mL, indicar si el
suero desconocido es normal o patológico.
22) Para analizar por espectrofotometría UV el contenido de sustancias orgánicas en una muestra se
procede de la siguiente manera:
Se pesan 0,3008 g de muestra y se transfiere a un matraz aforado de 500,0 mL llevándose a
volumen con agua (solución muestra). Se pesa separadamente 35,3 mg de droga estándar y se
transfiere a un matraz aforado de 100,0 mL llevándose a volumen con agua. Una alícuota de 5,0
mL de esta última solución se transfiere a un matraz aforado de 500,0 mL y se lleva a volumen.
Esta última dilución constituye la solución estándar. Luego de leer las absorbancias en un
espectrofómetro con un paso de 1cm se obtuvieron los siguientes resultados:
Sol. Standard Sol. Muestra
Absorbancia 0,420 0,405

49
Calcular el % P/P de sustancia orgánica en la muestra.
23) Se quiere analizar el contenido de Hierro en una materia prima. Para ello se hace uso de una
reacción que permite obtener un compuesto coloreado de fórmula RFe2 (PM: 380,3). Para el
análisis se pesan 10,358 g de muestra y se disuelven en matraz aforado de 100,0 mL. La
absortividad molar del compuesto es igual a 4,38 x 106 cm-1x F –1. Se obtiene una absorbancia de
0,48 para una cuba con un espesor de 1,030 cm a una longitud de onda de 530nm. Calcular las
ppm de hierro en la materia prima.
24) Para analizar el contenido de Cr4+ en una muestra de aceite se aprovecha la propiedad de este ion
de formar un complejo coloreado con difenilcarbacida (DFC) que absorbe a una λ de 540 nm.
Para esto, se toma una alícuota de 20 ml de aceite, se diluyen a 100 mL con un solvente
adecuado. A 25 mL de esta dilución se le adicionan 10ml de solución de DFC de concentración 0,2
M y se llevan a volumen final 50 mL con el solvente. Esta solución arrojó un valor de absorbancia
de 0,525.
Paralelamente 25 mL de la primera dilución del aceite se llevan a 50 mL finales y se mide la
absorbancia dando un valor de 0,050.
El patrón se prepara midiendo 5 mL de una solución de Cr4+ de concentración 2 ppm, a la que se
le adicionan 5 mL de DFC 0,2M y llevando a volumen final 25 mL, siendo la absorbancia de esta
solución de 0,632.
Calcule la cantidad de Cr4+ en la muestra de aceite expresado como mg/mL.
25) El yodo molecular y el yoduro pueden cuantificarse espectrofotométricamente mediante la
utilización del reactivo LC, ya que este reacciona en forma específica con I2 a pH regulado
rindiendo un complejo coloreado que absorbe a 592nm.
A fin de cuantificar el I- presente en una muestra, se debe agregar peroximonosulfato de potasio a
la muestra de manera de convertir el I- a I2, de manera que pueda reaccionar con el reactivo.
Utilizando el siguiente esquema de trabajo:
REACTIVOS 1 2 3 4
Sc Estándar de Iodo - 5 mL - -
Muestra 50 mL - 50 mL 50 mL
Sc. Peroximonosulfato de K 1 mL 1 mL - 1 mL
Reactivo LC 0.1M - 1 mL 1 mL 1 mL
Buffer pH: 4.0 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL
Agua (c.s.p) 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL
ABSORBANCIA 0,020 0,150 0,230 0,290
La solución estándar de Yodo se prepara llevando 0,1ml de una solución stock de 1000 ppm de I2
y llevando a volumen 100 mL.
Calcule la concentración de Yodo y Yoduro en la muestra expresada como ng/mL.
26) La riboflavina se valora según farmacopea Británica a 444nm donde su E1% 1cm = 323. Para la
fabricación de inyectables se utiliza fosfato de riboflavina y sodio dihidratado por ser más soluble.
Se preparan 20 litros de inyectable que deben contener 2 mg/mL de riboflavina. La solución de
lectura contiene teóricamente 10 µg/mL de riboflavina y su absorbancia es 0,400.
Se desea saber:
1) La cantidad de riboflavina en la dilución preparada.
2) ¿Cómo procedería para que los inyectables cumplan con la condición exigida (2 mg/mL)?
Expréselo con números.
3) Si la absorbancia fuera 0,300, indique cómo procedería. Expréselo con números.
PM riboflavina: 376,4
PM fosfato de riboflavina: 514,4
27) Para preparar una solución acuosa de Ca(OH)2 0,75 M se pesan 44,4 g del hidróxido y se
llevan a 800 mL en una probeta de 1 L.
Responda las siguientes preguntas:

50
a- ¿Se preparó corrrectamente la solución en cuanto a la concentración final alcanzada? ¿Cuál es
la concentración final en %P/V?
b- Suponiendo que la solución al cabo de un tiempo se evaporó y se redujo su volumen en un 75
%. ¿Cuál es la concentración resultante en normalidad (N)?
c- El operario encargado de preparar la solución, al ver que ésta se evaporó, procede a repetir el
procedimiento pero con un hidróxido nuevo (Ca(OH)2 Dihidrato). ¿Cuánto tiene que pesar del
nuevo reactivo para llegar a la misma solución inicial?
28) Se desea evaluar la contaminación de aguas de napas con Dicloro Difenil Tricloroetano (DDT),
un pesticida ya prohibido que pudo haber permanecido en el suelo y haya lixiviado. Para ellos se
toman 100 mL de muestra de agua y se hace una extracción por partición de dos fases líquidas
aprovechando la baja polaridad del DDT. En la extracción se agregan 20 mL de hexano y se aísla.
Dicha fase orgánica se le agrega un reactivo que reacciona con el DDT dando un compuesto
coloreado medible espectrofotométricamente. Dicha medición da una concentración de DDT de
150 μg %. Calcule la concentración de DDT en el agua en ppm. Tenga en cuenta que en la
extracción, el DDT particiona un 98% hacia la fase orgánica.
29) Se desea preparar 250ml de buffer fosfato salino (también conocido por sus siglas en inglés:
PBS). Esta solución amortiguadora es isotónica y no es tóxica para células de mamíferos.
Su composición es la siguiente: NaCl 155mM - Na2HPO4.7H2O 2,7 mM - KH2PO4 1,5 mM y posee
un pH de 7,4
En el laboratorio dispone de los siguientes reactivos:
cloruro de sodio PM= 58,44
potasio fosfato monobásico PM=136,09
di-sodio hidrógeno fosfato 12-hidrato PM=358,14 pureza %= 99%
potasio fosfato di básico anhidro PM=174,18 pureza%=99,1%
300ml de H2O destilada
a. Indique los reactivos utilizados y el material volumétrico necesario para la preparación del
buffer
b. Describa brevemente el procedimiento de la realización del buffer, incluyendo las cantidades
teóricas de los reactivos elegidos anteriormente.
30) Para el análisis cuantitativo de loteprednol etabonato (corticoesteroide) mediante una técnica
espectrofotométrica de unas gotas oftálmicas antiinflamatorias es necesario realizar previamente
una extracción líquido-líquido: mezclando 10ml de hexano (solvente de extracción) y 20 ml de un
pool de 5 muestras (cada muestra posee 4 ml). Una vez obtenida la fracción orgánica, se toma una
alícuota de 0,1ml y se lleva a un Vf=100 ml con hexano en un matraz de 100ml.
Posteriormente, se mide su absorbancia a 240nm (A=0,450 frente a blanco) y ese valor es
interpolado en la siguiente curva de calibración: y=0,4x (100ml/mg)+ 0,016
¿Cuál sería la concentración de loteprednol etabonato expresado en %P/V en cada muestra de
gotas oftálmicas?
Ejercicios de titulación
1) Si se realiza la curva de titulación del compuesto A, en la que se lo valora con el valorante B, según
la ecuación:
A + B C
Qué perfil esperaría para la curva de Absorbancia = f ( [ B ] agregado) en el caso en que
aA = aB y aC = 0 ?
2) Si se realiza la curva de titulación de la figura en la que se valora el compuesto A con el valorante B
según la ecuación: A + B C
¿Qué curva de A vs. moles de B agregado esperaría en el caso en que aA = aB = 0 y aC ≠ 0 ?

51
3) Si se realiza la curva de titulación en la que se valora el compuesto A con el valorante B según la
ecuación: A + B C
Absorbancia
moles de B agregado
¿Qué puede decir de las absortividades específicas relativas de A, B y C?
4) Si se realiza la curva de titulación de la figura, en la que se valora el compuesto A con el valorante
B, según la ecuación:
A + B C
Absorbancia
moles de B agregados
¿Qué puede decir de las absortividades específicas de A, B y C?
Ejercicios de adición de estándar
1) La determinación de hemoglobina puede realizarse determinando el hierro por fotocolorimetía. Para
ello se toman 0,5 mL de sangre, se colocan en matraz aforado de 50 mL donde se desproteinizan y
mineralizan. Posteriormente se llevan a un volumen e 50 mL, se filtra y del filtrado límpido se miden
25,0 mL, a los cuales se les agrega 1 mL de persulfato de potasio solución saturada y 4 mL de
tiocianato de potasio 3 N. Se mide la absorbancia a 480nm obteniéndose un valor de 0,1673. A la
muestra preparada anteriormente (30 mL) se le adicionan 5,0 mL de solución de sulfato férrico
amónico que contiene 0,1%o (cero uno por mil) de Fe, llevándose a un volumen de 60 mL. Para
esta solución se obtuvo una absorbancia de 0,3962. Calcular el % de hierro y el % de hemoglobina
considerando que esta contiene 0,335% de hierro.
2) Se determina por espectrofotometría una droga utilizando el método de patrón agregado. Se pesan
0,5031 gr de la muestra, se llevan a 250 mL y se leen a 420 nm. Esta solución dio una absorbancia
de 0,1385. Posteriormente se agregan a la solución anterior 52 mg de la droga patrón. La
absorbancia obtenida es de 0,2568. Calcular el % P/P de la droga en la muestra.

52
3) Se analiza el contenido del compuesto A en una solución inyectable por espectrofotometría UV a
254 nm. Para ello se diluyen 10 mL de la misma a 25 mL con HCl 0,2 N. Luego se toman 20 mL de
la dilución y se llevan a un volumen final de 100 mL con HCl 0,2 N. La solución resultante se
denominará “dilución de la muestra”. La absorbancia de la solución resultante es 0,312.
Paralelamente se pesan 21 mg de estándar del compuesto A y se disuelven en 50 mL de la
“dilución de muestra”. La absorbancia de la última solución es 0,626.
Calcular el contenido de compuesto A en la solución inyectable, expresada en mg/mL.
4) Se analiza el contenido de analgésico en una solución inyectable. Para ello se miden 2 mL de
muestra, se alcaliniza y se agregan 50 mL de agua; luego se extrae con cloroformo (solvente
inmiscible con agua) llevando a un volumen final de 100 mL (extracto X). Se toman 5 mL del
extracto X y se llevan a 50 mL finales. La absorbancia de esta última solución es 0,318 a 275 nm.
Paralelamente se toman 2 mL de extracto X, se le agregan 3 mL de una solución que contiene 5,1
mg de estándar del analgésico cada 100 mL, y se lleva a un volumen de 25 mL. La absorbancia
resultante es 0,497 a 275 nm.
Indicar el contenido de analgésico en la solución inyectable, expresado en mg/mL.
5) Se determina el contenido de hierro en una muestra sólida. Para ello se pesan 10,9376 gramos de
la muestra, se trata con un reactivo que convierte todo el hierro presente a la forma Fe2+ y se diluye
a 100 mL con agua destilada (solución X).
Se miden 3 mL de la solución X, se agregan 5 mL del reactivo complejante y se lleva a un volumen
final de 50 mL con buffer pH = 5,0. La absorbancia a 520 nm de la solución resultante es 0,361.
Paralelamente se miden 3 mL de solución X, se agregan 2 mL de patrón de Fe2+ 5 x 10-2 M, 5 mL
de reactivo complejante y se lleva a un volumen final de 50 mL con buffer pH = 5,0. La absorbancia
a 520 nm es 0,579.
Calcular el % de FeCl3 en la muestra sólida.
PA Cl: 35,453; PA Fe: 55,847.
Ejercicios de complejos
1) Una mezcla de un agente complejante B con Ni2+ da lugar a un complejo intensamente coloreado
NiB2
2+ cuyas soluciones siguen la Ley de Beer en un amplio rango de concentración. Cuando la
concentración del agente complejante supera a la de Ni2+ en un factor de 5 ó más el catión existe
totalmente en la forma de complejo. Utilice los siguientes datos para evaluar la constante de
formación Kf para la reacción:
Ni2+ + 2B NiB2
2+
Ni2+ (M) B (M) A450 nm (b:1cm)
2,5 . 10-4 2,2 . 10-1 0,765
2,5 . 10-4 1,0 . 10-3 0,360
2) Para analizar el complejo CrA2¯ se trabaja a 560 nm donde sólo absorbe la especie CrA2¯ . Si el
complejante A2- se presenta como mínimo en 8 veces de exceso, la cantidad de CrA2¯ queda
limitada por la concentración analítica del Cr3+ y sigue la Ley de Beer en un amplio rango. Una
solución con concentraciones de Cr3+ de 1,5 . 10-4 M y 7,6 . 10-3 M de A2- tiene una absorbancia de
0,580 en una celda de 1 cm y a 560 nm. Además una solución con concentraciones de 1,5 . 10-4 M
de Cr3+ y de 3,3 . 10-4 M de A2- tiene una absorbancia de 0,410 medida en las mismas condiciones.
Use esta información para averiguar el valor de Kf para el proceso:
Cr3+ + 2 A2- CrA2¯

53
3) Los datos de absortividad para los complejos de Ni y Co con el reactivo 2,3-quinoxalinaditiol en sus
correspondientes picos de absorción son los siguientes:
Longitud de onda
510 nm 656 nm
ECo 36400 1240
ENi 5520 17500
PA Ni: 58,71
PA Co: 58,93
Se disolvió una muestra de 0,3760 g de suelo, que fueron diluidos finalmente a 50 mL. Una
alícuota de 25 mL fue tratada para eliminar las interferencias, se adicionó 2,0 mL de 2,3-
quinoxalinaditiol y se ajustó el volumen a 50 mL. Esta solución dio una absorbancia de 0,467 a 510
nm y de 0,347 a 656 nm en una celda de 1cm.
Calcular el % de Ni y Co en la muestra.
4) El 8-hidroxiquinol forma un complejo coloreado tanto con el cobalto como con el níquel cuyas
absortividades molares correspondientes a sus máximos de absorción se muestran a continuación
en la tabla. Una solución de ambos metales presentó una absorbancia de 0,598 a 365nm y de
0,039 a 700 nm medidas ambas con una cubeta de 1,00 cm. Calcular las ppm de cobalto y niquel
de la solución.
Absortividad Molar E
365nm 700nm
Co 3529 428,9
Ni 3228 10,2
PA Ni: 58,71
PA Co: 58,93
Ejercicios de pK indicador
1) Sabiendo que:
HIn In- + H+ Ka = 1,8 . 10-5
Se efectuó el barrido espectral a pH=2 y a pH=8, obteniéndose:
Abs
pH=2 pH=8
400 540 Longitud de onda (nm)
¿A qué pH trabajaría y de qué manera diseñaría la experiencia para verificar que la constante de
equilibrio del indicador es Ka = 1,8 . 10-5?
2) Se prepararon 100 mL de una solución a partir de 1,150 gramos de un ácido desconocido puro. Se
midieron 12,5 mL de la solución del ácido desconocido y se valoró con NaOH 0,061 N siendo

54
necesarios 13,12 mL de valorante para neutralizar el ácido. Luego se preparó una mezcla que
contenía: 25,0 mL de solución de ácido desconocido puro, 13,12 mL de NaOH 0,061 N y un
indicador ácido-base. La concentración final del indicador en la mezcla fue 2,69 x 10-4 F y su Ka = 6
x 10-6 . La absorbancia de la mezcla medida en una cubeta de 1 cm fue 0,253 (a 440 nm) y 0,695
(a 620 nm). Las absortividades molares del indicador en su forma ácida y en su forma básica, a
440 nm y a 620 nm se presentan en la siguiente tabla:
E 440 nm (M-1.cm-1) E620 nm (M-1.cm-1)
H In 2204 776
In - 408 3372
a- Calcular el pH de la mezcla preparada.
b- Calcular la constante de disociación del ácido desconocido.
c- Calcular el peso equivalente del ácido.
3) Cierto indicador ácido-base HIn H+ + In- se adiciona a una serie de soluciones en
igual concentración (0,0001 M), midiéndose la absorbancia en una celda de 2 cm. Los datos son
los siguientes:
Solución Absorbancia
0,05 M HCl 0,096
Buffer pH=4,5 0,387
0,02 M NaOH 0,884
Calcular la constante de disociación del indicador y el intervalo aproximado de cambio de color.
4) Sabiendo que
Absorbancia
In- H In
400 450 Longitud de onda (nm)
¿A qué pH trabajaría y de qué manera diseñaría la experiencia, si las únicas posibilidades de medición
son a 400 y 450 nm, para verificar que la constante de disociación ácida del indicador es
Ka = 4,0 x 10-5?
5) La concentración total de un indicador en una determinación espectrofotométrica es de 2,5 x 10-4 F.
Se trabaja a 530nm (b = 1cm), obteniéndose los siguientes resultados:
Solución Reactivos Absorbancia
1 HCl 0,15 F 0,042
2 Buffer pH: 5,1 0,175
3 NaOH 0,15 F 0,395

55
Calcular el valor de Ka del indicador empleado.
6) Sabiendo que
disociación ácida del indicador es Ka = 3,0 x 10-5?
7) Sabiendo que
disociación ácida del indicador es Ka = 1,8 x 10-6?

56
RESULTADOS DE LOS PROBLEMAS DE ESPECTROFOTOMETRÍA
1) pKa = 4,85
Ka = 1,40 x 10-5
2) 0,0251 g/comprimido
3) Cumple con la Ley de Beer
4) 1,45 %
5) (a) 112,27 cm-1 g-1 L
(b) 16840, 5 cm-1 M-1
(c) 0,45 mg/100 mL
6) 11,73 mL
ε = 178,9 cm-1 M-1
7) (a) ε = 1060 cm-1 M-1
(b) a = 8,48 cm-1 g-1 L
(c) 0,0108 g
8) 1,90 %
9) A = 0,538
a = 8,97 cm-1 g-1 L
∈ = 672,5 cm-1 M-1
10) 1,3772 %
4,416 x 10-3 g/comprimido
11) a(279 nm) = 10,5
a(257 nm) = 2,0
12) 53,6 x 10-6 M
13) 1352 cm-1 M-1
14) 11,6873 %
15) T% = 55,7
16) (a) a = 4,88 L/g cm
(b) ε = 600 cm-1 M-1
(c) 0,0181 g
17) 1,0477 g
18) 0,0245 g
19) 95 ppm
20) 113,0 mg/supositorio

57
21) 47,4 mg/100 mL
El suero es patológico
22) 0,5658 %
23) 0,115 ppm
24) 3 x 10-3 mg/mL
25) 140 ng/mL de Yodo
40 ng/mL de Yoduro
26) (1) 12,384 μg/mL
(2) Agregar 4,768 L de agua a los 20 primitivos
(3) Agregar 3,8926 g de riboflavina fosfato (equivalentes a 2,8483 g de riboflavina)
ε = 672,5 cm-1 M-1
27) a- Si. 5,55 % P/V
b- 2N
c- 66 g
28) 6 ppm
29) NaCl: 2,2645g - KH2PO4: 0,0510g - Na2HPO4.12H2O: 0,2442 g
30) 0,54%P/V
Ejercicios de titulación
1) A 2) A
B B
3) aB = aC = 0 4) aA = aC ≠ 0
aA ≠ 0 aB ≠ 0 y > aA
Ejercicios de adición de estándar
1) % Fe = 0,05353
% Hb = 15,98
2) 12,1008 %
3) 5,217 mg/mL
4) 4,01 mg/mL
5) 8,1860 %

58
Ejercicios de complejos
1) 1,52 x 106
2) 1,73 x 108
3) 0,0156 % de Co
0,0299 % de Ni
4) 5,235 ppm de Co
5,174 ppm de Ni
Ejercicios de pK indicador
2) (a) 5,59
(b) 2,57 x 10-6
(c) 179,69 g
3) Kindicador = 1,85 x 10-5
Intervalo aproximado de cambio de color: 4,73 + 1
5) 4,802 x 10-6

60
Índice
Introducción 60
Teoría de la fluorescencia y fosforescencia 60
Fluorescencia y fosforescencia 62
Variables que afectan la fluorescencia y la fosforescencia 63
Sensibilidad y especificidad 66
Instrumentos de medida 66
Componentes de los equipos 69
Aplicaciones 70
Bibliografía 70
Problemas 71

61
Introducción
La fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia; son procesos fotoluminiscentes, en
donde las moléculas de analito se excitan para dar una especie, cuyo espectro de emisión,
suministra información para el análisis cualitativo y cuantitativo.
Estos métodos, tienen un límite de detección del orden de partes por billón y un amplio rango
lineal, permitiendo la determinación cuantitativa de un conjunto de especies orgánicas e
inorgánicas importante, a niveles de trazas. Debido a su alta sensibilidad, suelen aplicarse como
método de detección en cromatografía líquida (HPLC) y electroforesis capilar. Sin embargo su
utilidad está limitada, por el hecho de que pocas especies presentan fotoluminiscencia.
Teoría de la fluorescencia y fosforescencia
1. Estados excitados
El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no puede haber dos electrones con
los cuatro números cuánticos iguales. Esta restricción requiere que no haya más de dos
electrones en un orbital, y además, los dos deben tener los estados de espín opuestos. Cuando
esto ocurre, estamos frente a un estado singulete, donde se dice que los espines están
apareados; y como consecuencia de dicho apareamiento, la mayoría de las moléculas no
presentan un campo magnético neto (moléculas diamagnéticas) y por lo tanto no son atraídas
ni repelidas por un campo magnético permanente. Por otro lado, el estado fundamental para un
radical libre, que tiene electrones desapareados, es un estado doblete; donde el electrón impar
puede tomar dos orientaciones en un campo magnético, lo que comunica ligeras diferencias de
energía al sistema. Estas moléculas son paramagnéticas y son atraídas cuando se encuentran
en un campo magnético.
Cuando uno de los electrones de una molécula es excitado a un nivel de energía superior, se
forma un estado singulete exitado o un triplete. En el estado singulete excitado, el espín del
electrón promocionado, continúa apareado con el del estado fundamental; sin embargo en el
estado triplete los espines de los dos electrones están desapareados y, por lo tanto, están
paralelos.
Las propiedades de una molécula en estado triplete excitado difieren significativamente de las
del estado singulete excitado. Por ejemplo, una molécula es paramagnética en el estado
triplete y diamagnética en el estado singulete. Más importante, sin embargo, es el hecho que
una transición singulete / triplete, que supone un cambio en el estado electrónico, es un suceso
significativamente menos probable que la correspondiente transición singulete / singulete.

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