DNA:n sekvenssointi Sanger-menetelmällä.

1. 9.2.8. DNA:n sekvenssointi eli emäsjärjestyksen lukeminen (Sanger-
menetelmä)
Kenties tärkein solubiologisen tutkimuksen saavutuksista on kyky lukea DNA:ssa
olevia emäsjärjestyksiä. Emäsjärjestyksien perusteella voidaan päätellä DNA:n
koodaamien proteiinien aminohappojärjestys (kolme rinnakkaista emästähän koodaa
aina yhtä aminohappoa). Näin voidaan paremmin ymmärtää esimerkiksi tiettyjen
geenivirheiden aiheuttamia molekyyli- ja solutason vaikutuksia. DNA:n
emäsjärjestyksen selvittäminen antaa myös mahdollisuuden vertailla eri eliölajien
geenirakenteita. Vaikkapa Homeobox-geenien toimintatapa ja niiden universaalius
eläinkunnassa ymmärrettiin vain tällaisen puuhastelun tuloksena.
Kuvaan tässä niin sanotun Sanger-menetelmän (Nobel-palkinto vuonna 1980), jota
kutsutaan myös dideoksynukleotidimenetelmäksi. Menetelmän kehitti tutkija
nimeltään Frederick Sanger. Samainen kaveri oli jo vuonna 1958 saanut
ensimmäisen Nobel-palkintonsa selvitettyään insuliini-hormonin
aminohappojärjestyksen (1955).
Sanger-menetelmä
Sanger-menetelmä alkaa leikkaamalla haluttu DNA-jakso irti jostakin laajemmasta
DNA-näytteestä, esimerkiksi kromosomista. Leikkaamisessa käytetään
restriktioentsyymejä. Koska nämä entsyymit leikkaavat DNA:ta vain tiettyjen
emäsjärjestysten kohdalta, voidaan restriktioentsyymien avulla määrätä, millainen
emäsjärjestys tulee irrotettavan DNA-jakson kumpaankin päähän (kuva 60).

2. Tutkittavassa DNA-molekyylissä olevien sticky end -päiden emäsjärjestykset
tunnetaan leikkaamisessa käytetyn restriktioensyymin perusteella. Sen sijaan DNA-
jakson muu emäsjärjestys (alla olevissa esimerkeissä sinisellä) on tässä vaiheessa
tuntematon. Tämä on siis se osa DNA-molekyyliä, joka halutaan sekvenssoida.
Esimerkiksi, jos toinen yksöisjuosteista on 3´ATGAGGATGGTAA 5´, on tälle
kompelementaarinen yksöisjuoste emäsjärjestykseltään 5´CCTACCATTAGTA 3´.
Kaksoisjuosteena ne näyttäisivät seuraavalta:
ssDNA:n tuottaminen
Emäsjärjestyksen selvittäminen aloitetaan ns. epäsymmetrisellä PCR:llä. Siinä
kopioitavan DNA-kaksoisjuosteen päät muokataankin emäsjärjestykseltään
erilaisiksi. Tällöin praimerit voidaan valita sellaisiksi, että ne kiinnittyvät DNA-
juosteessa vain jompaankumpaan 3´-päähän (kuva 61).
G AATTC
C TTAA G
G GATC C
C CTAG G
A AGCT T
T TCGA A
G TCGA C
C AGCT G
GC GC
CG CG
Tämä katkaisupaikka jää tylpäksi,
siis ilman sticky end –päätettä.
Kuva 60. Esimerkkejä restriktioentsyymeille
ominaisista katkaisupaikoista.
3´ATGAGGATGGTAA 5´
5´CCTACCATTAGTA 3´.

3. Edellä kuvatun toimenpiteen vuoksi PCR:n tuottamat kopiot edustavatkin nyt vain
toista DNA:ssa alkujaan olevista yksöisjuostetyypeistä. Epäsymmetrisen PCR:n
tuloksena syntyvää DNA-näytettä kutsutaan tästä lähtien ssDNA:ksi (ss tulee
sanoista ”single stranded” eli yksijuosteinen).
ssDNA:ta ei siis ole mikä tahansa yksijuosteisia DNA-molekyylejä sisältävä näyte,
vaan sellainen, joka nimenomaan sisältää vain jompaa kumpaa
komplementaarista juostetyyppiä. Selostamani vaihe on erittäin tärkeä syystä, jonka
perustelen lopussa menetelmän yleiskuvauksen jälkeen.
Eristetyt ssDNA-kopiot jaetaan nyt neljään eri koeputkeen. Jokaisessa koeputkessa
PCR:ää jatketaan tämän jälkeen yksi kierros, kuitenkin sillä erolla, että nyt tavallisten
DNA-nukleotidien lisäksi kuhunkin putkeen sujautetaan jonkin verran myös ns.
dideoksynukleotideja. Tällaisia nukleotideja DNA-polymeraasi voi kyllä liittää
aikaisempien nukleotidien jatkoksi, mutta se ei pysty liittämään uusia nukleotideja
5´CCTACCATTAGTA 3´
3´ATGAGGATGGTAA 5´
5´CCTACCATTAGTAGCCGC 3´
3´ATGAGGATGGTAATCATCGGCG 5´
Alkuperäinen restriktioentsyymillä
irroitettu kaksoisjuoste, jonka
molemmissa 3´-päissä on sama
peilikuvamainen emäsjärjestys.
Kaksoisjuosteen toisen pään
aloittava emäsjärjestys on
muutettu toisenlaiseksi (harmaat
emäkset). Nyt praimerit voivat
kiinnittyä vain koskemattomaksi
jätettyyn 3´-päähän.
Kuva 61. DNA:n muokkaaminen epäsymmetristä PCR:ää varten.

4. enää dideoksynukleotidien perään. Kopiointi siis pysähtyy aina, kun polymeraasi
pahaa aavistamatta liittää ketjun jatkoksi dideoksynukleotidin (ddDNA-nukleotidin).
Tavallisten ja dideoksynukleotidien eroa havainnollistaa mojovasti seuraava vertaus:
jos tavalliset nukleotidit ovat normaaleita Lego-palikoita, niin dideoksynukleotidien
yläpinnalta puuttuisivat Legoille ominaiset nystermät.
T
T
C
T
G
G
A
T
G
T
T
A
G
A
G
T
A
A
G
G
A
A
C
T
T
A
A
A
A
C
DNA-polymeraasia
DNA:n ddA-nukleotideja (tämän
polymeraasi voi liittää
nukleotidiketjun jatkoksi, mutta
tähän kopiointi pysähtyy)
Tavallisia DNA-
nukleotideja
PCR:n tuloksena saatuja ssDNA-juosteita (3´-pään emäsjärjestys
mustalla).
Kuva 62.
ddA-nukleotideja sisältävä koeputki Sanger-
menetelmän lähtötilanteessa.
PCR-putkeen lisätään kuvassa näkyvät
lähtöaineet emäsjärjestyksen selvittämistä
varten. Siniset aakkoset kuvaavat
tutkittavassa DNA-näytteessä olevaa
emäsjärjestystä, jota tässä vaiheessa ei
vielä tunneta.
Dideoksy-A-nukleotidit on kuvaan merkitty
punaisella.
Kutakin neljää dideoksynukleotidityyppiä
varten tarvitaan oma koeputkensa.
T
C
A
T
T
C
A
T
Praimereita

5. Jos ensimmäiseen koeputkeen laitetaan vain sellaisia ddDNA-nukleotideja, joiden
emäs on A eli adeniini (kuva 62), keskeytyy kopiointi tässä putkessa aina kohtaan,
missä viimeisenä emäksenä on adeniini. Putkeen syntyy suuri määrä geenikopioita,
jotka ovat täydellisen pitkiä vain silloin, kun polymeraasin tielle ei ole osunut yhtään
ddDNA-nukleotidia.
Loppuun asti kopioituneiden molekyylien seassa on nyt suuri joukko eri kohdilta
kesken jääneitä tynkiä. Näitä on monen kokoisia, mutta jokaisessa molekyylissä
viimeisenä emäksenä on adeniini. Sanger-menetelmän lopputilanne havainnollistuu
kuvissa 63 ja 64.

6. Kuva 63. ssDNA:ta sisältävät koeputket dideoksy-nukleotidimenetelmällä toteutetun
PCR-kierroksen jälkeen. Kussakin putkessa on valtava populaatio eri kohdista
kesken jääneitä (siis vain lyhyeltä matkalta kaksijuosteisia) kopioita alkuperäisestä
DNA-juosteesta. Mustat viivat ovat mallijuosteita, värilliset viivat ovat uusia kopioita.
Kaikki uudet kopiot päättyvät dideoksy-nukleotidiin.
Seuraavassa vaiheessa jokaisesta koeputkesta tehdään ajo elektroforeesilevyllä
(kuva 65 ).
ddA-putki ddT-putki ddC-putki ddG-putki

7. Sama toistetaan muissakin koeputkissa. Jokaiseen koeputkeen lisätään
tavanomaisten PCR-ainesten lisäksi myös jonkin verran dideoksy-nukleotideja.
Neljästä putkestamme yhdessä on dideoksy-nukleotidien emäksenä tymiini.
Yhdessä putkessa on dideoksy-nukleotideja, joissa emäksenä on guaniini. Ja
neljännessä putkessa dideoksy-nukleotidien emäksenä on sytosiini. PCR:n jälkeen
jokaisessa putkessa on valtaisia määrä eri kokoisia DNA-kopioiden tynkiä hyvin
lyhyistä jaksoista aina kokonaisiin kopioihin asti. Mutta jokaisessa putkessa tyngät
päättyvät aina emäkseen, jonka tyyppisiä dideoksynukleotideja putkeen oli lisätty
(kuvat 63 ja 64).
DNA:n emäsjärjestys saadaan nyt selville elektroforeesin avulla. Siinä läskiä
muistuttavan elektroforeesihyytelölevyn (valmistettu etupäässä keittiöstä tutuista
aineksista) toiseen päähän tehtyyn viiltoon tipautetaan näytteet edellä mainituista
koeputkista. Jokaiselle putkelle tehdään oma elektroforeesiajo. (kuva 65).
Kuva 64.
Näyte dideoksy-A-tyyppisiä nukleotideja sisältävän koeputken sisällöstä
PCR-kierroksen jälkeen. Dideoksy-A-nukleotidit on kuvaan varjostettu
punaisella ja praimerit turkoosilla. Tosiasiassa koeputkessa on valtaisa
populaatio kaikkia kuvassa näkyviä A-emäksen kohdalle pysähtyneitä DNA-
kopioita. Tämä ilmenee parhaiten kuvasta 63.
T
T
C
T
G
G
A
T
G
T
T
A
G
A
G
T
A
A
A
A
A
T
C
A
T
T
C
T
T
C
T
G
G
A
T
G
T
T
A
G
A
G
T
A
T
T
C
T
G
G
A
T
G
T
T
A
G
A
G
T
A
T
T
C
T
G
G
A
T
G
T
T
A
G
A
G
T
A
T
C
A
T
T
C
A
T
T
C
A
T
A
T
C
C
A
A
T
C
C
C
T
A
C
A
A
T
C
JNE…

8. Kun levyn läpi tämän jälkeen johdetaan sähkövirta, DNA-kopiot alkavat liikkua virran
mukana. Mitä lyhyemmästä molekyylistä on kysymys sitä nopeammin (= pitemmälle)
se ”läskin” sisällä liikkuu.
Jos esimerkiksi praimerit on valmistettu radiohiiltä sisältävistä nukleotideista,
jokaisesta molekyylien kokoluokasta muodostuu oma radioaktiivinen raitansa ”läskin”
sisälle (raidat näkyvät radioaktiivisuudelle herkällä filmillä). Kun neljän näytteemme
jättämiä raitoja tutkitaan rinnakkain, voidaan DNA-juosteen emäsjärjestys lukea
suoraan levyiltä (kuva 65). Emästen pariutumissäännön perusteella selviää saman
tien tietenkin myös komplementaarisen juosteen emäsjärjestys.

9. Vertaus pituusjuoksukilpailuun
Elektroforeesivaihetta voitaisiin verrata joukkuemuotoisesti tapahtuvaan
pituusjuoksukilpailuun. Kilpailussa on neljä rinnakkaista rataa (= neljä eri ”läskiä”).
Radat voidaan nimetä emästen mukaan ddA-, ddT-, ddG- ja ddC-radaksi (kuva 65) .
_+
-
ddA-levy
ddT-levy
ddC-levy
ddG-levy
Kuva 65. Elektroforeesin käyttö DNA:n sekvenssoinnissa Sanger-
menetelmällä. Jokaisen dideoksynukleotideja sisältäneen koeputken (=
värit) sisältö ajetaan erikseen omalla elektroforeesilevyllään.
Sekvenssoitavan DNA-näytteen emäsjärjestys on luettavissa raidoista
helposti, kun levyt asetetaan rinnakkain. Kuvassa emäsjärjestys
vasemmalta oikealle olisi CGTATGCATCGATCGATCG (saat järjestyksen
selville kuljettamalla pystyssä olevaa viivotinta kuva-alueen poikki nuolien
kulkusuunnassa).
-
-
-
+
+
+
+

10. Kunkin radan alkuun asettuu joukko eri tavoin raskas- / kevytrakenteisia juoksijoita (=
eri kokoisia DNA:n kopioita asianomaisia dideoksy-nukleotideja sisältäneestä
koeputkesta). Kun lähtölaukaus kajahtaa (sähkövirta kytketään), jokaisen joukkueen
jokainen jäsen (=tutkittavat molekyylit) singahtaa matkaan samanaikaisesti, mutta
pysytellen tiukasti omalla radallaan. Mitä pitempään kilpailun annetaan jatkua sitä
suuremmaksi kevytrakenteisten juoksijoiden etumatka kasvaa raskasrakenteisiin
juoksijoihin nähden. Kilpailuajan päättyessä (= kun sähkövirta katkaistaan) kukin
juoksija pysähtyy radalleen. Rata-alueella (= neljä rinnakkaista läskiä) nyt olevien
juoksijoiden järjestys kertoo suoraan DNA-molekyylissä olevan emäsjärjestyksen.
Miksi Sanger-menetelmässä tarvitaan nimen omaan ssDNA:ta?
Kuvitteellisessa DNA-näytteessämme toisilleen komplementaaristen juosteiden
emäsjärjestykset ovat esimerkiksi seuraavat: 3´ATGAGGATGGTAA5´ ja
5´CCTACCATTAGTA 3´.
Jos emäsjärjestystä olisi yritetty selvittää molempia juosteita sisältävästä näytteestä,
olisi jokaisen dideoksy-G-juovan kohdalle ”läskiin” muodostunut juova myös
dideoksy-C-näytteestä. Samoin jokaisen dideoksy-A-juovan kohdalle olisi
muodostunut juova myös dideoksy-T-näytteestä. Näin siksi, että komplementaariset
emäkset A / T ja C / G sijaitsevat yhtä kaukana molekyylien päistä.
Olisimme siis saaneet selville kylläkin peräkkäiset emäsparit, mutta emme sitä, mitkä
asianomaisista emäksistä olisivat kuuluneet samaan juosteeseen. Tässä on siis syy
siihen, että Sanger-menetelmän dideoksyvaiheessa käytetään vain ja nimen omaan
ssDNA:ta.
Lukulaitteita
Emäsjärjestyksen selvittämisessä käytetään nykyisin myös automaattisia
lukulaitteita. Niidenkin toimintaperiaate on edellä kuvatun kaltainen (ei
todennäköisesti kuitenkaan kauan, sillä DNA:n suoraankin lukemiseen kykeneviä
välineitä ollaan jo kovalla tohinalla kehittelemässä).