Kỹ Thuật Elisa

2. NỘI DUNG
PHƯƠNG
PHÁP ELISA
ĐỊNH NGHĨA
MỘT SỐ KHÁI NIỆM
NGUYÊN TẮC PHƯƠNG
PHÁP ELISA
CÁC PHƯƠNG PHÁP
ELISA
ỨNG DỤNG
VÍ DỤ THỰC TIỄN

3. ĐỊNH NGHĨA
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay )
Phương pháp hấp thụ miễn dịch dùng enzyme hay
EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa
để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu
xét nghiệm.

4. ĐỊNH NGHĨA
- Ví dụ: Enzyme peroxidase phản ứng với một
số cơ chất nhất định như: Tetramethylbenzidine
hay 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid sẽ
phát màu. Màu sinh ra từ các phản ứng này có
thể được sử dụng làm tín hiệu nhận biết (tín hiệu
chỉ thị).

5. MỘT SỐ KHÁI NIỆM
 Kháng nguyên: là những chất có khả năng huy
động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu, kháng
nguyên bao gồm: protein lạ, acid nucleic, một số
lipid và polysaccharide.
 Kháng thể: thành phần gramma globulin trong
các protein máu. Kháng thể là những protein hòa
tan do các tế bào B hay tương bào tiết ra để đáp ứng
với 1 kháng nguyên và chúng có thể gắn đặc hiệu
với kháng nguyên .

6. NGUYÊN TẮC
- Dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên
và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một
enzyme.
- Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ lên bề mặt những
đĩa giếng. Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên trong
mẫu, kháng nguyên sẽ tạo phức hợp với kháng thể cố
định trên giếng và kháng thể tự do có gắn enzyme tạo
thành 1 phức hợp kép.

7. NGUYÊN TẮC
- Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu vào enzyme xúc
tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo thành các
sản phẩm có màu hay phát sáng.
- Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng
đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên và
thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ
kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.

8. NGUYÊN TẮC

9. CÁC PHƯƠNG PHÁP ELISA
ELISA CẠNH TRANH
4
ELISA TRỰC TIẾP
1
ELISA GIÁN TIẾP
2
SANDWICH ELISA
3

10. PHƯƠNG PHÁP ELISA TRỰC TIẾP
- Đây là dạng đơn giản nhất của phương
pháp ELISA . Trong đó kháng nguyên cần
phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt
giá thể và sẽ được phát hiện bằng một
kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được
gắn với enzyme).

11. PHƯƠNG PHÁP ELISA TRỰC TIẾP
Bước 1: Cho kháng nguyên vào đĩa
Bước 2: Đem ủ đĩa chứa kháng nguyên
Bước 3: Rửa đĩa
Bước 4: Thêm kháng thể có gắn với enzyme
Bước 5: Rửa
Bước 6: Ủ ở 37 0C
Bước 7: Thêm cơ chất
Bước 8: Ủ ở 370C
Bước 9: Đọc kết quả

12. PHƯƠNG PHÁP ELISA TRỰC
TIẾP
- Ưu điểm : đơn giản nhất.
- Nhược điểm :
Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng
nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình duyệt kháng
nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1
kháng thể gắn vào một epitope.
Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt
với từng đối tượng.

13. PHƯƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP
- Phương pháp này khác với ELISA trực
tiếp ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên
không được gắn với enzyme mà nó là mục
tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (
kháng thể này mới là kháng thể được gắn
với enzyme).

14. PHƯƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP
Bước 1: Cho kháng nguyên vào đĩa
Bước 2: Đem ủ, rửa
Bước 3: Thêm kháng thể
Bước 4: Ủ, rửa
Bước 5: Bổ sung kháng thể có gắn enzyme
Bước 6: Ủ, rửa
Bước 7: Thêm cơ chất tạo màu
Bước 8: Ủ, đọc kết quả

15. PHƯƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP
- Ưu điểm : kháng thể gắn với enzyme có thể sử
dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên
nên tiện lợi và kinh tế hơn , dễ dàng thương mại
hóa.
- Nhược điểm : độ đặc hiệu của từng kháng
huyết thanh là khác nhau. Điều này dẫn đến các kết
quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần
phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác
nhau để có kết quả có thể tin tưởng được

16. SANDWICH ELISA
Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ
biến nhất trong thực tiễn do nó có phản ứng mạnh
và nhạy. kết quả thí nghiệm được đánh giá thông
qua sự kết hợp của hai loại kháng thể : kháng thể
bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện
(detection antibodies) .
Kỹ thuật này chia làm 2 dạng: Sandwich
Elisa trực tiếp, Sandwich Elisa gián tiếp.

17. SANDWICH ELISA
Bước 1. Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT.
Bước 2.Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc
hiệu trên bề mặt.
Bước 3. Phủ mẫu chứa KN cần xác định đem ủ
Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN
trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ
bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều
trường hợp):

18. SANDWICH ELISA
Bước 4. Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết
sẽ bị rửa trôi.
Bước 5. Thêm các KT đặc hiệu cho KN cần
chuẩn đoán đem ủ
Bước 6 .Thêm KT thứ cấp đã được gắn với
enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp ở
bước 5).

19. SANDWICH ELISA
Bước 7 .Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa
trôi.
Bước 8 .Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ
chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện.
Bước 9 .Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳnh
quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có
mặt và hàm lượng KT.

20. ELISA CẠNH TRANH
Bước 1 . "Ủ" Kháng Thể không được đánh dấu với
Kháng Nguyên.
Bước 2 .Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi
phiếm có chứa Kháng Nguyên.
Bước 3. Rửa đĩa, Kháng Thể không được gắn kết
sẽ bị rửa trôi. Lượng Kháng Nguyên càng lớn,
lượng Kháng Thể gắn thành công với Kháng
Nguyên trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh".

21. ELISA CẠNH TRANH
Bước 4 .Thêm Kháng Thể thứ cấp (Kháng
Thể của Kháng Thể ở bước 1). Kháng Thể
thứ cấp gắn với enzym.
Bước 5. Thêm cơ chất. Lượng enzym còn
dư sẽ giải phóng tín hiệu huỳnh quang hay
tín hiệu màu.

22. BẢNG SO SÁNH
Dạng Gián tiếp Dạng Trực tiếp Dạng cạnh tranh
Bổ sung một loại
enzyme chất nền-
chất nhiễm sắc
thuần chủng là tác
nhân tạo ra màu
sắc để phát hiện
Bổ sung một loại
enzyme chất nền-
nhiễm sắc thuốc thử là
tác nhân tạo màu để
phát hiện
Bổ sung một loại
enzyme chất nền-
nhiễm sắc thuốc thử
là tác nhân tạo màu
để phát hiện
Màu này là tỷ lệ
thuận với số
lượng mẫu kháng
thể cố định ban
đầu
Màu này tỷ lệ thuận với
số lượng kháng
nguyên trong mẫu
Màu này tỉ lệ nghịch
với số lượng mẫu
kháng thể

23. Độ nhạy
Nét đặc trưng
Thời gian
thí nghiệm
Giá thành
Trực tiếp Gián tiếp
Cạnh
tranh

24. ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM
- Độ nhạy cao xác định kháng nguyên hoặc
kháng thể
ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml)
- Rẻ tiền ít tốn sinh phẩm,hóa chất,số lượng
mẫu lớn
- Có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu
Ưu điểm

25. ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM
Nhược điểm
- Đòi hỏi thời gian (có kết quả sau 5h).
- Yêu cầu kỹ thuật phân tích cao.
- Trang bị kĩ thuật hiện đại chi phí lớn.

26. ỨNG DỤNG CỦA ELISA
Trong thực phẩm
- Phát hiện độc tố trong tảo
- Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella,
Staphylococcus aureus,sán lá gan… trong thực
phẩm
- Phát hiện chất chloramphenicol (chất không được
phép có trong tôm, cá và các sản phẩm thuỷ sản
khác)

27. ỨNG DỤNG CỦA ELISA
Trong nông nghiệp
- Chuẩn đoán bệnh Tristeza (tác nhân gây bệnh
héo rũ) trên cây cam quýt.
- Phát hiện kháng thể chống Mycoplasma
hyopnewmonia(MH) ở heo.

28. ỨNG DỤNG CỦA ELISA
Trong y học
- Là một trong các kĩ thuật xét nghiệm HIV
nhằm phát hiện kháng nguyên p24
- Ứng dụng để phát hiện bệnh A. cantonensis
(bệnh viêm màng não) do loại giun kí sinh ở
phổi chuột gây ra.

29. VÍ DỤ THỰC TIỄN
Chế phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát hiện nhiễm HIV
Nguyên tắc
Là phản ứng ELISA “Sandwich“
- Kháng nguyên gắn trên giếng là các protein vỏ gp160 của HIV-1
và ANT70 (nhóm O) gp36 của HIV2
- Nếu trong mẫu thử có kháng thể kháng HIV, kháng thể này sẽ
gắn đặc hiệu với kháng nguyên cố định trên giếng. Đồng thời khối
cầu cộng hợp là kháng nguyên HIV gắn men cũng có sẵn trong
mỗi giếng sẽ tạo phức hợp : Kháng nguyên -Kháng thể-Cộnghợp

30. QUY TRÌNH
Lấy máu
Tách huyết thanh đi pha loãng , cho
vào các đĩa mà KN HIV được cố định
Rửa giải các thành phần khác trong huyết thanh.
Nếu có kháng thể HIV thì KT này sẽ được giữ lại.
Thêm KT thứ cấp đặc
hiệu với KT HIV vào đĩa

31. QUY TRÌNH
Rửa giải KT thứ cấp có
gắn enzyme
Cho cơ chất đặc hiệu với
enzyme của kháng thể thứ cấp
Đo OD ở bước sóng
450nm
So sánh kết quả với kết quả mẫu
huyết thanh của người bình thường
Mẫu mất màu vàng ban đầu
Enzyme : Horsesal
peroxidase
Cơ chất TMB