Dek蛋白的真核表达纯化及其活性检测

DOI：CNKI:11-4816/Q.20111024.1139.003 网络出版时间：2011-10-24 11:39
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4816.Q.20111024.1139.003.html

中国生物工程杂志!" %&'( + , . /011 211/ 1
#$ $*#%( -
) ( 3

研究报告

! # 蛋白的真核表达纯化及其活性检测

郭海红!杨!辛!郭!芳!胡红刚

北京交通大学理学院生命科学与生物工程研究院!北京!1000

摘要!利用 ' +) ' +
4 4 杆状病毒表达系统表达 ? A蛋白并进行纯化首先以 BCD E
( @ ) + 质粒构
'
建重组质粒 BCD E @ 转化 ? 10' +
) +4 A
' ? F 大肠杆菌后获得重组穿梭载体 ' + $ ? A 通过脂质
G=4@
体介导转染 6H 细胞产生具有强感染力的重组杆状病毒 I J L? A 用此重组杆状病毒
3 + K 4@
I J L? A感染 6H 细胞表达 FD @ 融合蛋白在非变性条件下利用 J4M -N *
+ K 4@ 3 $? A
4 $ I D 对表
J (
达的 FD @ 融合蛋白进行纯化经 6? K O 和 P*) % :,) 分析在 70 Q? 处出现特异性
$? A
4 64I @ D N ($
* )%-
蛋白条带并证实其为 FD @ 融合蛋白凝胶迁移阻滞实验表明融合蛋白 FD @ 与 ? I 的
$? A
4 $? A
4 J
结合具有结构特异性其与超螺旋型 ? I结合活性强于与线性化 ? I的结合活性真核表达并
J J
纯化的融合蛋白 FD @ 与 ? I的结合活性要明显强于原核表达的融合蛋白 FD ? ? A
$? A
4 J $ ' @
4
蛋白的磷酸化修饰会阻碍其与 ? I的结合而 6H 细胞中表达的融合蛋白 FD @ 存在磷酸化
J 3 $? A
4
修饰将 FD @ 去磷酸化后其与 ? I的结合活性有所提高
$? A
4 J
关键词!? A蛋白!杆状病毒表达系统!凝胶迁移阻滞
@
中图分类号!R513

!!? A蛋白是一种含量丰富的染色质架构蛋白 14
@
恶性肿瘤的发生发展密切相关因此对 ? A蛋白的
@
人类的 ? A 蛋白最初发现于一种急性髓系白血病
@ 功能进行研究是非常必要的这将有助于揭示癌症的
74
S
中这种急性髓系白血病的亚型以 S3 B/2 发病机理为治疗癌症提供新的检测诊断和治疗
T2 染色体的易位为特征导致 ? A的编码区与核孔
@ 方法
蛋白 J K 的编码区融合最终以 ? A J融合蛋
U /1 @ 4I 本研究的主要目的是构建表达全长 ? A的质粒
@
白的形式被释放出来随后? A蛋白被确认为幼年
@ 载体采用杆状病毒真核表达系统表达纯化出具有生
V4
5 V34
10
类风湿关节炎系统性红斑狼疮等几种自身免物学活性的 ? A 蛋白并检测其与 ? I 的结合
@ J
疫疾病的自身抗原活性
随着研究的深入? A蛋白在细胞中的作用日益
@
$%材料与方法
受到关注很多研究显示 ? A 蛋白在 ? I 的复
@ J
制 11 损伤修复 1/ 基因的转录调控 124 G J
13
W I的转 $
$%材%料
录后加工 /04 以及细胞分化 /4 中起重要的作用但
/2 /S
1X 1!菌株质粒和细胞 !含 ? A蛋白全长基因的
1X @
是? A蛋白的作用机理尚有待进一步研究另外
@ 重组质粒 BY 1544@
? M? A为本实验室制备并已鉴定正
? A蛋白与细胞凋亡密切相关 /V4 ? A蛋白对细胞
@ /3
@ 确B+ J 2X 4! #%? 7 $ ? 10' + 3 为
? I 1 $ F ! #% F 6H

凋亡具有双重性即促进或抑制细胞凋亡本实验室保存BCD E *H ) E W * 6C300
) + ,* $ E *-%) 4
' ,+%
目前? A蛋白已被确认为是一种癌基因其与
@ E6C 培养基为 E $(* 公司产品FD ?
E Y %ZN %
)- $ '融合蛋
4
白为本实验室原核表达纯化并复性 20
收稿日期/0114 //!!修回日期/0114 11
054 104
1X / ! 试剂 ! K$* I M F ? I 聚合酶 ? I
1X N 6M W Y 6 J
G J
教育部留学回国人员基金资助项目 603 200070
通讯作者电子信箱 #-
#89:; * +
) =8%
8 各种限制性内切酶及相应 ' H M ? I连接
YNN
Q* 8HN J
*

/ 中国生物工程杂志 %'( + , .
#$ $*#%( -
) ( L , J X /011
( 21 (1/
X

酶及其连接 ' H 均购自宝生物工程大连有限公
8HN
* 为35 a 2 G%35 a 10 D a 17 D a 7 G%循环
$ 77 V/ $
司 6C300 E Y 培养基及脂质体转染试剂
4 E6C 20 次V/ a 10 G%
$

,*) E W * 均为 E $(* 公司产品预染
*H $ E *-%)
,+% %ZN %
)- $? A融合蛋白的表达!利用 ,*) E
1X 7!FD @
/X 4 *H $ E
,+%
蛋白质 Y N N 4KD 购自 J '公司小鼠 ? A单抗
K *
Q* @ @ W * 脂质体介导将外源重组 ? I ' + $ ? A 转
*-%) J G=4@
购自 '?公司小鼠 FD
$单抗辣根过氧化酶标记山羊染到适应无血清培养基 6C300 E6C 的 6H 细胞中
4 E Y 3
抗小鼠 E
-O购自中杉金桥生物技术有限公司J4M
$ I
J 于 /V a培养 V/ # 待出现细胞病变后收集细胞培养
购自 RI @
EO J公司? I凝胶回收试剂盒质粒 ? I
J J 上清即可获得重组杆状病毒 I J L ? AK 代将得
+ K 4@ 1
小量纯化试剂盒购自 [ *'(MQ 公司@ 化学发
G- $ * 到的 I J L ? AK 代病毒再次感染 6H 细胞于 /V
+ K 4@ 1 3
光试剂盒' I蛋白分析试剂盒购自 K@
EW @公司 a培养待出现细胞病变后再次收集细胞上清得到 K/
1X 2!引物与测序 !参照 J ' @ N -%*
1X E %) ] * 上报道的
* 代重组病毒通过同样的方法可以得到病毒滴度较
? A基因序列序列号J
@ Y^002V/X 设计引物上游
2 高的 K 代 I J L ? A重组病毒
2 + K 4@
引物 K1 7_ O I M I O I I
4 O I M O M M I M I
将病毒滴度较高的 K 代重组病毒感染 6H 细胞
2 3

I O O O2_ 下划线部分为加
MI M MO M 4 分别收集感染 / #5 # 和 V/ # 的病变 6H 细胞及对
3

入的 !$ 酶切位点波浪线部分为引入的 S ` $标
#WE FD 照正常细胞用 K 6 漂洗 2 次超声波裂解后进行
'
签下游引物 K 7_ I M O M I O
/ I O MO O I I 6? K O
64I @电泳和 P*) % :,) 分析检测 FD @
D N ($
* )%- $? A
4
I MI MM O M 4 下划线部分为加入的
I M O M M M I I M O2_ 融合蛋白的表达情况
'(= E 酶切位点引物由北京 E $(* 公司合成
E E %ZN %
)- 1X S!FD @
/X $? A融合蛋白的纯化 !将收集的病变 6H
4 3
$'%方%法细胞及对照正常细胞用预冷的 K 6 缓冲液重悬重复 2
'
1X 1! ? A ? I 片段的 K W 扩增 ! 以 BY 1544
/X @ J ? M 次收集沉淀用非变性裂解液 D
. D:8HN G (c
$ H 70 G ,
*
? A重组质粒为模板扩增 ? A ? I 片段扩增
@ @ J J F K 200 G (c , 10 G (c G= , 1e
/ [ G ,J G ,$$ ] *
(
? A? I片段的 K W反应程序为37 a 7 G%35 a
@ J $ J %$ ) 0 BF 0重悬细胞冰浴 10 G%将上清与 J
( =* K 5X $ $
10 D S a 17 D a 30 D
72X V/ 循环 20 次V/ a 10 G%
$ 柱结合于 a摇床振荡 1 f #用洗液 P :8HN
/ D# H 70
*
1X /!供体质粒 BCD E @
/X ) + ? A的构建 ! 将扩增的
' 4 G (c J F K 200 G (c J /0 G (c
G , / [ G , , G ,
? A? I片段的 K W产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯
@ J $$ ] * BF 0 洗 / 次洗脱液 @8)% :8HN 70
G= ,
( 5X ,$( H
*
化并将 ? A? I纯化片段和 BCD E
@ J ) + 载体进行双
' G (c J F K 200 G (c J /70 G (c
G , / [ G , , G ,
酶切 !$ 和 '(= E 然后用连接酶将双酶切纯化
#WE E E $$ ] * BF 0洗脱 2 次分别收集洗脱液进行 6?
( 5X
G= , 64
后基因和载体 1S a连接过夜转化于感受态细胞 ! I @分析 ' I法测定蛋白浓度 b
KO 50a保存备用
#%? 7
$ F 经质粒抽提限制性酶切鉴定和 ? I测序
J 1X V! FD @
/X $? A融合蛋白的 P*) % :,)
4 D N ($
* )%-分析 !
分析正确获得阳性重组 BCD E @
) + ? A质粒
' 4 6? K O
64I @电泳后将胶上蛋白通过半干电转仪转移至
1X 2!重组穿梭载体 ' + $ ? A的构建!将 7 的
/X G=4@ , 硝酸纤维素膜上分别以小鼠抗 ? A单克隆抗体和小
@
重组质粒 BCD E @
) + ? A加入至冰上解冻的 100 !
' 4 , 鼠抗 FD
$单克隆抗体作为一抗1 g
1000 稀释山羊抗
#%? 10' +
$ F 感受态细胞中混合热激后立即取出
小鼠 E
- W
OF K辣根过氧化物酶标记抗体作为二抗1 g
放置冰上向混合物中加入 300
, '液体培养基于 7000 稀释将 @ 化学发光底物作用于硝酸纤维素

2V a振荡培养 # 取 100 涂布平板于 2V a恒温
, 膜上对 h光片进行曝光显影和定影处理检测分析
培养箱中倒置培养 5 # 后挑取白色菌落 2 次划线 P*) % :,) 结果
D N ($
* )%-
纯化 1X 5!FD @
/X $? A融合蛋白与 ? I结合活性的研究!
4 J
挑取纯化的白色单菌落于 7 G 的含三抗 A %
, 参照 P 等使用的方法用非放射性凝胶迁移实
, %%
=G
O % M) 的
* * '培养基中2V a过夜振荡培养从中验分析纯化的 FD @
$? A融合蛋白原核表达纯化并复
4
提取重组 ' + $ ? A? I b a保存备用
G=4@ J /0 性的 FD ?
$ '融合蛋白分别与随机选择的超螺旋型质
4
1X !重组穿梭载体 ' + $ ? A的 K W鉴定 ! 以
/X G=4@ 粒 B+ J 2X 4及用 !$ 酶切质粒 B+ J 2X 4后
? I 1 #WE ? I 1
BU c 12 d 和 BU c 12 4为引物重组穿梭载体
Y Y 经胶回收纯化的线性化 ? I的结合活性 ? I与融
J J
为模板扩增 ' + $ ? A ? I片段 K W反应程序
G=4@ J 合蛋白的结合体系分为两组一组主要是超螺旋型的

/011211/ 郭海红等 ? A蛋白的真核表达纯化及其活性检测
@ 2

质粒 B+ J 2X 4另一组为线性化的 B+ J 2X 4
? I 1 ? I 1
结合体系中包含 200 %- ? I和不同量的融合蛋白
的 J
2V a结合 1 # 后加入上样缓冲液用 0XSe琼脂糖凝胶
电泳检测电极缓冲液为 0X ` ' 电压为 / LcG
7 M@ + 电
泳 1S # 后使用凝胶成像仪观察 ? I迁移情况
J
由于 6H 细胞中表达的 ? A蛋白存在过磷酸化修
3 @
饰这会降低 ? A蛋白与 ? I的结合活性因此我
@ J
们用 K * FD @
4KD 将 $? A融合蛋白去磷酸化并通过凝
4
胶迁移实验研究其与 ? I的结合活性
J
同时我们选用了与 FD @
$? A融合蛋白分子量相
4
近的鸡卵清蛋白作为对照通过凝胶迁移实验比较其
与 ? I的结合
J
图 '%重组质粒 ( *+ *.0 结构示意图
) , / #
- !
'%结%果 )2
1 '%;4*, , . 8 1 * 6:
.5 1 8 , 5=*28
.+ 9 9
8. 1*7 (*+ =( *+ *.0
567 , ? 1 ) , / #
- !
'$%全长 ! #基因的体外扩增及 ( *+ *.0
) , / #的
- !
'
'%重组穿梭载体 - 10
*. =! #的构建及鉴定
构建
将重组供体质粒 BCD E @
) + ? A转化 ! #%
' 4 $
用 K W扩增全长 ? A基因将 K W产物进行 1e
@
? 10' +
F 进行蓝白斑筛选挑取白色菌落 2 次划
琼脂糖凝胶电泳图 1 结果显示其大小约为 1X Q:
1
线纯化筛选获得白色阳性菌落小量制备重组
与全长 ? A基因大小相一致将所得到的 ? A基因
@ @
' + $ ? A? I
G=4@ J
的 K W产物进行胶回收纯化酶切后克隆于经同样酶

以 BU c 12 d 和 BU c 12 4为引物重组穿
Y Y
切的 BCD E 体中经 !$ c 双酶切鉴
) + 载
' #W '(=
梭载体为模板扩增 ' + $ ? A? I片段将 K W产
G=4@ J
定片段大小正确图 1: 选取两个酶切鉴定正确的
物进行 1e琼脂糖凝胶电泳图 2 结果显示其大小约
菌种送样测序与 J ' @ N -%* 上报道的 ? A基
E %) ] * D
* @
为 2X Q:与预期结果相符

因序列序列号JY^002V/X 相比较获得序列完全
2
一致的阳性重组质粒 BCD E @ 构建出 BCD E
) + ? A
' 4 ) +
' 4
? A供体质粒图 /
@

图 @%重组穿梭载体 - 10 ! B的 C E鉴定
*. =! # A D
)2
1 @%3 515,1 1
4 =71. 676: 567 ,
: *, 8. 1*7
- 10 ! B C E
*. =! # A F D
1 I B,$ ? IBN ) / ? IG N N 17000
G $* J
H= (=8+ :.K W J ?
Q*

图 $%( *+ *.0 质粒的构建
) , / #
- ! '
@%重组杆状病毒 B A G ! #的获得
. C 0
)2
1 $%3 5. + 9,
4 67, . 676: ) ,*.0
8 1 ( *+ / #
- ! 在无血清条件下用 ,*) E W * 脂质体
*H $ E *-%)
,+%
M G $+)% ( ? A -%*:.K W!1 K W BN ) H
#* B,$ $ H @ *
H( (=8+ ( 介导 ' + $ ? A? I转染生长状态良好的 6H 细胞
G=4@ J 3
? A -%* / ? I G N N? /000 ! : M N )+(
@ * J Q* #* * N )%
D$$ 逐日观察可以发现转染后细胞核和细胞直径明显增
$ %)$ )% ( )E @ B, G= ! 1 ? I G N N?
=* $+ $ HBCD + ? A $
H( ' 4 D J Q* 加部分细胞脱落而对照细胞生长良好表明已经获
17000 / W +G %
*( :$ %)BCD E @ B, G= i D=$ D = :.
) + ? A $ - )
' 4 D **
得重组杆状病毒 I J L ? A 图收集病变细胞的
+ K 4@
!$ '(= E
#WE %= E
E
上清培养液即为目的病毒液

中国生物工程杂志 %'( + , .
#$ $*#%( -
) ( L , J X /011
( 21 (1/
X

图 P%M + 融合蛋白的表达 Q5, 76,7
1! #
0 + 8 ? , 2
5 1
)2
1 P%3 55 8+ 676:91 8 5
4 O(5+1 :+67(6, 7
1
图 H%- 10 转染前后 HI 4的
*. =! #
M + Q5, 76,7
1! #
0 + 8 ? , 2
5 1
;J 细胞状态比较'KK L
:
M % D H $? A *BN D % 8D
#* , $ FD @ j * $
. D( 4 D( $ ( * $
%-G 8D %)#8G %
4
)2
1 H%D6( 1676: : .? : 5*7
*8 1
+ + 5+ 5
J ? 68 =
? A G %(, , $ =.! : M , $ ( $? A
@ ( + % %)
( :( #* % D HFD @
.D 4
*: 81: , 68 4 - 10
, 75 1
5 . 67: HI F *. =! #'KK L
*BN D % 8D
j * $ $ ( * $ $ ( + % $ =. 1 F
D( %-Y 8D %)FDG %(, , %)
4 ( :( ! *
U %H ) 6H +,! : E *) 6H +, H 5 # :. G=4
%$ * * 3 *D
+= , %H * 3 *D(
+= , N '+ $
+,, / 6H +,, $ 8)%H )% 2 6H +,,
* .)
, D* 3 * . ) ) $* $
, D *i #( +( 3 * .)
, D*
?A
@
* $ *)% H / # i) ) N ( :$ %)$ I J L? A
HN%H $ (
) +( N $ #* * G % Z 8D + K 4@
# + N
6H +,, HN %H )% H 5 # i) ) *( :$ %) $
3 * . ) ) $* $ (
, D ** +( N $ #*N G % Z 8D
# + N
'H%M +
1! #融合蛋白的表达
0
I J L? A 7 6H +,, HN %H )% H V/ # i) )
+ K 4@ 3 * . ) ) $* $ (
, D ** +( N $ #*
#
将病毒滴度较高的 K 代重组病毒 I J L ? A感
2 + K 4@
N ( :$ %) $ I J L? A
* G % Z 8D + K 4@
+ N
染 6H 细胞分别收集感染后 / #5 # 和 V/ # 的病变
3
6H 细胞及对照正常细胞超声波裂解后经 6? K O
3 64I @ '
N%M +
1! #融合蛋白的纯化
0
电泳考马斯亮蓝染色后发现在 ,
%* f 中均在约
S 加入非变性裂解液将收集的 6H 细胞裂解并通
3
70 Q? 处出现特异性蛋白质条带与预测的 ? A蛋白
@ 过 J4M -N *
$ I D 纯化柱来纯化 FD @
J ( $? A融合蛋白将
4
分子量相近而阴性对照中未出现图 7 分别以小鼠收集的洗液进行 6? K O
64I @电泳分析由图 V可见蛋
? A单抗和小鼠 FD
@ $单抗作为一抗1g
1000 稀释山白纯化的效果很好进一步通过 P*) % :,) 检测
D N ($
* )%-
羊抗小鼠 E
- W
OF K辣根过氧化物酶标记抗体作为二抗图 V: 证实了纯化的蛋白为 FD @
$? A融合蛋白
4
1g
7000 稀释进行 P*) % :,) 分析结果发现
D N ($
* )%-
在 , 2 f 中出现特异性条带表明重组病毒 ' + $
%* 7 G=4
? A感染的细胞表达的蛋白是 FD @
@ $? A融合蛋白并
4
且感染 5 # 的表达量要高于感染 / # 和 V/ # 的表达
量图 S

图 R%M + 融合蛋白的纯化
1! #
0
)2
1 R%C 8 1 1
91. 676:4 91 8 5 1! #
: *, ,5:+67(6, 7M +
1 0
( D , D $ %-
(G D*'8* )%$ !1 K( $ G N N / ,, 2
$ N*
)% Q* * .)
, D*
,B** C( 4 ( # 7 P# S @8 1 V @8 /
* ,)
, , , ) 8-
i #N D ,)* ,)*
5 @8 2! : P*) % :,) !1 ,, / ,B**
,)* D N ($
* )%- * .)
, D* * ,)
, ,
2 C( 4 ( # P# 1 7 P# / S @8 1 V @8
, ) 8-
i #N D D ,)* ,)*
/ 5 @8 2
,)*

图 N%M + 融合蛋白的表达考马斯亮蓝染色
1! #
0 '
P%M +
1! #融合蛋白与 ! B结合活性的研究
0 A
)2
1 N%3 55 8+ 676:91 8 5 1! #
4 O(5+1 :+67(6, 7M +
1 0
将纯化的 FD @
$? A融合蛋白原核表达纯化并复
4
1 K( $ G N N / F * , 2 6H +,, $ 8)
N*
)% Q* *+, . )
, D* 3 * .) )
, D *i #(
性的 FD ? ? A +N j,* $ ,? I :$ %-
$ '
4 @ . ) G% J
:( 4 N %=$
$ *)% 6H +,, * $ *)% H / # i) I J L? A
%H $
+( 3 * . ) HN%H $ (
, D* ) +( N $ + K 4@
#
N $ 同时与随机选择的超螺旋型质粒 B+ J 2X 4
*(
- % ? I 1
Z 8D 7 6H +,, HN %H )% H 5 # i) I J L? A
$
N 3 * . ) ) $* $ (
, D ** +( N $ + K 4@
#
Z 8D S 6H +,, HN %H )% H V/ # i) I J L? A
$
N 3 * . ) ) $* $ (
, D ** +( N $ + K 4@
# 及用 !$ 酶切质粒 B+ J 2X 4后经胶回收纯化的
#WE ? I 1
Z 8D
$N 线性化 ? I在 2V a孵育 1 #用凝胶阻滞实验来比较
J
FD @ FD ?
$? A $ '与 ? I 的结合情况电泳结果如
4 4 J

@ 7

图 5 所示主要有以下几个特点1 随着融合蛋白量形成的复合物说明 FD @
$? A融合蛋白与超螺旋型
4
的增多蛋白与 ? I结合形成的蛋白核酸复合物迁移
J ? I的结合明显强于其与线性 ? I的结合
J J
的距离逐渐缩短说明 FD @
$? A融合蛋白既可与超螺
4 2 FD @
$? A融合蛋白与 ? I结合形成的复合
4 J
旋型 ? I结合也可与线性的 ? I结合
J J 物其迁移距离远大于 FD ?
$ '与 ? I结合形成的复
4 J
/ FD @
$? A融合蛋白与超螺旋型 ? I结合形成
4 J 合物说明真核表达的 FD @
$? A融合蛋白与 ? I的结
4 J
的复合物迁移距离远大于融合蛋白与线性 ? I结合
J 合活性远大于原核表达的 FD ? @
$ '? A蛋白片段
4

图 I%M + 融合蛋白与 ! B结合活性
1! #
0 A
将 200 %-超螺旋型 B+ J 2X 4 样品孔 14 和 200 %-
? I 1 1/ 线性化的 B+ J 2X 4 样品孔 14 分别与不同量的 FD @
? I 1 /7 $? A和 FD ?
4 $ '融合
4
蛋白蛋白与 ? I的比值为070100/00700500 2V a孵育 1 #样品上样至 0X
J Se琼脂糖凝胶电泳后 @'染色用凝胶成像系统记录
结果
)2
1 I%B *? 16: 1! # 7 12 *. S1 T, A B
7 F++ M + 1=7 , , 1
0 1F 4! B U;
200 %- 8B* (* B+ J 2X 4 , 1 f
D N $= ? I 1
+, %* 1/ 200 %-$ B+ J 2X 4 , 1 f
%= , N ? I 1
%* %* /7 i N $ 8: = H 1 # 2V a i) 8) 4 ( i)
* %+ ) (
* * N ) $#( N $#
FD @ %= FD ? ) ( N( (70100/00700 500 ( K( $c J J , BN * +G ** i N % ]= ( 0X D *
$? A
4 $ ' G , N $ H
4 )D %= H N * ? I 8+ ( ( $ ( B, D *
)% * )% j * , * % Se -N *-,
. ( D
( * * :.* =$
%= :DN =
Z ) 8G:N $ )%$
#$ ( =*D $ %-
G

!!由于通过杆状病毒真核表达系统表达的蛋白存选用了与 FD @
$ ? A融合蛋白分子量相近并磷酸化的
4
在磷酸化修饰这将会影响蛋白与 ? I的结合因此
J 卵清蛋白作为对照分别将其去磷酸化后通过凝胶
我们将纯化的 FD @
$ ? A融合蛋白与用 K *
4 4KD 去磷酸迁移实验研究其与 ? I的结合活性电泳结果如图
J
化后的 FD @
$ ? A融合蛋白分别与 200 %-
4 超螺旋型质 10 所示随着 FD @
$ ? A融合蛋白和去磷酸化 FD @
4 $? A
4
粒 B+ J 2X 4在 2V a孵育 1 #用凝胶迁移实验分
? I 1 融合蛋白量的增加蛋白与 ? I结合形成的蛋白核
J
析磷酸化对 FD @
$ ? A融合蛋白与 ? I结合的影响
4 J 酸复合物迁移的距离逐渐缩短相反卵清蛋白及去
电泳结果图 3 表明用 K * ? A蛋白去磷酸
4KD 将 @ 磷酸化的卵清蛋白与 ? I孵育后其 ? I的迁移距
J J
化之后 FD @
$ ? A融合蛋白与 ? I结合的能力明显
4 J 离并未发生变化说明卵清蛋白不能与 ? I结合
J
增强说明磷酸化削弱了 ? A与 ? I的结合能力
@ J 从而进一步证实了 FD @
$ ? A融合蛋白与 ? I的结合
4 J
为了进一步证实 ? A与 ? I的结合能力我们
@ J 活性

S 中国生物工程杂志 %'( + , .
#$ $*#%( -
) ( L , J X /011
( 21 (1/
X

@%讨%论
@
$%M +
1! #融合蛋白的真核表达及纯化
0
本研究首先以实验室制备的 BY 1544@
? M? A为模
板对 ? A基因进行扩增并将其插入到杆状病毒 ' +
@ 4
M4 表达系统的 BCD E
(' + ) + 质粒中构建了 BCD E
' ) +
' 4
? A质粒将其转化 ! #%? 10' +
@ $ F 大肠杆菌后获

得重组穿梭载体 ' + $ ? A 用脂质体介导转染 6H
G=4@ 3
细胞产生具有强感染力的重组杆状病毒 I J L ? A
+ K 4@
用此重组杆状病毒感染 6H 细胞表达 FD @
3 $? A融合蛋
4
图 J%M + 融合蛋白与 ! B结合活性
1! #
0 A 白 6? K O
64I @和 P*) % :,)
D N ($
* )%-结果表明 I J L
+K 4
将 200 %-超螺旋型 B+ J 2X 与不同量的 FD @ 样品孔 14
? I 14 $? A
4 S
? A在 6H 细胞中成功地表达了 FD @
@ 3 $? A融合蛋白
4
和去磷酸化的 FD @ $? A融合蛋白样品孔 54
4 12蛋白与 ? I的比
J
值为070100/007005002V a孵育 1 #样品上样至 0X Se琼脂在非变性条件下利用 J4M D 表达的 FD
$ I -N *对
J ( $4
糖凝胶电泳后 @ '染色用凝胶成像系统记录结果 ? A融合蛋白进行纯化6? K O
@ 64I @和 P*) % :,)
D N ($
* )%-
)2
1 J%B *? 16: 1! # 7 12 *. S1
7 F++ M + 1=7 , ,
0 1F
结果显示获得了高纯度的 FD @
$? A融合蛋白
4
T, A B
14! B U;
200 %-D N $= B+ J 2X 4 i N %+ ) H 1 # 2V a
8B* (* ? I 1 *
+, *$ 8: = (
* N ) 在 FD @ 融合蛋白表达与纯化的 P*) %
$? A
4 DN
*
i) 8) 4 ( i) FD @ , 1 f =* D N = FD
$#( N $ $? A
# 4 %* S %= B#(B#( ,* $.) 4 :,) 检测中出现两条特异性 FD @
($
)%- $? A蛋白条带而
4
?A, 5f
@ %* 12 G , N $ (70 100 /00 700 500 (
) ( N( H
)D %= H
K( $c J J , BN * +G ** * % ]= ( 0X
N * ? I 8+ ( ( $ ( B, Di N
)% * )% j * , * %
. Se
F 细胞中只检测到一条 ? A蛋白条带我们认为
* @
D * ( * * :.* =$
-N *-, %= :DN =
( D Z ) 8G:N $ )%$
#$ ( =*D $ %-
G 与 F 细胞中一致的下面的条带为正常的 ? A蛋白
* @

图 $K%M + 融合蛋白与 ! B结合活性
1! #
0 A
将 200 %-超螺旋型 B+ J 2X 4与不同量的 FD @ 样品孔 14 卵清蛋白样品孔 S4 和去磷酸化的 FD @
? I 1 $? A
4 7 10 $? A融合蛋白样品孔 1/4
4
1S 卵清蛋白样品孔 1V4 蛋白与 ? I的比值为0/070100/00 2V a孵育 1 #样品上样至 0X
/1 J Se琼脂糖凝胶电泳后 @ '染色用
凝胶成像系统记录结果
)2
1 $K%B *? 16: 1! # 7 12 *. S1 T, A B
7 F++ M + 1=7 , , 1
0 1F 4! B U;
200 %-D N $= B+ J 2X 4 i N %+ ) H 1 # 2V a i) 8) 4 ( i) FD @ ,
8B* (* ? I 1 *
+, *$ 8: = (
* N ) $#( N $ $? A
# 4 %*1 f7 $ *- ,
, % -
:8G %*S f10
%=
=* D N = FD @ , 1/ f =* D N = $ *- ,
B#(B#( ,* $? A
.) 4 %* 1S B#(B#( ,* , % -
. ) :8G %*1V f G , N $ H
/1 ) ( N ( 70 100 /00 ( K( $c J
)D( %= H N* ? I
)%
J , BN * +G ** i N % ]= ( 0X D * ( * * :.* =$
8+ ( ( $ ( B, D *
* )% j * , * % Se -N *-, %= :DN =
. ( D Z ) 8G:N $ )%$
#$ ( =*D $ %-
G

@ V

条带上面的条带则可能是由于 ? A蛋白在 6H 细胞
@ 3
参考文献
中不同的翻译后修饰造成的
@'%M +
1! #融合蛋白与 ! B结合活性的研究
0 A 1 F FO 6+ ,% E O8D * , #*=$N $ ( #*
8 #(* N D )
) M D$ ( H)
):8)%
? A BN * $ G G + ( %'(#* '( DW D
@ ( $ % G ,% #N )
)% $ G $ $ G $
+ B#. *
凝胶迁移阻滞实验 @ 6I * + ( N $ ( ,.
Y 4 *) B#( )
, N *+G :$)
$
G 8% /00V 275 10054
(G 101
D HD. 是研究 ? I与蛋白质相互作用的一种特殊
#$ D
) J
/ P M ' Q Y W+ * * , N ) *D +$
, %% + $ NJ )
=G #) 6) 8N B*$+
8+ 4 H
的凝胶电泳技术其原理为在凝胶电泳中裸露的
:$ %-( #*BN (( (*
%=$ H) ( 4 -%*BN * ? A ) J J ,+
) %+ ( $ @ (? I 8+ $
)% *
? I朝正电极移动的距离同其分子量的对数成反比
J
I $ W D /002 21/2 V0024
+=D * V010
如果 ? I分子结合上一种蛋白质那么由于分子量加
J 2 P M @ Q* + ' Q Y * , #*8:$ )
, %% + N # + )
=G $ M T8$8D
(
大在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞朝正电极移动 + ( % BN * ? A* ) D8+ * H J
#N ) ( $ @ ,N #* ) ) ( ? I:. %) =8+
G $ )% )D N 8N $N $
( %-
的距离也就相应缩短了所以当特定的 ? I片段同
J B($Z D N $ k '( G /00/ /VV /5
D$ 8B* (D
)* +, $, #*

蛋白质混合之后若其在凝胶电泳中的移动距离变小 /3554
/33
P M 6+ ,% E A BB* C * #* @ ( $
, %% #(* D ) ,
=G ) M ? ABN * %
)%4
了就说明它与蛋白质分子发生了结合作用

:8%= 8:$ )
%) %= T8$8D+%D) %)( G ,% + ( %
( ( )8* HG G #N )
$ $ G $
在本研究中如果融合蛋白与 ? I结合由于分
J
O %* /00 221 14
* 3
子量增加造成其迁移距离缩短相反如果蛋白与
7 Z% %=* Y CN N Y Z% ' 6 * M
( $ N ( (
% %* = , ) , #*

? I不结合其迁移距离不会出现变化
J ) %D +)% S3 D+ ) i) D +$ 8:)
N , (
( $ D $* $
(= # B*$+D . H + *
H B*( 8)
通过凝胶迁移阻滞分析实验 @ 6I 我们发现
Y G * $ , G N 8, % ) 8D % ( )(-%* =*
( 8Q* $ * )
.,= * D D$ #*H $ H i * D Q %=
(
与原核表达纯化并复性的 FD ? @
$ '? A蛋白片段相
4 +% ) *BN D % ( #$* + , GD +$ =* +%
%= #* j * $ H + G N *
D( $ 8Q* $ B*$+ Q4
4 H
比真核表达纯化的 FD @
$? A具有相类似的特点都可
4 G J Y , * '( 133/ 1/ 1S5V4
W I ( , $
, , 1S3V

以与超螺旋型及线性化的 ? I结合但更倾向于与超
J S 6(Q ? Z% %=* Y ? * % 6 * M
*N % ( $ N
G % %* ) , #*

) %D +)% S3 B/2T2 D i +%D) N N %-G %)
N , (
( $ #( D ( $* * N * *
D %)
螺旋型 ? I相结合同时真核表达的 FD @
J $? A融合蛋
4
()( * D %= =*%* ., (H Z =$ N N $ D +$
Hi -%* H D G * BN $N $ D =* i) B*$+
$ ( ,* )* ( # H
白活性明显要高于原核表达的 FD ?
$ '片段这是由
4
+%$ ,*) *'(= 133/ V311 /3304
, + H 8N
$ D , ( /33V
于真核表达系统表达的蛋白比原核表达的蛋白更接近
V ? %-h P A :$
( %-k NCJ * , 8) %) =$ (? A
)I ( $ *
:( D) @
于天然蛋白质活性更高另外FD @
$? A融合蛋白含有
4 ( ( ( $ $ #8G % $ , G ) .=$ * N $DW 8G
%+BN * %
)% %HG N D DI) ) #*
( * #N$
? A蛋白的两个 ? I 结合域一个是位于中心的
@ J /000 21 574
32
6I c C? I结合域另一个是位于羧基端的 ? I结
K 6I J J 5 6$ iQF P$$ DA W 6]NE6 * #*B8)$
* Q( D
N ,
,G * ), M Z
)*

合域而 FD ?
$ '融合蛋白片段仅含有羧基端的 ? I
4 J ( ( ( $ ? A B ( #$* BN * D+ ) i) 8)
%+BN * @ N H + G N ( $ D $* $ + *
)% ) )% (= #

结合域 G * $ , * $ $ % (%)* $ ; * , #* $
.,= * G D 8) $ % % 8Z%$
( 8Q - *N 8G )=
(
#N$ , @ B E G , 1332 32 274
N $D $ j G 8%(
) ) % 23
由于 6H 细胞中表达的蛋白存在磷酸化修饰这会
3
3 ? %-h Y + , Y I P * 8) %) =$ ) @
( $ $#*D %-k ) ,I ( $ * (? A
:( D
降低 ? A蛋白与 ? I结合的活性因此我们选用
@ J 4
( ( ( $ $ B* i) DD G+,
%+BN * %
)% )%) $ .) $ 8B8D* ) G ) 8D
$ # * N #* D %=
. (
K * ? A蛋白进行去磷酸化结果表明去磷酸化
KD 对 @
DN $ D I) $D #* 1335 15 17074
( $ N ) W 8G
+ =( D #N$ 1710
的 FD @
$? A融合蛋白与 ? I的结合能力增强
4 J 10 P$ E W D ,] J O N ( %( k W *
+ %%
#G * =$
B $ ]
+4 ) ,

为了进一步证实 ? A与 ? I的结合能力我们选
@ J I (%) =$ ) ? A( ( ( $ $ D ) $ 8B8D N#* D
8) $ * ( @ %+BN* % . * +, * ) G ) 8D
:( D )% DG . (
用了与 FD @
$? A融合蛋白分子量相近并磷酸化的卵清
4 6 , @B EG ,/000 11327204
@ $ j G 8%(
% 72/

蛋白作为对照分别将其去磷酸化后通过凝胶迁移阻 11 I*$ DL P M I N % k * , M
,
j =$ , %% %=* * ) #*BN *
=G D ($
)%

滞实验研究其与 ? I的结合活性结果表明卵清蛋
J * ( = :.)
%+=* #*BN (( (*
( 4 -%*? A + %-D) ( , .(
) %+ @ # * #*) ( H
B( -
+ ( % N * #**$* .( J N $ )% $
#N ) %= * D) H+ %+ H? I * + $ %
G $ =8+ H$ B,(
白及去磷酸化的卵清蛋白不能与 ? I结合这进一步
J
+ ( %4 +$ G %%* O %* ? Z /000 1 11
#N ) D $+ N * D *
G $ B* H
证实了 FD @
$? A融合蛋白与 ? I的结合活性
4 J
12054
121/
综上所述本研究利用杆状病毒真核表达系统成
1/ A BB* C C#N A = 8D Y 6 * @ $
D * Nk #( =( ) ), ? A DB(
,.
功表达并纯化出具有生物学活性的 ? A蛋白为进一
@ I KN D +B) % B) $ %= G =$* *$ *)
? 4:(* +* (
$ N$ B( ( D
D * DN D %+ (
) D)
步进行癌基因 ? A的功能研究奠定了必要的物质
@ -%( j ) D ( ,'( /005 /510 2/74
* ) $ N D , * $
( +D* Y , , 2/7V
基础 12 G ,D O N Y I L , Z D * N + B)%
B$( Y $
, + $ (C ) , N $ ,
=$* M %D $ (

5 中国生物工程杂志 %'( + , .
#$ $*#%( -
) ( L , J X /011
( 21 (1/
X

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+Z)%
$ $ K/B#$ ( = :.) %+-%*? A
DG =8,*
) #*( (* @ // 6(N
D Y m%$ Y + N # * , %) % N (
* *NA Q* ) )
* E N * Z,
( G
J ,+I $ W D /002 217 17V14
8+ $ +
* =D * 17V7 N N BN H %- H /I c D $ D* *(%$( :. @
* * ( N =$ ( U C2n + $ N - )%
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1 C8, NJ @ F,%-N k Y Y N Z] ? Y K( $
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$ *
* 13S7
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D )*
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*N ) 551
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* B* N * N ? )
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N 8=. N F * ,
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* , $
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* $ ) *8,$ H#$(
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$ $ $ #*BN=8+ ( ) @ 102 1/524
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$ , , V713
$ G J j N %( * *G =$* G J
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) ) +. G 20 华颖胡红刚彭向雷? A蛋白末端 ? I结合域的原
@ J
/001 /01V 35V4
33V 核表达纯化及其与 ? I的结合活性中国生物工程杂志
J
/1 Y O N .M W D%$
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+* /003 /35 14
15
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15
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致谢
近期为本刊审稿的专家按姓氏笔划排列
马亚兵!孔德领!毛建平!王友信!王佑春!王金星!王健伟!王静云!丛!威!卢文玉
史兆兴!叶志强!田建卿!石继红!刘天庆!刘庆平!刘志敏!刘佳佳!刘建国!刘维一
江!宁!许文涛!邢建民!吴!洁!宋思扬!宋锡瑾!张兆山!张余洋!张春义!张艳丽
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徐香玲!钱世钧!顾!军!崔!磊!曹泽虹!梁前进!黄国亮!韩文玲!蒲小平!解!军
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