Presentazione di Seradeg al meeting Spettrometria di Massa in Liguria, 2019

1. Paolo Romano (e altri)
{paolo.romano@hsanmartino.it}
Spettrometria di Massa e Proteomica
Direzione Scientifica
IRCCS Ospedale Policlinico San Martino, Genova

2. "Ha senso utilizzare campioni di siero
crio-preservati per lungo tempo in
studi retrospettivi che coinvolgano
il peptidoma, da alcuni considerato
spazzatura biologica?"
"Scusa?"

3. "Negli studi retrospettivi, uno degli
aspetti più critici è la qualità dei
campioni conservati".

4. "Già nel 2011, abbiamo analizzato la
qualità dei campioni criopreservati"

5. (Mangerini et al., Anal. Biochem. 2011)
"Campioni freschi e campioni conservati a
-80°, ottenuti dallo stesso prelievo, sono
stati confrontati tra loro e con campioni
conservati a lungo a -20°."

6. (Mangerini et al., Anal. Biochem. 2011)
"Abbiamo trovato differenze
significative, evidenti anche
graficamente."
"Alcuni segnali evolvono nel
tempo: segnali presenti
inizialmente si riducono o
spariscono nel processo di
degradazione, dando vita a
nuovi segnali."

7. "Il materiale utilizzato dovrebbe quindi essere
sottoposto rigorosamente allo stesso tipo di
conservazione: stesse durata, temperatura,
etc... . In questo caso, si potrebbe ipotizzare che
gli eventuali fenomeni di degradazione
abbiano riguardato tutti i campioni in egual
misura."
"Questo consentirebbe di aver un'indicazione sia
della quantità di proteina progenitrice presente
al momento del prelievo, sia delle attività
peptidasiche intrinseche del campione."
"La realtà è però molto diversa. Raramente i campioni vengo
sottoposti rigorosamente alla stessa procedura. Ancora meno i
campioni di donatori volontari per i controlli."

8. "No, i campioni biologici che hanno un
follow up pluridecennale sono
estremamente preziosi!"
"Dobbiamo trovare un metodo per
valutare la degradazione ed estrarre
l’informazione residua correttamente."
"Allora non li utilizziamo…."

9. "L'attivazione si basa sul taglio di
due coppie di piccoli peptidi
all'estremità N-terminale delle
catene α e β: i fibrinopeptidi A
(fpA) e B (fpB)."
"Durante la coagulazione,
il fibrinogeno viene
attivato dalla trombina.
Questo porta
all'attivazione di due siti
criptici che avviano alla
formazione del reticolo
di fibrina."

10. Cryopreserved
Fresh
1,350.62
1,465.65
Cryopreserved
"I fibrinopeptidi sono molto
sensibili alla degradazione
ad opera di endo- / eso-
peptidasi."
"La figura si riferisce a campioni
fresco e crioconservato dello
stesso donatore."

11. "La differenza tra le percentuali medie delle varie forme del
fibrinopeptide A tra campioni freschi e crioconservati mostra
la diminuzione nei campioni criopreservati delle forme
meno degradate e l'aumento di quelle più degradate."

12. "La correlazione tra quantità totale di fpA e percentuale
delle specie meno degradate rispetto al totale è
evidente e significativa."
p < 0.0001

13. "Ho capito. Quindi, si tratta di:
• analizzare gli spettri di massa,
• valutare il contenuto di fpA,
• e assegnare una valutazione qualitativa. "
"Il fibrinopeptide A si degrada molto rapidamente, ed è
quindi plausibile che se lui risulta ben conservato lo siano
anche la maggior parte delle altre specie."
"Quindi, si potrebbe valutare la qualità dei sieri verificando
quanto fibrinopeptide A vi è contenuto e la distribuzione
dei suoi frammenti a basso e alto peso molecolare."
"Maggiore è l'abbondanza complessiva e più elevato è il
contenuto dei frammenti ad alto peso molecolare,
migliore è la qualità."

15. Ambiente di sviluppo (LAMP)
• Sistema Operativo Linux (Ubuntu 14.04 LTS)
• Web Server Apache (Apache/2.4.7)
• Database MySQL (5.5.62)
• Linguaggio PHP (PHP/5.5.9)
Obiettivi
• Formato dati di semplice realizzazione (solo testo, due colonne)
• Dati locali (PC utente) o remoti (per prove ripetute)
• Sito bioinformatics.hsanmartino.it (server virtuale Azure, SIA)
• Accesso tramite qualunque browser (Chrome, IE, Mozilla, …)
• Accesso 'open' (senza registrazione, né limitazione d'utenza)

16. Input
• Spettri da analizzare (MALDI/ToF )
• Uno spettro di riferimento di qualità adeguata
Output
• Abbondanza e proporzioni relative dei frammenti fpA
• Indice qualitativo della degradazione (SeraDeg Quality Score - SDQS)
• Visualizzazione degli spettri intorno ai picchi relativi ai frammenti
Tre interfacce
• Upload (per analisi ripetute sugli stessi dati)
• Analyse (per analisi dei dati già trasferiti)
• Upload and analyse at once (per analisi dei dati senza trasferirli)

17. Pre-elaborazione degli spettri
• Filtraggio degli spettri
• Estrazione dei picchi significativi
Analisi dei frammenti fpA
• Ricerca ed estrazione dei picchi relativi a fpA
• Ricerca delle repliche isotopiche
• Ricerca delle molecole confondenti e correzione delle abbondanze
• Computo dell'abbondanza generale e relativa al riferimento
• Determinazione dello score qualitativo

18. Frammenti peptidici del fibrinopeptide A
Peptide [M+H]+ Sequence
fpA(8-16) 905.47 FLAEGGGVR
fpA(7-16) 1,020.51 DFLAEGGGVR
fpA(6-16) 1,077.52 GDFLAEGGGVR
fpA(5-16) 1,206.57 EGDFLAEGGGVR
fpA(4-16) 1,263.59 GEGDFLAEGGGVR
fpA(3-16) 1,350.62 SGEGDFLAEGGGVR
fpA(2-16) 1,465.65 DSGEGDFLAEGGGVR
fpA – H2O 1,518.68 ADS(-H2O)GEGDFLAEGGGVR
fpA 1,536.69 ADSGEGDFLAEGGGVR
fpA + P 1,616.65 ADSpGEGDFLAEGGGVR

19. Basso m/z, sieri
più degradati
Alto m/z, sieri
meno degradati

23. Visualizzazione dei risultati
Pagina sintesi con valori per tutti gli spettri
• SDQS (SeraDeg Quality Score): da 1 a 4 stelle, da rosso a verde
• abbondanza fpA totale e dei singoli frammenti
• valori normalizzati rispetto a uno spettro di riferimento
Pagina dettagliata per ciascuno spettro
• Visualizzazione grafica dello score
• Distribuzione abbondanze frammenti fpA
• Grafici dello spettro nei pressi dei picchi relativi ai frammenti fpA
Download dei risultati
• Tabella sintetica (formato MS Excel)
• Risultati intermedi (archivio compresso ZIP)

31. Interfaccia web
http://bioinformatics.hsanmartino.it/seradeg/
Help
http://bioinformatics.hsanmartino.it/seradeg/help.php
Articolo
Romano P et al. (2018) A mass spectrometry based method
and a software tool to assess degradation status of serum
samples to be used in proteomics for biomarker discovery.
Journal of Proteomics. 173:99-106.
PMID: 29242081; DOI: 10.1016/j.jprot.2017.12.004

32. Aldo Profumo
IRCCS Ospedale Policlinico
San Martino, Genova
Paolo Romano
IRCCS Ospedale Policlinico
San Martino, Genova
Maider Beitia San Vicente
Università dei Paesi Baschi
Bilbao
Grazie per l'attenzione!