Sansoken 117.04

2. 第 15 回厚生科学審議会科学技術部会
ヒト幹細胞を用いた臨床研究の在り方に関する専門委員会
議事録
平成 15 年 11 月 28 日（金） 13:30 〜 15:30
厚生労働省 ５階 共用第７会議室
○ 中畑委員長
それでは、第 15 回の専門委員会を開催したいと思います。
前回の委員会で今後の進め方について御議論いただきまして、審査体制、安全性、倫
理と３つに分けて集中的にやっていこうという方針が決定されまして、前回は審査体制
について集中的に御議論いただいたわけですが、その中で中央審査の在り方について、
実際に処理できるのかどうかという問題があって、その部分だけ積み残しになっており
ます。それについては資料等を整えているところですので、年明けにその点についてだ
け御議論いただきたいと思います。
本日は予定どおり２番目の安全性について集中的に議論していただくことになってお
りますので、その形で進めていきたいと思います。安全性の確保については最終確認と
いうところまでもっていけたらと思いますので、ご協力のほどよろしくお願いいたしま
す。
本指針の作成にあたって、特に細胞を加工する際の安全性について以前から議論があ
るわけですが、その際に、医薬品の安全基準が表裏一体となってまいります。この点に
つきましては薬事法が改正されまして、その指針と整合性がないといけないということ
もありますので、最初に医薬食品局から改正薬事法について御説明いただきまして、そ
の上に立って議論を進めていきたいと思います。
それでは、医薬食品局から新しく改正されました薬事法の生物由来製剤に関する安全
基準についてお話しいただきたいと思いますので、よろしくお願いします。
○ 医薬食品局
医薬食品局審査管理課の佐藤でございます。

3. 間葉系幹細胞増殖培地の検討

4. 間葉系細胞の供給源間葉系細胞の供給源
骨髄骨髄
多指症多指症
子宮内膜子宮内膜
内膜幹細胞内膜幹細胞
月経血月経血
臍帯血臍帯血
胎盤胎盤
ESES 細胞細胞
OP9OP9 細胞フィーダー上細胞フィーダー上
死亡胎児死亡胎児
胎児心筋胎児心筋

5. 検体肉眼像および組織
像
HE x100 HE x200 HE x200
Type II collagen

6. 軟骨培養細胞の形態像 (Papanicolau 染色、各倍率 200 倍 )
P0 P1
P10
p16 免疫染色

7. P0 軟骨細胞皮下移植 ２週間後

8. 軟骨培養細胞皮下移植 ２週間後
初代培養細胞移植 初代培養細胞移植、浮遊組織を再移植 一回継代細胞移植
初代培養細胞 HE ｘ
1.25
初代培養細胞 TB ｘ 1.25初代培養細胞 HE ｘ 200

9. 間葉系幹細胞
拡大培養に要求される３つの特性
・安・安
全全
・迅・迅
速速
・大・大
量量
再生治療

10. 血清の役割
・増殖因子
・微量元素
・脂質成分
・脂質、鉄等のキャリアー
・抗酸化作用
・細胞接着性の向上
・細胞毒性物質の中和
増殖培地＝血清（牛胎児）＋基礎培地

11. ○ 寿命延長化ヒト骨髄由来間葉系幹細胞で組成検討
○ 初代細胞へ適用
・ UEET １２ ← E ７、 E ６、 TERT 導
１．基礎培地
２．増殖因子
３．ホルモン、微量元素その他

12. 基礎培地の最適化
MEM
MEM+
aMEM
aMEM+
DMEM
DMEM+
IMDM
NCTC109
F12
D:F12
F12/Ca
D+:F12
F10
D:F10
F10/Ca
MDCB105
D:105
MCDB110
D:110
MCDB131
D:131
MCDB153
D:153
153/CA
D:153/Ca
MCDB201
D:201
0 50 100 150 200
Cell Growth(%,ëŒÇlÇdÇlî‰)
UEET-12/3%FCSë∂ç›â∫

13. EGF
100
30
10
3
1
PDGF
100
30
10
3
1
bFGF
100
30
10
3
1
aFGF
100
30
10
3
1
LIF
100
30
10
3
1
HGF
30
10
3
1
IL6
10
3
1
0.3
0.1
VEGF
30
10
3
0 50 100 150 200 250 300
Cell Growth(Åì,ëŒÇfÇeñ≥ìYâ¡î‰Åj
ëùêBàˆéqÇ…ÇÊÇÈëùêBë£êiå¯â ÅiÇtÇdÇdÇsÅ|ÇPÇQÅj
増殖因子の最適化
◎ PDGF,EGF, ｂ FGF, ａ FGF ／○ LIF ／△ VEGF,HGF
（ ng/ml ）

14. PDGF
EGF
LIF
VEGF
P+E
P+L
P+V
P+E+L
P+E+V
P+L+V
0 50 100 150 200 250 300 350
Cell Growth(%,ëŒGFñ≥ìYâ¡î‰)
UEET-12Å@ëùêBàˆéqÇÃëgçáÇπ
複数の増殖因子により相乗効果が得られる。

15. b
PA
PB
hP
bPA
bPB
bhP
bPAB
a
E
V
Pa
PE
PV
ab
bE
bV
aE
aV
EV
-
0 100 200 300 400 500 600 700 800
mAbs=450nm
12/54-143/04.7.20
b
PA
PB
hP
bPA
bPB
bhP
bPAB
a
E
V
Pa
PE
PV
ab
bE
bV
aE
aV
EV
-
0 50 100 150 200 250
mAbs=450nm
M/9-13/04.7.21
b
PA
PB
hP
bPA
bPB
bhP
bPAB
a
E
V
Pa
PE
PV
ab
bE
bV
aE
aV
EV
-
0 100 200 300 400 500 600
mAbs=450nm
13/37-72/04.7.26
b
PA
PB
hP
bPA
bPB
bhP
bPAB
a
E
V
Pa
PE
PV
ab
bE
bV
aE
aV
EV
-
0 50 100 150 200 250
mAbs=450nm
1/p9/04.7.26
b
PA
PB
hP
bPA
bPB
bhP
bPAB
a
E
V
Pa
PE
PV
ab
bE
bV
aE
aV
EV
-
0 100 200 300 400 500
mAbs=450nm
H10-8/13-19/04.7.26
b
PA
PB
hP
bPA
bPB
bhP
bPAB
a
E
V
Pa
PE
PV
ab
bE
bV
aE
aV
EV
-
0 50 100 150 200
mAbs=450nm
7/p68/04.7.28

16. クローンによる反応性の違い
・無血清化の戦略→複数のクローンで検討
・クローン選択的培地→目的細胞の培養

17. 0 0.5 1 2 10
FCS(%)
0
20
40
60
80
100
120
C
e
l
l
G
r
o
w
t
h
(
%
,
ëŒ
ÇP
ÇO
Åì
F
C
S
î|
ín
î‰
P
PL
PLV
MSCGM(10%FCS)
UEET-12Å@ñ≥ååê¥î|ó{
改良培地は無血清下でも血清含有培地と同等の増殖性を有する

18. 1053210.50
FCS(%)
0
50
100
150
200
C
e
l
l
n
u
m
b
e
r
(
%
,
ëŒ
1
0
Åì
F
C
S
No Coat
Fibronectin
UEET-12Å@ç◊ñEê⁄íÖê´
接着性の低下は 1 ％血清の添加で補われる。

19. ○ 寿命延長化ヒト骨髄由来間葉系幹細胞で組成検討
○ 初代細胞へ適用
低血清ヒト型間葉系幹細胞増殖培地 確立

20. 間葉系幹細胞のヒト型低血清培地を作製した。
改良培地で通常の１００倍の細胞量を得た（２週間培養

21. 間葉系幹細胞
拡大培養に要求される３つの特性・安
全
・迅
速
・大
量
再生治療

22. 分
裂
回
数
時間
M0
M1
M2
クライシス
培養ストレス
テロメア短縮、
DNA 障害
テロメア消耗 ,
ゲノム不安定化
不死化
p16↑
p53,Rb 経路
テロメアーゼ↑
活性酸素、熱ショック、浸透圧 など
＜目標＞ 培養ストレス与えずテロメア限界まで培養で
きる培地
＜戦略＞ p16 発現抑制

23. ｐ１６ INK ４ a ／ｐ 14ARF 遺伝子領域
ｐ１６ INK ４ a
Cdk4/6
サイクリン
D
Rb
E2F
ｐ１４ ARF
MDM2(HDM2)
ｐ 53
ｐ 21
Cdk2
サイクリン E
細胞増殖
リン酸化 Rb
E2F

24. ＭＳＣＧＭ X
ｐ１６ＩＮＫ４ａ
β‐ ｔｕｂｕｌｉｎ
培地 X ではｐ１６ＩＮＫ４ a
発現上昇がみとめられる
蘇生後の継代 １ １ ２ ２ ３ １ １ ２ ２ ３
0 5 10 15 20 25
day
8
10
12
14
16
18
20
22
P
D
L MCSGM
X
MSC

25. なぜ培地 X で p16 の発現が高いのか？
Q

26. ｐ１６ＩＮＫ４ａ
β‐ ｔｕｂｕｌｉｎ
ｐ１６ＩＮＫ４ａ
β‐ ｔｕｂｕｌｉｎ
o oo ooo oox oooo ooox ooxo ooxx ox oxo oxx oxxx oxoo
x xx xxx xxo xo xox xoxx xoo xoox xooo xoxo
○ → MSCGM 、 × → 培地 X
ｈ MSC （ P-7)
培地 X ×
MSCGM ○
培地 X ○ ×
MSCGM ○○
培地 X ××
MSCGM ×○
○○○
○○×
○×○
○××
×○○
×○×
××○
×××
培地により p16 発現は変動する。

27. ｐ１６ＩＮＫ４ａ
β‐ ｔｕｂｕｌｉｎ
X ＋ FCS -IT
+FCS
-IT -PDGF
- ｂ FGF
-EOP -Sel -P,b
+FCS
-P,b MSC
p16 誘導の主要要因は PDGF, ｂ FGF である。

28. ｐ１６ＩＮＫ４ａ
β‐ ｔｕｂｕｌｉｎ
X-P,b X-P,b/10%FCS MSCGM
PDGF+bFGF(ng/ml) 0 1 10 0 1 10 0 1 10
ｂＦＧＦ，ＰＤＧＦが p16 発現を誘導する。

29. PDGF ＋ｂ FGF によりｐ１６発現が上昇
なぜ培地 X で p16 の発現が高いのか？
Q
A

30. MSC bFGF P-AA
P-BB
P-AB
+bFGF
P-AA,BB
P-AA
P-BB
P-AB
PDGF
-AA
PDGF
-AB
PDGF
-BB
A 鎖 B 鎖
β ﾚｾﾌﾟﾀｰ
CD140 ｂ
α ﾚｾﾌﾟﾀｰ
CD140 ａ
Greb ２
Nck
Ｒａｓ -
GAP
Crk
Src
SHP2
PLC- ｒ
PDGF-AA→Competent Factor
PDGF-BB→Competent and Proguression Factor
IgG CD140a CD140b
p16
βtubulin
― ＋
MSC の p16 発現は PDGF-B 鎖による。
( 細胞 /H10 8)‐

31. M
SC
aFG
F
bFG
F
EG
F
VEG
FPDG
FPDG
F+aFG
F
PDG
F+bFG
F
PDG
F+EG
F
PDG
F+VEG
F
aFG
F+bFG
F
aFG
F+EG
F
aFG
F+VEG
F
bFG
F+EG
F
bFG
F+VEG
F
EG
F+VEG
F
H
eLa
p16p16
βtubulinβtubulin
H4- 3
Normal dFlags Raw Common Description
1.0818335 P 2172.2 egfr epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v- erb- b) oncogene homolog,avian)
1.1522822 P 657.3 egfr epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v- erb- b) oncogene homolog,avian)
0.6146532 A 337.2 egfr epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v- erb- b) oncogene homolog,avian)
0.8937527 A 17.8 egfr epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v- erb- b) oncogene homolog,avian)
1.0583736 A 167.9 egfr epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v- erb- b) oncogene homolog,avian)
0.8768445 A 358.1 egfr ErbB1- S;Human epidermal growth factor receptor precursor (EGFR) mRNA,complete cds.
1.0504522 A 10.4 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria- expressed kinase,keratinocyte growth factor receptor,craniofacial dysostosis1,Crouzon syndrome,Pfeiffer syndrome,Jac
0.7824624 A 21.5 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria- expressed kinase,keratinocyte growth factor receptor,craniofacial dysostosis1,Crouzon syndrome,Pfeiffer syndrome,Jac
0.417403 A 9.8 fgfr3 fibroblast growth factor receptor 3 (achondroplasia,thanatophoric dwarfism)
0.54518497 A 27.2 fgfr3 fibroblast growth factor receptor 3 (achondroplasia,thanatophoric dwarfism)
1 A 38.3 fgfr4 fibroblast growth factor receptor 4
1.2821407 A 125.7 fgfr1 fibroblast growth factor receptor 1 (fms- related tyrosine kinase 2,Pfeiffer syndrome)
1 P 652.2 fgfr1 fibroblast growth factor receptor 1 (fms- related tyrosine kinase 2,Pfeiffer syndrome)
1.4052641 A 14.3 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria- expressed kinase,keratinocyte growth factor receptor,craniofacial dysostosis1,Crouzon syndrome,Pfeiffer syndrome,Jac
0.75333506 A 59.2 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria- expressed kinase,keratinocyte growth factor receptor,craniofacial dysostosis1,Crouzon syndrome,Pfeiffer syndrome,Jac
1.3886433 P 124.5 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria- expressed kinase,keratinocyte growth factor receptor,craniofacial dysostosis1,Crouzon syndrome,Pfeiffer syndrome,Jac
1.1120172 A 13.6 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria- expressed kinase,keratinocyte growth factor receptor,craniofacial dysostosis1,Crouzon syndrome,Pfeiffer syndrome,Jac
1.0663294 P 2619.3 fgfr1 fibroblast growth factor receptor 1 (fms- related tyrosine kinase 2,Pfeiffer syndrome)
1 A 11.1 fgfr4 fibroblast growth factor receptor 4
1.1922568 A 46.9 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria- expressed kinase,keratinocyte growth factor receptor,craniofacial dysostosis1,Crouzon syndrome,Pfeiffer syndrome,Jac
3.1074321 A 73.5 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria- expressed kinase,keratinocyte growth factor receptor,craniofacial dysostosis1,Crouzon syndrome,Pfeiffer syndrome,Jac
1 A 67.3 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria- expressed kinase,keratinocyte growth factor receptor,craniofacial dysostosis1,Crouzon syndrome,Pfeiffer syndrome,Jac
1 A 8.2 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria- expressed kinase,keratinocyte growth factor receptor,craniofacial dysostosis1,Crouzon syndrome,Pfeiffer syndrome,Jac
1.3065747 P 3125.7 fgfr1 fibroblast growth factor receptor 1 (fms- related tyrosine kinase 2,Pfeiffer syndrome)
3.3271298 P 4049.1 pdr bplatelet- derived growth factor receptor,beta polypeptide
1.0704594 P 4990.3 pdr aplatelet- derived growth factor receptor,alpha polypeptide
1.0662563 P 366.9 pdr lplatelet- derived growth factor receptor- like
0.8164289 A 6.2 pdr aplatelet- derived growth factor receptor,alpha polypeptide
2.3044996 A 403.1 pdr aplatelet- derived grow
0.6091959 A 19.5 flt4 fms- related tyrosine kinase 4
1.7572612 A 61.6 kdr kinase insert domain receptor (a type III receptor tyrosine kinase)
aFGF-R ○
bFGF-R
○
EGF-R
◎
VEGF-R
×
PDGF-R
◎
受容体の有無
p16 発現は増殖因子の
種類による。

32. b
PA
PB
hP
bPA
bPB
bhP
bPAB
a
E
V
Pa
PE
PV
ab
bE
bV
aE
aV
EV
-
0 20 40 60 80 100 120
mAbs=450nm
MSC äeëùêBàˆéqÇ…ÇÊÇÈëùêBå¯â

33. 細胞増殖に都合の良い増殖因子ほど p16 の発現を誘導する？
相関係数：
０．７０0 50 100 150 200 250
cell growth
0
20
40
60
80
100
120
p
1
6
p16/cell growth

34. 増殖因子によるｐ１６発現上昇
→ 他細胞ではどうか？

35. 毛乳頭細胞
角化表皮細胞
HUVECHUVEC
（ヒト臍帯静脈内皮細胞）（ヒト臍帯静脈内皮細胞）
HBECHBEC
（ヒト気管支上皮細胞）（ヒト気管支上皮細胞）
HDPCHDPC
(( ヒト頭髪毛乳頭細胞ヒト頭髪毛乳頭細胞 ))
44 55 66 77 88 99 1010 111144 55 66 77 88
44 55 66 77 88 99 1010 1111
PassagePassage
PassagePassage
p16p16
22 33 44 55 66
HEECHEEC
(( ヒト食道上皮細胞ヒト食道上皮細胞 ))
PassagePassage
33 44 55 77 1010 1313 1717 2020 2525
HFKp=9
HFFHFF
(( ヒト新生児皮膚線維芽細胞ヒト新生児皮膚線維芽細胞 ))
p16p16
HFKHFK
(( ヒト陰茎包皮角化細胞ヒト陰茎包皮角化細胞 ))
44 55 66 88 99 101011 22 33
p16p16
清野先生のデータ

36. ① 無血清培地（増殖因子）
② 血清培地（ﾌｨｰﾀﾞｰ細胞）
① ②①
RamirezRD, et al. Genes Dev. (2001)

37. 時間
分裂回数
MSC ： MSCGM ？
毛乳頭細胞： 10%FCS-
DMEM
表皮角化細胞： 3T3 ﾌｨｰﾀﾞｰ
培養
乳腺上皮細胞： 3T3 ﾌｨｰﾀﾞｰ
培養
MSC ：培地 X ？
毛乳頭細胞：低血清培地
表皮角化細胞：無血清培地
乳腺上皮細胞：無血清培地
血清培地
増殖因子

38. 増殖因子 ストレス
Ras
Raf
MEK1/2
ERK1/2
Ets1/2
MLK ｓ、 TAK
ASK1
MKK3/6
ｐ３８ MAPK
A
B
ｐ１６ INK4a
ｐ１６ＩＮＫ４ａ
β‐ ｔｕｂｕｌｉｎ
X
10%FCS
X
A B

39. 間葉系幹細胞
拡大培養に要求される３つの特性
・安・安
全全
・迅・迅
速速
・大・大
量量
再生治療

40. ヒトの細胞数ヒトの細胞数 == 約６０兆個約６０兆個 == ２２ 4646
個個
最終分化最終分化
増殖停止増殖停止
細胞死細胞死
１１
22
33
組織幹細胞組織幹細胞
分化分化
皮膚幹細胞皮膚幹細胞
角化細胞角化細胞
垢垢
造血幹細胞造血幹細胞
赤血球、白血球赤血球、白血球
溶血溶血
自己再生自己再生
全能性幹細胞全能性幹細胞
体外での体外での
増幅増幅
細胞培養細胞培養

41. 胚性幹細胞 (ES 細胞 )
体性幹細胞→間葉系幹細胞など
増殖 / 分化
生体へ移植
ウシ血清含有培地を使用
・感染症
・安全性
・未知成分の混入
・高価
・ロット差
医療用途へも展開できるウシ等動物由来
成分を含まないヒト型無血清培地の開発
（目標）
のスピード と の さ の「増殖 」 「寿命 長 」 検討のスピード と の さ の「増殖 」 「寿命 長 」 検討

42. 開発の流れ
＜血清の効果＞
・栄養分供給
・増殖促進効果
・脂質、鉄等のキャリアー
・脂質成分
・抗酸化作用
・微量元素供給
各作用を細胞増殖 / 形態
を指標に既知成分で置換
○ ヒト骨髄由来間葉系幹細胞で組成検討
○ 初代細胞へ適用
○ 増殖 / 分化動態の確認
○ 安全性確認

43. ④ 培養器表面ｺｰﾄ
(1) ｺｰﾄした培養器の細胞接着比較→◎ Fibronectin 、 Collagen I が良好
(2) 増殖への効果は Fibronectin が良好

44. 添加剤 12 種の増殖効果を検討
Dex, HDC: 増殖因子の増殖作用促進
ﾎｽﾎｴﾀﾉｰﾙｱﾐﾝ , ｴﾀﾉｰﾙｱﾐﾝ : 脂質の前駆体
亜ｾﾚﾝ酸： 抗酸化作用
が な がなかったもの増殖効果 顕著 効果が な がなかったもの増殖効果 顕著 効果
Vit E, Vit D, Testosterone, ProgesteroneVit E, Vit D, Testosterone, Progesterone

45. ⑥ 脂質成分
(1) ｵﾚｲﾝ酸 , ﾘﾉﾚﾝ酸を無血清下で濃度、組
合せ
→従来培地程度には至らず
(2) 脂質に FCS 添加
→ｵﾚｲﾝ酸の添加で 0.5% 血清に成功
(3) FCS とヒト血清の比較
→低血清下で同等か？
0%FCS
-
H
A
L
O
AH
AL
AO
AHL
AHO
ALO
AHLO
0.25%FC
-
H
A
L
O
AH
AL
AO
AHL
AHO
ALO
AHLO
0.5%FCS
-
H
A
L
O
AH
AL
AO
AHL
AHO
ALO
AHLO
1%FCS
-
H
A
L
O
AH
AL
AO
AHL
AHO
ALO
AHLO
MSCGM
0 100 200 300 400 500 600 700 800
mAbs=450nm
12/45-109/03.8.4
増殖に対する効果は軽微
無血清の場合は必要と考えられる
H: リポ高密度 蛋白
L: Linoleic acid
O: Oleic acid
A: Albumin

46. ⑤ 最適化
(1) MSCGM/10%FCS 含有（ﾎﾟｴﾃｨｸｽ社）と比較
→低血清で従来培地と同等の増殖

47. H4-1

48. 不死化不死化
老化 (M0) ： p16 の増加
老化 (M1) ：テロメアの短縮
E7E7
RBRB の不活化の不活化
E6E6
TERTTERT の発現誘導によるの発現誘導による
テロメラーゼの活性化テロメラーゼの活性化
培養日数培養日数
2020
5050
100100
M0M0 M1M1
乳腺上皮細胞の不死化モデル乳腺上皮細胞の不死化モデル
推定分裂回数
p53 経路
（非常用ブレーキ経路）
Rb 経路
（通常ブレーキ経路）

49. p53 経路
（非常用ブレーキ経路）
Rb 経路
（通常ブレーキ経路）
p14ARFp14ARF
HDM2HDM2
p53p53
p16INK4ap16INK4a
CycDCycD
RBRB
apoptosis
E2F
p21
Ink4a 遺伝子座
1β 1α 2 3
E7
E6
細胞周期アクセル
細胞周期ブレーキ
エンジンブレーキ

50. 1 2 3 4 5
1. 10%FCS-DMEM
2. MSCGM (Poietics 社 )
3. MF 培地
4. MF 培地 ( 低酸素 )
5. Hela 細胞
p16INK4a
培養過程における p16INK4a を介した
ストレスのモニター
ではストレスを する低血清 感知ではストレスを する低血清 感知

51. 0 10 20 30 40 50
î|ó{ì˙êî
0
5
10
15
20
25
30
35
ç◊
ñE
èW
íc
î{
âª
êî
ÇPÇOÅìFCS-DMEMÅiè]óàî|ínÅj
MFî|ín
H10-8
ToyoboToyobo 社社
でも な を す低血清培地 良好 増殖 示でも な を す低血清培地 良好 増殖 示

52. 0 10 20 30 40 50 60
î|ó{ì˙êî
90
100
110
120
130
140
150
ç◊
ñE
èW
íc
î{
âª
êî
MCSGM
MFî|ín
13
による な市販培地 良好 増殖による な市販培地 良好 増殖
MSCGM: PoieticMSCGM: Poietic 社社
MF medium: ToyoboMF medium: Toyobo 社社

53. 100
30
10
3
1
100
30
10
3
1
100
30
10
3
1
100
30
10
3
1
100
30
10
3
1
30
10
3
1
10
3
1
0.3
0.1
30
10
3
A
B
Cell growth (% of control)
PDGF
EGF
LIF
VEGF
PDGF+EGF
PDGF+LIF
PDGF+VEGF
PDGF+EGF+LIF
PDGF+EGF+VEGF
PDGF+LIF+VEGF
(ng/ml)
EGF
PDGF
bFGF
aFGF
LIF
HGF
IL6
VEGF
0 50 100 150 200 250 300
0 50 100 150 200 250 300 350

54. 0 10 20 30 40 50 60
106
104
108
1014
1012
1010
#1
#2
#2
#2
Cumulativecellnumber
1016
#2
#2
0 10 20 30 40 50 60
106
104
108
1014
1012
1010
Cultuered day
Cumulativecellnumber
#1
#1
#2
#2
0 10 20 30 40 50 60
106
104
108
1014
1012
1010
1018
Cumulativecellnumber
A
B
C
1016

55. Populationdoubling
Cultured day
0 5 10 15 20 25
10
15
20
25
b-tublin
p16INK4a
Passage number
1 2 3 4 1 2 3 4
C L
A
B
Lane 1 2 3 4 5 6 7 8

56. L
L/10%FCS-Ins,Trf
-Ins,Trf/10%FCS-PDGF-BB
-ｂ
FGF
-PEA
-Sel
-PDGF-BB,bFGF-PDGF-BB,bFGF/10%FCS
C
L(-GF) L(-GF)/10%FCS C
PDGF+bFGF(ng/ml) 0 1 10 0 1 10 0 1 10
p16INK4
a
b-tublin
p16INK4
a b-tublin
A
B
Lane 1 2 3 5 7 9 104 6 8 11
Lane 1 2 3 5 7 94 6 8
C 20% 3%
O2
p16INK4
a b-tublin
Lane
C
1 2 3

57. C bFGF
CD140b
p16INK4a
β-tublin
PDGF AA ABBB AA ABBB AA+BB- -
+bFGF
A
CD140a
C
PDGF-AA
PDGF-AB
PDGF-BB
A-chain B-chain
PDGFRβ
CD140b
PDGFRα
CD140a
B
101
102
103
101
102
103
Lane 1 2 3 5 74 6 8 9

58. C
aFGF
bFGF
EGF
VEGF
PDGF-BBPDGF-BB+aFGF
PDGF-BB+bFGF
PDGF-BB+EGF
PDGF-BB+VEGF
aFGF+bFGFaFGF+EGFaFGF+VEGF
bFGF+EGF
bFGF+VEGF
EGF+VEGF
HeLa
p16INK4a
b-tublin
A
bFGF
PDGF-AA
PDGF-BB
PDGF-AB
bFGF+PDGF-AA
bFGF+PDGF-BB
bFGF+PDGF-AB
bFGF+PDGF-AA+BB
aFGF
EGF
VEGF
aFGF+PDGF-BB
EGF+PDGF-BB
PDGF+VEGF
aFGF+bFGF
bFGF+EGF
bFGF+VEGF
aFGF+EGF
aFGF+VEGF
EGF+VEGF
0 50 100 150 200
B
Cell growth (absorbance O.D. 450nm)
Lane 1 2 3 5 7 9 104 6 8 11 13 15 1612 14 17
C 125
100
75
50
25
0
0 50 100 150 200
Cell growth (absorbance O.D. 450nm)
p16INK4alevel(relativeexpression)
R=0.70
D
p16INK4a
b-tublin
Lane 1 2 3 54 6 7 8
FCS - + - + - +- -
L +PD98059 +SB20358
25mM 10mM 25mM 25mM 10mM 25mM

59. Serum No serumExcess growth factor
Cell proliferation Senescence
Activated Ras Oxidative stress
Mek-Erk p38
p16
Mek-Erk
Cell proliferation
E

60. 培地による増殖速度の違い
ＰＤ
Ｔｉｍｅ
MSCGM, 10%FBS-DMEM
MF10
MF

63. 10%DMEM
MSCGM
MF
5%FCS-MF
MF+col
MF+FN
0
10
20
30
40
ÉR
Éç
Éj
Å[
êî
í èÌî|ó{
3% O2
マウス骨髄由来間葉系幹細胞を各培地に播種。２週間に形成された
コロニーをカウントした。
低酸素培養の方がコロニー形成は良いが、ＭＦ培地では通常の培養
条件でもコロニー形成が認められる。
培地によるコロニー形成能の差異

64. 0 5 10 15 20 25
day
12
14
16
18
20
22
24
P
D
L
MSCGM
MF
ＭＳＣの増殖動態
Ｐ社ＭＳＣをＭＳＣＧＭ、ＭＦ培地で継代培養した。

65. ＰＤＬ
１４ １５ １６ １７ １９ １６ １７ １８ ２１ ２
３
１４ １５ １６ １７ １９ １６ １７ １８ ２１ ２
３
ＰＤＬ
ＭＳＣＧＭ ＭＦ
ＭＳＣＧＭ ＭＦ
ｐ１６ＩＮＫ４ａ
β‐ ｔｕｂｕｌｉｎ
継代によるｐ１６ＩＮＫ４ a
の発現動態

66. 10%D
MSCGM
MF
5%MF
5%MF-GF0
bP
1
0.3
0.1
0.03
bFGF
1
0.3
0.1
0.03
PDGF
1
0.3
0.1
0.03
EGF
3
1
0.3
0.1
0 100 200 300 400
mAbs=450nm
MSC/11-15/04.2.2
bP
0
1
2
3
5
0.5bP
0
1
2
3
5
0.3bP
0
1
2
3
5
0bP
0
1
2
3
5
10%D
MSC
0 50 100 150 200
mAbs=450nm
MSC/a/5-7/04.2.20
MF ＋の組成検討
GF の組合せと添加量の検討。ｂ FGF+PDGF の組
合せが優れる。
GF （ｂ FGF ＋ PDGF ）と FCS の
量。 GF 添加を 1/3 にしても増殖は
良い。

67. 0 50 100 150 200
time(hr)
0
100
200
300
400
500
600
m
A
b
s
=
4
5
0
n
m
10%DMEM
MCSGM
MF
5%MF+0.3bP
5%MF+0.25bP
5%MF+0bP
MSC/M/6-9/04.2.20
MF ＋の増殖性（短期間の培養）

68. 0 5 10 15 20 25 30 35
day
10
15
20
25
30
35
40
P
L
10%DMEM
MSCGM
MF
5%MF
MF+
MF ＋の増殖動態
増殖は MF 培地と同等。今後ｐ１６の発現も確認し組成を絞り込む

69. １．ＧＦ刺激によるｐ３８リン酸化
→培養ストレス（ｐ１６発現）とｐ３８ＭＡＰＫ活性化との関
２．小児指組織からの初代培養
→培地性能評価、適用例充実
３．ＭＦ－Ｐｌｕｓ組成検討
→上市前組成確定の為の細胞動態確認
４．住べ基材評価
→合成ＥＣＭの接着性評価
５．その他

70. ＧＦ刺激によるｐ３８リン酸化 ・培養ストレスにｐ３８ＭＡＰＫが関与
・ｐ１６発現誘導にｐ３８ＭＡＰＫが関
→ＧＦ刺激でｐ３８ＭＡＰＫが活性化
ー ＦＣＳ Ｐｂ Ｐ － ＦＣＳ Ｐｂ ｂＦＧＦ ＰＤＧＦ Ｈｅ
ｐ－ｐ３８
ｐ３８
ＭＳＣＧＭ ＭＦ
p-p38
p38
ｐ - Ｅｒｋ 1/2
Ｅｒｋ 1/2
0 5 10 15 20 40 60(min)
・時間的動態の検討
・ＪＮＫのリン酸化
刺激１５分後
ＰＤＧＦ＋ｂＦＧＦ刺激後

71. 0 10 20 30 40 50 60
î|ó{ì˙êî
10
15
20
25
30
35
40
P
D
L MF
MF+SB
MSC
0 10 20 30 40 50 60
î|ó{ì˙êî
0
5
10
15
20
25
30
35
P
D
L MF
MF+SB
H10-8
・ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の寿命延長効果
・コロニーアッセイ試験
→特許化へ
目的 ・いやし培地特許化

72. ＹＵＢ－Ｂ → 骨髄由来間葉系細胞 １０％ＤＭＥＭ ４種
ＭＦ培地 ４種
ＹＵＢ－Ｃ → 軟骨細胞 １０％ＤＭＥＭ ５種
ＭＦ培地 ４種
ＹＵＢ－Ａ → 脂肪前駆細胞 １０％ＤＭＥＭ １種
ＭＦ培地 １種
ＹＵＢ－Ｓ → 繊維芽細胞 １０％ＤＭＥＭ １種
ＹＵＢ－Ｔ → すじ １０％ＤＭＥＭ １種
これまで ５検体。 組織 ５
種類。
計２１種類
小児指組織からの初代培養

73. 0 10 20 30 40 50 60
Day
4
6
8
10
12
14
16
C
e
l
l
(
l
o
g
1
0
)
#2-MF
#2-10%D
#4-MF
#4-10%D
#5-MF
#5-10%D
#8-MF
YUB-B(MSC)

74. ＭＦ
１０％Ｄ
＃４－ - 脂肪分化 ＃５－脂肪分化 ＃５－脂肪分化
＃４－ - 骨分化 ＃５－骨分化 ＃５－骨分化

75. トリプシン（ 20 分）
→ コラゲナーゼ（ 60 分）
細切

76. 0 10 20 30 40 50 60
Day
4
6
8
10
12
14
16
18
C
e
l
l
(
l
o
g
1
0
)
#2-10%D
#4-MF
#4-10%D
#5-MF
#5-10%D
#8-MF
YUB-C(Condrocyte)

77. 0 10 20 30 40 50 60
Day
4
6
8
10
12
14
16
C
e
l
l
(
l
o
g
1
0
)
#5-MF
#5-10%D
YUB-A(Adipocyte)
脂肪分化誘導

78. ñ¢èàóù
çáê¨äÓçfi
CollagenI
0 1 2 3 4 5 6 7
cell(x100000)
ÖAç◊ñEêî(9 da y, 2000cel l / dish, N=1)
４．住べ基材評価
→合成ＥＣＭの接着性評価
未処理
合成基材
コラーゲン
・前回サンプル（７月）より良い結果。
・さらに機能向上へ
・ＭＦ培地と組み合わせて初代細胞へ適用

79. １．いやし培地
① ｐ３８ＭＡＰＫ活性化 / 時間的挙動の差を確認
② ＪＮＫリン酸化
③ ｐ３８活性阻害剤の効果→コロニーアッセイ、特許化
２．細胞バンク作成・寄託
① 小児指組織
② 胎盤
③ ＵＢＥＴシリーズ
３．ＴＭＣＲ関連
① ＭＦ－Ｐｌｕｓ上市・書類作成

80. Matsumoto
Takeda
MoriTsuchiya
NasuNasu
National Research InstituteNational Research Institute
for Child and Health Developmentfor Child and Health Development
TakahashiTakahashi
ShibuyaShibuya
TeraiTerai

81. Takeda MatsumotoUyama

82. National Center for Child Health and Development