1. Московский
Физико-­‐Технический
Институт
(Государственный
университет)
Факультет
нано-­‐,
био-­‐,
информационных
и
когнитивных
технологий
Лаборатория
механизмов
и
технологий
памяти,
РНЦ
“Курчатовский
Институт”
Никита
Пестров,
группа
002
Исследование
активности
нейронов
коры
головного
мозга
мышей
при
подаче
сенсорных
стимулов
с
помощью
метода
прижизненного
кальциевого
имиджинга
Научный
руководитель:
м.н.с.
Ивашкина
Ольга
Игоревна

2. Актуальность
исследования
• Париетальная
кора
–
ассоциативная
зона
неокортекса
• Вовлекается
в
обработку
звуковых
сигналов
(Mohajerani
et
al.,
2013)
• Вовлекается
в
формирование
памяти
о
дискретном
звуковом
стимуле
(Radulovic
et
al.,
1998)
• Париетальная
ассоциативная
кора
рассматривается
исследователями
как
хаб,
ответственный
за
ассоциацию
стимулов
разных
модальностей
(Murphy
et
al.,
2012;
Andersen,
1997

3. Актуальность
исследования
(Mohajerani
et
al.,
2013)
(Franklin,
Paxinos,
2007)

4. Активация
немедленных
ранних
генов
Транскрипционные
факторы
(с-­‐Fos
и
др.)
Активация
поздних
генов
Эффекторные
белки
Актуальность
исследования
Пластические
перестройки
в
синапсах
(данные
лаборатории
механизмов
и
технологий
памяти)
Париетальная
ассоциативная
кора
специфически
вовлекается
в
извлечение
памяти
о
составном
мультимодальном
условном
стимуле

5. Цель:
исследовать
активацию
нейронов
париетальной
ассоциативной
коры
при
предъявлении
стимулов
разных
сенсорных
модальностей
Цель
и
задачи
Задачи:
• Отработка
процедуры
операции
по
вживлению
краниального
окошка
с
введением
кальциевого
красителя
• Отработка
протокола
регистрации
кальциевой
активности
нейронов
при
предъявлении
стимулов
разных
сенсорных
модальностей
методом
мультифотонной
микроскопии
при
помощи
кальциевого
красителя
Oregon
Green
488
Bapta-­‐1
• Регистрация
и
анализ
кальциевой
активности
нейронов
париетальной
коры
при
предъявлении
зрительного
или
слухового
стимулов
методом
мультифотонной
микроскопии
• Исследование
распределения
нейронов
париетальной
коры
мышей
линии
c-­‐
Fos-­‐EGFP,
активировавшихся
при
предъявлении
зрительного
или
слухового
стимулов,
с
помощью
метода
мультифотонной
микроскопии

6. I.
Исследование
геномной
активации
нейронов
париетальной
коры
при
предъявлении
сенсорных
стимулов
у
мышей
линии
с-­‐Fos-­‐EGFP

7. Линия
трансгенных
животных
Линия
Fos-­‐EGFP
(Barth
et
al.,
2004,
Mutant
Mouse
Regional
Resource
Centers
по
Gong
et
al.,
2003)
Мультифотонная
микроскопия
Преимущества
• Проникновения
на
глубину
до
1
мм;
• Меньшее
рассеяние
—>
большее
разрешение;
• Меньшее
повреждение
живых
тканей;
• Возможность
исследования
динамических
процессов
(Maschio
et
al.,
2012,
Andermann
et
al.,
2010)
Промотор
гена
интереса
трансген
Промотор
c-­‐fos
egfp
Новый
подход
к
исследованию
активности
нейронов

8. 1.
Операция
2.
Регистрация
под
мультифотонным
микроскопом
3.
Обработка
и
анализ
изображений
Imaris
7.4.2.,
FIJI
Методика:
вживление
краниального
окошка
*
-­‐
металлическое
крепление,
NeuroTar
Ltd.

9. Методика:
получение
3D-­‐изображений
(стеков)
париетальной
коры
мышей
линии
с-­‐Fos-­‐EGFP
Красной
стрелкой
показан
слой
коллагена,
зелеными
–
Fos-­‐EGFP-­‐
положительные
клетки.

10. Свет:
5
Гц
Звук:
9
кГц,
80
Дб
Методика:
предъявление
сенсорных
стимулов
Исследование
количества
и
распределения
с-­‐Fos-­‐EGFP
клеток
под
мультифотонным
микроскопом
2
часа

11. Результаты:
распределение
с-­‐Fos-­‐EGFP
клеток
в
париетальной
коре
после
предъявления
светового
стимула
Наибольшее
количество
с-­‐Fos-­‐
EGFP-­‐положительных
клеток
после
предъявления
светового
стимула
было
обнаружено
в
верхних
слоях
париетальной
коры
График
распределения
среднего
содержания
тел
клеток
по
глубине
по
четырем
стекам
париетальной
коры
головного
мозга
мышей.
Среднее
±
стандартная
ошибка
среднего.

12. Результаты:
распределение
с-­‐Fos-­‐EGFP
клеток
в
париетальной
коре
после
предъявления
звукового
стимула
с-­‐Fos-­‐EGFP-­‐положительные
клетки
после
предъявления
звукового
стимула
равномерно
распределены
по
верхним
50
мкм
париетальной
коры
График
распределения
среднего
содержания
тел
клеток
по
глубине
по
пяти
стекам
париетальной
коры
головного
мозга
мышей.
Среднее
±
стандартная
ошибка
среднего.

13. Результаты:
сравнение
количества
с-­‐Fos-­‐EGFP
клеток
в
париетальной
коре
после
предъявления
светового
или
звукового
стимулов
Среднее
±
стандартная
ошибка
среднего
Многофакторный
дисперсионный
анализ
ANOVA
(факторы:
глубина
и
предъявляемый
стимул)
достоверных
отличий
не
выявил.
Было
обнаружено
большее
количество
клеток
на
глубине
50-­‐100
мкм
у
животных,
которым
предъявляли
звуковой
стимул.

14. II.
Исследование
кальциевой
активности
нейронов
париетальной
коры
мышей
при
предъявлении
сенсорных
стимулов

15. Использовали
Oregon
Green®
488
BAPTA-­‐1
В
среднем
вводили
20-­‐40
нл
(Svoboda,2010)
Введение
на
глубину
300-­‐350
мкм
Методика:
введение
кальциевого
красителя
Oregon
Green®
488
BAPTA
1.
Операция:
открытая
поверхность
мозга
2.
Введение
красителя
3.
Операция:
вживление
окошка
и
крепления
4.
Регистрация
под
мультифотонным
микроскопом
5.
Обработка
и
анализ
изображений
Imaris
7.4.2.,
FIJI

16. Методика:
получение
3D-­‐изображений
(стеков)
париетальной
коры
мышей,
прокрашенной
красителем
OGB-­‐1

17. Результаты:
количество
прокрашенных
клеток
после
введения
химического
кальциевого
красителя
OGB-­‐1
Введение
одинакового
количества
химического
кальциевого
красителя
приводит
к
прокрашиванию
разного
числа
нейронов
у
разных
животных

18. 0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
210
220
230
240
250
260
Животное
1
Животное
2
Животное
3
Животное
4
Результаты:
процентное
распределение
прокрашенных
клеток
после
введения
химического
кальциевого
красителя
OGB-­‐1
по
глубине
Наибольшее
количество
прокрашенных
клеток
было
обнаружено
в
верхних
слоях
париетальной
коры

19. До
Свет
Между
Звук
После
До
Звук
Между
Свет
После
N
=
2
N
=
2
Методика:
предъявление
сенсорных
стимулов
животным,
закрепленным
под
мультифотонным
микроскопом
Свет:
5
Гц
Звук:
9
кГц,
80
Дб

20. Методика:
регистрация
и
анализ
кальциевой
активности
при
предъявлении
сенсорных
стимулов
Использованная
формула
для
обсчета
кальциевого
сигнала
Пример
регистрации
кальциевой
активности
нейрона
в
ответ
на
предъявление
сенсорного
стимула

21. Результаты:
пример
зарегистрированного
кальциевого
спайка

22. Результаты:
артефакты
движений
животных
затрудняют
анализ
кальциевой
активности

23. Результаты:
количество
и
параметры
кальциевых
спайков,
зарегистрированных
при
предъявлении
сенсорных
стимулов
Кальциевые
спайки
были
зарегистрированы
как
при
предъявлении
одного
из
сенсорных
стимулов
(светового
или
звукового),
так
и
между
предъявлениями
стимулов

24. Результаты:
количество
и
параметры
кальциевых
спайков,
зарегистрированных
при
предъявлении
сенсорных
стимулов
Амплитуда
кальциевых
спайков,
зарегистрированных
при
предъявлении
сенсорных
стимулов
(светового
или
звукового)
и
между
предъявлениями
стимулов

25. ВЫВОДЫ
• Отработана
и
оптимизирована
методика
работы
для
прижизненной
визуализации
клеток
мозга
мыши
с
помощью
мультифотонного
микроскопа
• Отработан
протокол
введения
кальциевого
красителя
Oregon
Green
488
Bapta-­‐1
• Отработан
протокол
регистрации
кальциевой
активности
нейронов
методом
мультифотонной
микроскопии
при
предъявлении
стимулов
разных
сенсорных
модальностей
животным,
закрепленным
под
объективом
мультифотонного
микроскопа
• Наибольшее
количество
с-­‐Fos-­‐EGFP
клеток,
активировавшихся
в
ответ
на
предъявление
сенсорных
стимулов,
обнаружено
в
верхних
слоях
париетальной
ассоциативной
коры
(до
70
мкм)
• Показана
тенденция
к
большему
количеству
с-­‐Fos-­‐EGFP
клеток
в
париетальной
ассоциативной
коре
на
глубине
50-­‐100
мкм
у
животных,
которым
предъявляли
звуковой
стимул
по
сравнению
с
животными,
которым
предъявляли
световой
стимул
• Зарегистрированы
и
проанализированы
кальциевые
спайки
как
при
предъявлении
одного
из
сенсорных
стимулов
(светового
или
звукового),
так
и
между
предъявлениями
стимулов