1. Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2012-2013
Cellulaire stressrespons onder invloed van interferentie
met lamine A-maturatie
Ludger Goeminne
Promotor: dr. ir. Winnok H. De Vos
Tutoren: dr. ir. Winnok H. De Vos & ir. Tom Sieprath
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de bio-ingenieurswetenschappen:cel- en genbiotechnologie
2. De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen
en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen
van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron
te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.
promotor en begeleider begeleider
dr. ir. Winnok H. De Vos ir. Tom Sieprath
auteur
Ludger Goeminne
Universiteit Gent 7 juni 2013
i
3. Woord vooraf
Eerst en vooral wil ik graag mijn promotor en begeleider, dr. ir. Winnok De Vos bedanken
voor de mogelijkheden die hij mij geboden heeft en zijn geloof in mijn kunnen. Ik ben hem ook
zeer dankbaar voor zijn suggesties en feedback zonder dewelke deze thesis nooit tot stand had
kunnen komen alsook voor de tijd die hij vrijmaakte om mij te leren werken met de microscopen
en de beeldverwerkingssoftware. Ik wil ook mijn andere begeleider, ir. Tom Sieprath, bedanken
voor zijn input in mijn experimenten en de TMRM-kleuring en CM-H2DCFDA-kleuring die hij
mij geleerd heeft. Ik wil ook ir. Tobias Corne bedanken. Net als Winnok en Tom stond hij
altijd klaar om mijn vragen te beantwoorden en praktische suggesties te geven. Speciale dank
gaat uit naar Kristof De Vusser, die na het tweede semester helaas van werk veranderd is, en
die mij zo goed als alles geleerd heeft wat ik weet over het werk in het labo. Ook wil ik graag
Isabelle Tilmant bedanken voor de drie maanden die ze heeft meegewerkt in onze groep en de
nuttige tips die ze mij heeft gegeven om mijn labowerk nog te verbeteren. Ik wil ook de andere
thesisstudenten van onze groep, Cédric, Tazkiyah en Jessica, de mensen van de NEMA en van
het secretariaat en bij uitbreiding alle mensen van onze vakgroep die regelmatig op de tweede
verdieping komen bedanken voor de goede sfeer en hun hulpvaardigheid. Verder wil ik nog mijn
ouders, broer en zus bedanken voor hun steun en hun geloof in mij. Tot slot bedank ik al mijn
vrienden voor alle toffe momenten tijdens dit drukke laatste jaar. Ik hoop dat we regelmatig
nog gaan kunnen afspreken. Ik wil mij ook op voorhand verontschuldigen bij de mensen die ik
eventueel in dit dankwoord vergeten zou zijn. Als u op één of andere manier hebt bijgedragen
aan het tot stand komen van deze thesis, weet dat ik u zeer erkentelijk ben.
ii
4. Samenvatting
De nucleaire lamina is een netwerk van type V-intermediaire filamenten dat structurele onder-
steuning biedt aan de kern en een centrale rol speelt in nucleaire organisatie. Mutaties in het
LMNA gen, dat codeert voor belangrijke componenten van de lamina, de type A-lamines, veroor-
zaken een breed scala aan weefselspecifieke en systemische ziekten, laminopathieën genaamd. De
exacte pathologische mechanismen zijn nog niet volledig opgehelderd, maar er zijn aanwijzingen
dat verstoringen van de lamina cellulaire stress verhoogt. Verder geven recente observaties aan
dat calcium mogelijk een rol speelt in het pathomechanisme van deze aandoeningen.
Omdat patiëntenmateriaal schaars is, maakten we gebruik van experimentele modellen om pa-
thologische laminaperturbaties na te bootsen. We optimaliseerden eerst knockdowns (kd) voor
LMNA en ZMPSTE24 in normale humane dermale fibroblasten (NHDF). Daarnaast behandelden
we deze cellen met verschillende chemische stoffen (N-acetyl-S-farnesyl-L-cysteïne-methylester
(AFCME), farnseyltransferase-inhibitor (FTI), zoledroninezuur (ZOL) en saquinavir (SAQ)) die
interfereren met de maturatie van lamine A/C. Via fluorescentiemicroscopie onderzochten we de
mitochondriale morfologie, oxidatieve stress en de lokalisatie van architecturale en regulatorische
eiwitten.
We rapporteren hier een toename van de lamine B-detectie in de knockdowns, maar niet in
chemisch behandelde cellen alsook SUN2-mislokalisaties in de LMNA-kd en met SAQ behan-
delde cellen. FTI-behandeling induceerde verlies van lamine B1. We konden geen wijziging in
oxidatieve stress aantonen over de verschillende behandelingen, maar we zagen wel effecten op
de mitochondriale morfologie in met SAQ behandelde cellen en patiëntencellen met een dubbele
knockout voor LMNA. We ontdekten verder zeven verschillende lokalisatiepatronen van het cal-
ciumbindend EF-hand-domein-eiwit S100A6, maar we konden geen celcyclusafhankelijkheid van
deze patronen aantonen. Het calciumbindende eiwit annexine A11 vertoonde voornamelijk een
nucleair signaal, met af en toe cytoplasmatische plekjes. Het aantal en de intensiteit van deze
plekjes is sterk verhoogd in cellen behandeld met SAQ. Bepaalde eigenschappen die wel aanwe-
zig zijn in patiëntencellen, zoals een aberrante kernmorfologie konden niet worden aangetoond
in onze modellen. Deze resultaten onderstrepen het belang van de keuze van het juiste cellulaire
modelsysteem en manen aan tot voorzichtigheid bij de interpretatie en veralgemening van de
resultaten bekomen met een dergelijk model.
iii
5. Abstract
The nuclear lamina is a meshwork of type V-intermediate filaments that provides structural
support to the nucleus and occupies a central role in the nuclear organization. Mutations in the
LMNA gene, that encodes for important components of the lamina, the A-type lamins, cause a
broad spectrum of tissue-specific and systemic diseases, collectively called laminopathies. The
exact pathomechanism remains to be elucidated. However, there are indications that disruptions
of the lamina increase cellular stress. Furthermore, recent observations also point to a putative
role of calcium in the pathomechanism of these diseases.
Because patient material is scare, we herein optimized methods to mimic pathological lamina per-
turbations. We optimized knockdowns (kd) for LMNA and ZMPSTE24 in normal human dermal
fibroblasts (NHDF). Furthermore, we treated these cells with chemical compounds (N-acetyl-S-
farnesyl-L-cysteine methylester (AFCME), farnseyltransferase inhibitor (FTI), zoledronic acid
(ZOL) and saquinavir (SAQ)) that interfere with lamin A/C maturation. Using fluorescent
microscopy, we investigated mitochondrial morphology, oxidative stress and localization of ar-
chitectural and regulatory proteins.
We report an increase in lamin B detection in the knockdowns, but not in chemically perturbed
cells as well as SUN2 mislocalization in LMNA kd and SAQ-treated cells. FTI treatment induced
a loss of lamin B1. We failed to detect any change in oxidative stress over the treatments, but we
could detect effects in SAQ-treated cells and LMNA double null patient cells on mitochondrial
morphology. We further discovered seven different localization patterns of the calcium-binding
EF-hand domain protein S100A6, but we were unable to show any cell cycle dependency of these
patterns. The calcium-binding protein annexin A11 showed a predominantly nuclear signal with
occasionally some cytoplasmic spots. The frequency and intensity of these spots is strongly
increased in SAQ-treated cells. Certain features, like aberrations in nuclear morphology , that
are present in patient cells, could not be detected in our models. These results underline the
importance of choosing the correct cellular model and urge caution in the interpretation and
generalization of the results obtained with such models.
iv
8. Lijst met afkortingen
AFCME N-acetyl-S-farnesyl-L-cysteïne-methylester
bidest gebidestilleerd water
CM-H2DCFDA 5-(en 6-)chloromethyl-2’,7’-dichlorodihydrofluoresceïnediacetaatacetylester
CMT-2B1 Charcot-Marie-Tooth-neuropathie
DAPI 4’,6-diamidino-2-fenylindool
DCM-CD dilaterende cardiomyopathie met conductiesysteemdefecten
DMEM Advanced Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO dimethylsulfoxide
DSB dubbelstrengige breuken
ER endoplasmatisch reticulum
FBS foetaal bovien serum
FC fold change
FPLD familiale partiële lipodystrofie van het Dunnigan-type
FTI farnesyltransferase-inhibitor-276-trifluoroacetaat
kd knockdown
LGMD-1B limb-girdle musculaire dystrofie
LINC-complex link of nucleoskeleton and cytoskeleton-complex
LBR lamine B-receptor
MAD mandibulaire acrale dysplasie
MDC congenitale spierdystrofie
NHDF normale humane dermale fibroblasten
NPC nucleaire poriecomplexen
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethaansulfonzuur
HGPS Hutchinson-Gilford progeria-syndroom
HT-buffer HEPES/tris-buffer
p passage
PBS fosfaatbuffer
vii
9. PCNA proliferating cell nuclear antigen
pRb retinoblastoom-geassocieerd eiwit
pRbSer608-PO4 retinoblastoom-geassocieerd eiwit gefosforyleerd op serine 608
PSL penicilline-streptomycine-L-glutamine
SAQ saquinavirmesylaat
TMRM tetramethylrhodaminemethylester
ZMPSTE24 zinkmetalloprotease gerelateerd aan het STE24-homoloog in gist
ZOL zoledroninezuur
viii
10. 1. Inleiding
1.1 Voorkomen en structuur van nucleaire lamines
1.1.1 De nucleaire enveloppe
De nucleaire enveloppe bestaat uit een dubbele kernmembraan die in eukaryote cellen de in-
houd van de kern afscheidt van het cytoplasma272,58. Elk van beide membranen bestaat uit
een bilipidelaag van fosfolipiden. Het buitenste membraan is continu met dat van het ruw
endoplasmatisch reticulum (ER), waardoor men ook wel spreekt van een nucleoplasmatisch re-
ticulum243,162. Toch bezit het buitenste kernmembraan ook unieke integrale eiwitten die niet
voorkomen in het ER242,274,213. Net als op het ruw ER zijn er op het buitenste kernmembraan
ribosomen aanwezig37. Het binnenste kernmembraan is ribosoom-vrij maar bezit wel vele tran-
smembraaneiwitten271,37. De ruimte tussen beide membranen is ongeveer 40 – 50 nm breed en
wordt de perinucleaire ruimte genoemd237. Het binnenste en het buitenste kernmembraan komen
samen ter hoogte van de nucleaire poriecomplexen61,274,83. Deze 2000 – 4000 nucleaire poriecom-
plexen in de nucleaire enveloppe laten diffusie van ionen en kleine moleculen toe en faciliteren
receptor-gemedieerde bidirectionele uitwisseling van grotere (Stokes-radius > 2,6 nm (≈ 50 kDa))
moleculen zoals eiwitten, RNA en ribonucleoproteïnen tussen kern en cytoplasma80,44,176. In fi-
guur 1.1 wordt de structuur van de nucleaire enveloppe schematisch weergegeven.
Figuur 1.1: Overzicht van de nucleaire enveloppe. Het buitenste kernmembraan loopt over in het ruw
ER waardoor ook het ER-lumen en de perinucleaire ruimte met elkaar verbonden zijn.
Nucleaire poriën verbinden op gezette plaatsen het binnenste en buitenste membraan om
bidirectioneel transport van moleculen toe te laten. De nucleaire lamina ondersteunt het
binnenste kernmembraan waarin talrijke eiwitten aanwezig zijn. Via deze eiwitten wor-
den het chromatine enerzijds en het binnenste kernmembraan anderzijds verankerd aan de
nucleaire lamina243
.
1
11. 1.1.2 De nucleaire lamina
De nucleaire lamina is een 10 – 300 nm dik netwerk van intermediaire filamenten en membraan-
geassocieerde eiwitten dat gelegen is onder het binnenste kernmembraan (figuur 1.1)245,243,27,96.
Ze biedt mechanische ondersteuning aan de celkern, maar is ook een ankerpunt voor veel eiwit-
eiwit- en DNA-eiwitinteracties53. Ze maakt immers directe connecties met vele eiwitten van
het binnenste nucleaire membraan, de nucleaire poriecomplexen en het chromatine120,53. De
nucleaire lamina is voornamelijk opgebouwd uit lamines. Deze type V-intermediaire filamenten2
worden onderverdeeld in type A- en type B-lamines op basis van sequentiehomologie, expressie-
patroon, structurele eigenschappen en gedrag tijdens de mitose72,106. Type A-lamines omvatten
lamine A, lamine C, lamine A∆10 en lamine C2. Zij zijn allen splicingsproducten van hetzelfde
prelamine A/C-transcript, dat gecodeerd wordt door het LMNA-gen34. Type B-lamines omvat-
ten lamine B1, lamine B2 en lamine B3. Lamine B1 wordt gecodeerd door het LMNB1-gen148
terwijl lamine B2 en lamine B3 beiden gecodeerd worden door het LMNB2-gen224. Lamine B1
en lamine B2 worden samen soms kortweg aangeduid met “lamine B”.
1.1.3 Voorkomen en organisatie van nucleaire lamines
Type B-lamines vormen dunne, georganiseerde lagen die sterk geassocieerd zijn met het binnenste
nucleaire membraan, terwijl lamine A een afzonderlijk maar verweven netwerk van dikke bundels
en lagen bovenop de type B-lamines vormt en op die manier bijdraagt aan de mechanische
sterkte van de nucleaire enveloppe100. Bovendien zouden lamine A en lamine C enerzijds en
lamine B2 anderzijds aparte microdomeinen vormen in de nucleaire lamina, waarbij de type A-
lamines geassocieerd zijn met genrijke regio’s van het chromatine terwijl de type B-lamines eerder
geassocieerd zijn met de genarme gebieden227.
Type A-lamines komen niet alleen voor in de nucleaire lamina, maar vormen ook in het nucle-
oplasma foci die ontstaan tijdens de vroege G1-fase132 en die vermoedelijk georganiseerd zijn
als een netwerk van vertakte tubulaire structuren die continu zijn met de lamina25,30,33,34,135.
Daarnaast komen zowel lamine A als lamine B ook in niet-gepolymeriseerde vorm voor in het nu-
cleoplasma en vormen daarbij specifieke eiwitcomplexen in wat ook wel een “nuclear veil” wordt
genoemd71,33,197. Figuur 1.2 geeft een overzicht van de organisatie van de nucleaire lamines.
2
12. Figuur 1.2: A – I: equatoriale doorsnede van de celkern van HeLa-cellen na immunofluorescentiekleu-
ring voor type A-lamines (A,D,G) en lamine B1 (B, E, H) samen met een gecombineerd
beeld (OL) van de eerste twee kolommen (C, F, I)227
. De gebieden aangeduid door witte
vierkanten in C zijn uitvergroot in D – I. Scale bar = 5 µm. Type A- en type B-lamines
vormen vooral aparte netwerken met een aantal overlappende regio’s. Onderbrekingen in de
kleuring voor type A-lamines werden frequent opgevuld met type B-lamines en vice versa
(witte pijlen in E en F).
J: elektronenmicroscopische opname van de binnenzijde van de nucleaire enveloppe van Xe-
nopus-oöcyten99
. De nucleaire poriecomplexen zijn aangeduid als NPC en de witte pijlen
wijzen naar een aantal lamine A-filamenten.
K: 3D-weergave van de fluorescentie van een lamine A∆10-GFP-construct in de celkern van
een CHO-K1-cel. De vertakte transnucleaire structuren zijn duidelijk te zien30
.
De samenstelling van de nucleaire lamina kan grondig verschillen tussen verschillende celtypes
binnen hetzelfde organisme. Elke cel brengt altijd minstens één soort type B-lamine tot expressie,
maar de verhouding tussen lamine B1 en lamine B2 kan variëren29,285. Dit is echter niet altijd
het geval voor de type A-lamines. Zo is bijvoorbeeld bekend dat embryonale stamcellen geen
type A-lamines tot expressie brengen57. Opvallend is wel dat type A-lamines aanwezig zijn in
de zygote en nog zwak gedetecteerd kunnen worden in het achtcellig stadium van de embryonale
ontwikkeling, maar dat ze nadien niet meer aangetoond kunnen worden tot in het morulastadium
of zelfs pas na het blastocyststadium109,89. Ook bepaalde adulte celtypes die nog niet volledig
gedifferentieerd zijn, brengen weinig tot geen type A-lamines tot expressie57. De enige somatische
cellen die geen type A-lamines tot expressie brengen zijn hemapoëtische cellen van het bloed en
het beenmerg209.
3
13. In de meeste tumoren zijn type B-lamines aanwezig198. Hun expressie is verhoogd in kwaad-
aardige prostaatkankers en bij patiënten met leverkanker werd een verhoogde aanwezigheid van
lamine B1 in het plasma aangetoond59,247. In bepaalde longkankersubtypes en neoplasma’s
van het gastro-intestinaal systeem werd echter een verlaagde lamine B-expressie gevonden31,181.
Type A-lamines komen meestal minder tot expressie in tumoren198. Ze komen immers vooral
voor in sterk gedifferentieerde cellen en zijn betrokken bij de reorganisatie van het chromatine
en herprogrammering noodzakelijk voor terminale differentiatie en groei-inperking. Een reductie
van type A-lamines zou dus mogelijk een ongedifferentieerd fenotype kunnen bevorderen, wat
een agressieve proliferatie van de tumor bevordert201. Deze correlatie tussen een lage hoeveel-
heid type A-lamines en een verhoogde tumorproliferatie is echter niet systematisch. Vele auteurs
vinden immers ook verbanden tussen verhoogde lamine A/C-expressie en agressiviteit van tumo-
ren270,136. Het is echter dikwijls moeilijk uit te maken of een aberrante lamine-expressie oorzaak
dan wel gevolg is van de tumorprogressie waardoor veel dergelijke verbanden tussen wijzigingen
in lamine-expressie en kanker nogal voorbarig zijn39.
Het minder abundante lamine A∆10 komt in kleine hoeveelheden voor in een brede waaier
aan celtypes en verschilt van lamine A doordat het het 5’-uiteinde van exon 10 mist255,159.
Lamine C2 is een kortere splice-variant van lamine A en bevat een unieke GNAEGR-sequentie
aan zijn aminoterminaal uiteinde255,7. Lamine B3 is een verkorte splice-variant van lamine B2
en bezit aan zijn N-terminus een 84 aminozuren-lange unieke sequentie255,224. De lamines C2 en
B3 zijn tot op heden enkel aangetoond in de nucleaire lamina van spermatozoïden van ratten en
muizen.
1.1.4 Structuur van de nucleaire lamines
Alle lamines bestaan uit drie domeinen: een kort N-terminaal kopdomein, een centraal staafvor-
mig domein en een lang C-terminaal staartdomein. In hun staartdomein bezitten lamines een
type s-immunoglobulinedomein138. Tussen hun staafvormig domein en hun immunoglobulinedo-
mein bevindt zich een nucleair lokalisatiesignaal. Bovendien bezitten lamine B1 en lamine B2,
alsook de precursor van de type A-lamines, zijnde prelamine A/C, een CAAX-motief (met C:
cysteïne, A: een alifatisch aminozuur en X: typisch serine, glutamine, methionine of alanine),
wat aanleiding geeft tot post-translationele farnesylatie212,215,134. De structuur van de humane
lamines is weergegeven in figuur 1.3.
4
14. Figuur 1.3: Boven: weergave van de eiwitstructuur van humaan lamine A. Onder: schematische weer-
gave van prelamine A/C, lamine A, lamine C, lamine B1 en lamine B2121
.
Alle type A-lamines zijn splicingsproducten van prelamine A/C. Lamine A en lamine C verschil-
len van elkaar door alternatieve splicing in het staartdomein: lamine C mist aminozuren 567
– 664, maar heeft op zijn C-terminaal gedeelte wel een VSGSRR-sequentie die afwezig is bij
lamine A255,253.
Lamines vormen in vivo homodimeren. Deze homodimeren assembleren dan verder via kop-
staartinteracties tot homopolymere filamenten met een diameter van ongeveer 10 nm73,47,131.
Homopolymeren bestaande uit type A-lamines kunnen dan weer interageren met homopolymeren
die bestaan uit type B-lamines. De polymerisatie van lamines is schematisch weergegeven in
figuur 1.4.
Figuur 1.4: Schematische weergave van de assemblage van lamine-eiwitten tot een macromoleculaire
filamenteuze structuur121
.
5
15. 1.2 Functies van lamines
1.2.1 Structuur en dynamiek van de celkern
De functie van lamines die reeds het langst bekend is, betreft de ondersteuning van de nucleaire
enveloppe door de nucleaire lamina245. Zo zal depletie van lamine B3 in Xenopus-oöcyten tot
kleinere en meer fragiele nuclei met een hogere densiteit aan NPC185,172,126. Indien zowel lamine
B2 als lamine B2 verwijderd worden uit Xenopus-oöcyten, kunnen de membranen geen chro-
matine meer binden95. Lamines gaan daarnaast bindingen aan met diverse transmembranaire
eiwitten van het binnenste kernmembraan. Voorbeelden van dergelijke eiwitverankeringen zijn
de interacties van LAP1 en de lamine B-receptor (LBR) met type B-lamines161,125 en de interac-
ties van DMPK, nesprine-1α en nesprine-2α174,111 met type A-lamines112. De transmembranaire
eiwitten MAN1, LAP2β en emerine binden zowel met type B- als met type A-lamines164,143,81.
De lamina staat ook in voor de vormgeving van de celkern en de verankering van de nucleaire
poriecomplexen61,34,87. Langs haar nucleoplasmatische zijde vormt ze bovendien een docking
site voor chromatine72, waarbij, zoals reeds hoger vermeld, type A- lamines eerder geassocieerd
zijn met genrijke regio’s in het chromatine en type B-lamines eerder met genarme regio’s227.
Zowel type A- als type B-lamines gaan immers directe interacties aan met zowel histonen als
DNA252,228,121, maar ook eiwitten als BAF, HP1 en hisondeacetylase 3 zorgen voor een vast-
hechting van het chromatine aan de lamina140.
Lamines spelen ook een essentiële rol bij de celdeling. De afbraak van de nucleaire enveloppe
vereist immers depolymerisatie van de nucleaire lamina114. Dit gebeurt door fosforylatie van
de lamines door CDK1194,259. Tijdens de mitose blijven type B-lamines geassocieerd met de
membranen terwijl type A-lamines vrijelijk verspreid in het cytoplasma voorkomen70,215,177. La-
mine B1 zal onmiddellijk na de mitose polymeriseren op het oppervlak van het decondenserende
chromatine177. Lamine A zal daarentegen eerst naar het nucleoplasma gestuurd worden en pas
in een latere fase, nadat de belangrijkste componenten van de nucleaire enveloppe geassembleerd
zijn, aanhechten op het reeds gevormde lamine B-netwerk177. Uit recent onderzoek blijkt bo-
vendien dat LBR cruciaal is voor de timing van de assemblage van het nucleair membraan na de
mitose259.
1.2.2 Connecties met het cytoskelet
Opmerkelijk is dat de nucleaire lamina in contact staat met de verschillende soorten cytoskeletale
filamenten. Dit gebeurt via het LINC (link of nucleoskeleton and cytoskeleton)-complex. Het
LINC-complex is opgebouwd uit trimeren bestaande uit SUN-1 en/of SUN2-proteïnes156,237 die
gekoppeld zijn aan nesprine-eiwitten. De SUN1/2-trimeren overspannen het binnenste nucleair
membraan146. Ze interageren langs hun nucleoplasmatische kant met lamine A111 en langs de
kant van de perinucleaire ruimte met nesprines244. Nesprines doorkruisen op hun beurt het
buitenste nucleair membraan243. Nesprine-1 en -2 zijn gekoppeld aan cytoplasmatische actine-
filamenten243. Via biochemische technieken is er echter ook aangetoond dat type A- en type
6
16. B-lamines rechtstreeks kunnen binden met filamenteus actine233. Nesprine-3 is via plectine ver-
bonden met de intermediaire filamenten van het cytoplasma269. Het onlangs ontdekte nesprine-4
bindt met cytoplasmatisch kinesine-1213. De korte isovormen nesprine-1α en nesprine-2α zijn
voornamelijk aanwezig langs de nucleoplasmatische zijde van het binnenste nucleair membraan
en kunnen binden met lamines174,111. Een overzicht van de belangrijkste eiwitten die rechtstreeks
en onrechtstreeks verbonden zijn met de nucleaire lamina is weergegeven in figuur 1.5.
Figuur 1.5: Schematische weergave van een aantal belangrijke lamine-geassocieerde eiwitten ter hoogte
van de nucleaire enveloppe121
.
1.2.3 Cellulaire signalisatie en transcriptionele regulatie
De nucleaire lamina werkt als een docking platform voor de binding van regulatorische eiwitten.
Ter hoogte van de nucleaire lamina gebeurt immers de sequestratie van transcriptiefactoren in
inactieve complexen, regulatie van hun concentratie en posttranslationele modificaties, modulatie
van transcriptionele complexen en regulatie van de activiteit en/of beschikbaarheid van compo-
nenten van een signaaltransductiepathway en regulatoren van chromatineorganisatie8. Lamines
interageren direct met belangrijke eiwitten uit de pRb/EF2-, Wnt/β-catenine-, TGF/SMAD-,
MAPK- en AP1-signaaltransductiepathways74. Type A-lamines gaan ook interacties aan met
de MOK2- en SEBP1-transcriptiefactoren76,153. Type B-lamines associëren o.a. met Oct-1, een
transcriptiefactor die essentieel is voor de transcriptionele regulatie van genen die betrokken zijn
bij de oxidatieve stressrespons163.
Er zijn echter ook talrijke indirecte interacties via verschillende lamine-bindende eiwitten. Zo
is het bekend dat ook LAP2α kan binden met pRb165. Een ander voorbeeld is emerine, dat
kan binden aan de transcriptionele repressor Gcl123 en betrokken is bij de neerregulatie van het
β-cateninegehalte in de kern166. Ook hebben verschillende studies de interactie tussen MAN1
en Smad-transcriptiefactoren aangetoond19. Recente studie hebben aangetoond dat nucleoplas-
7
17. matische type A-lamines deel uitmaken van nucleaire motorcomplexen die noodzakelijk zijn om
chromosomen of gensegmenten te verplaatsen naar transcriptieplaatsen als respons op cellulaire
signalisatie54,77,171. Depletie van nucleoplasmatisch lamine A leidt inderdaad tot inhibitie van
RNA-polymerase II-gemedieerde transcriptie141,238.
1.2.4 DNA-replicatie en DNA-herstel
Lamines spelen een belangrijke rol bij de DNA-replicatie. Men observeerde immers dat primaire
fibroblasten DNA-synthese initiëren in een beperkt aantal nucleoplasmatische lamine-foci gelegen
rond de nucleoli, waarin ook eiwitten van de pRb-familie aanwezig zijn132. Lamines binden met
hun Ig-motief direct aan PCNA en zijn daardoor noodzakelijk voor de assemblage en de functie
van het complex dat nodig is voor de ketenelongatie bij DNA-replicatie230.
Lamines zijn ook nodig voor DNA-herstel. Verlies van type A-lamines leidt immers tot een
toename van het aantal γH2AX-foci, wat wijst op toegenomen DNA-schade103, alsook tot een
toename van aneuploïdie, chromosomale abnormaliteiten, telomeerverkorting en een verschuiving
van de distributie van de telomeren richting de periferie van de celkern203,204. Het is aangetoond
dat verlies van type A-lamines zorgt voor een opregulatie van CTSL-expressie, wat leidt tot een
verminderd herstel van dubbelstrengige breuken (DSB) in het DNA via “non-homologous end
joining” 203,204. Verlies van type A-lamines leidt ook tot verminderde expressie van BRCA1 en
RAD51, wat aanleiding geeft tot verminderd herstel van DSB via homologe recombinatie203,204.
1.3 Import en processing van lamines
Lamine A, lamine B1 en lamine B2 komen tot expressie als prelamines102. Men vermoedt dat de
nucleaire import van deze prelamines voorafgaat aan hun processing vanwege hun sterk nucleair
lokalisatiesignaal14. Naast deze targeting door nucleaire lokalisatiesignalen worden echter nog
drie andere niet-exclusieve modellen voor nucleaire import voorgesteld: diffusie-retentie, vesi-
kelfusie en targeting met specifieke INM-sorterende motieven102. De processing van prelamines
omvat een aantal belangrijke modificaties aan hun C-terminus. Eerst wordt een farnesylgroep
gebonden op het cysteïneresidu van de CAAX-box door het oplosbare farnesyltransferase215,
waarna de laatste drie aminozuren (-AAX) worden afgesplitst door een AAX-endopeptidase.
Voor lamine A is dit endopeptidase ofwel RCE1 (Ras-converting enzyme 1) ofwel ZMPSTE24
(zinkmetalloprotease gerelateerd aan het STE24-homoloog in gist), beide integrale membraanei-
witten zijn hier functioneel redundant15. Voor type B-lamines kan deze afsplitsing echter enkel
uitgevoerd worden door RCE1167,202. In de daarop volgende stap wordt de C-terminale carboxy-
lgroep van het cysteïneresidu gemethyleerd door het integrale membraaneiwit ICTM41. Men
denkt dat de additie van de hydrofobe farnesyl- en methylgroep op prelamines de initiële in-
corporatie in de nucleaire lamina vergemakkelijkt door hydrofobe interactie met het binnenste
kernmembraan. ICTM en ZMPSTE24 worden beiden zowel in het ER als in het binnenste nucle-
aire membraan aangetroffen14. Een laatste processingstap gebeurt enkel bij lamine A en betreft
een interne splitsing op een RSYLGG-sequentie waarbij de laatste 15 aminozuren (inclusief het
8
18. gemethyleerde cysteïne met farnesylgroep) aan het C-terminale uiteinde verwijderd worden door
ZMPSTE24, ook wel FACE-1 (farnesylated proteins converting enzyme) genoemd15. Dit ver-
schil impliceert dus dat bij mature lamines enkel de type B-lamines een hydrofobe farnesylgroep
bezitten en verklaart bijvoorbeeld waarom type B-lamines tijdens de mitose geassocieerd blijven
met membranen. Belangrijk is ook dat deze laatste stap in de processing van lamine A enkel kan
gebeuren door ZMPSTE24. Er is in deze stap dus geen functionele redundantie met RCE1. De
processing van lamines wordt weergegeven in figuur 1.6.
Figuur 1.6: Schematische weergave van de C-terminale modificaties tijdens de maturatie van lamines
A, B1 en B2. De cijfers zijn aminozuurposities geteld vanaf de N-terminus70
.
Lamine C, dat 74 aminozuren korter is dan matuur lamine A, bezit geen CAAX-box en ondergaat
geen post-translationele modificaties255. De lokalisatie van lamine C naar het binnenste nucleaire
membraan is vermoedelijk afhankelijk van lamine A263.
1.4 Nucleaire envelopathieën en laminopathieën
Envelopathieën worden gedefinieerd als ziekten die veroorzaakt worden door mutaties in genen
die coderen voor eiwitten die deel uitmaken van de nucleaire enveloppe. Van deze envelopathieën
zijn de laminopathieën de grootste groep. Dit zijn zeldzame ziekten die veroorzaakt worden door
mutaties in genen die coderen voor lamines of mutaties in genen die coderen voor eiwitten die
betrokken zijn bij hun posttranslationele processing34. Vanwege de essentiële en gevarieerde
functies van lamines, zijn deze afwijkingen meestal ernstig, maar ook fenotypisch erg divers,
9
19. hoewel ze soms veroorzaakt worden door mutaties in hetzelfde gen43. Om het breder kader van
dit thesisonderzoek te schetsen, worden in deze sectie kort de laminopathieën overlopen.
1.4.1 Type A-laminopathieën
Type A-laminopathieën worden veroorzaakt door mutaties in het LMNA-gen of genen die co-
deren voor eiwitten betrokken bij de verwerking van type A-lamines. De effecten kunnen zowel
systemisch als weefselspecifiek zijn. Deze laminopathiën worden in vier grote groepen ingedeeld:
ziekten van de dwarsgestreepte spieren en de hartspier, vetweefselziekten, perifere neuropathieën
en progeroïde syndromen34,273. Benedetti et al.18 verdelen de laminopathieën echter onder in
twee groepen. De eerste groep betreft fenotypes die pas zichtbaar worden op latere leeftijd
door verlies van functie als gevolg van haplo-insufficiëntie, terwijl de tweede groep de fenotypes
omvat die al vroeg zichtbaar worden en die veroorzaakt worden door dominant negatieve muta-
ties of accumulatie van toxische moleculen. De eerste groep omvat de neuromusculaire ziekten,
waaronder autosomale Emery-Dreifuss moleculaire dystrofie en limb-girdle musculaire dystrofie
(LGMD-1B), alsook dilaterende cardiomyopathie met conductiesysteemdefecten (DCM-CD) en
Charcot-Marie-Tooth-neuropathie (CMT-2B1). Tot de tweede groep behoren partiële lipodys-
trofiesyndromen met of zonder afwijkingen in de ontwikkeling alsook de vervroegde verouderings-
syndromen.
Ziekten van de dwarsgestreepte spieren en de hartspier
Deze ziekten omvatten de autosomaal-overerfbare vorm van Emery-Dreifuss-spierdystrofie, limb-
girdle spierdystrofie type 1B (LGMD-1B), congenitale spierdystrofie (MDC) en dilaterende cardi-
omyopathie met conductiesysteemdefecten (DCM-CD) met of zonder spierdystrofie. De spierdys-
trofieën worden gekenmerkt door trage progressieve spierafbraak en -zwakte waardoor patiënten
op termijn zelfs de mogelijkheid om te stappen kunnen verliezen78. Emery-Dreifuss-spierdystrofie
en MDC worden daarnaast ook gekenmerkt door contracties van de gewrichten164,199. Er kunnen
ook defecten optreden in het conductiesysteem van het hart waardoor patiënten plotseling kunnen
overlijden door hartfalen123,34. Zhang et al.283 suggereren dat de symptomen Emery-Dreifuss-
spierdystrofie op zijn minst deels veroorzaakt worden door de ontkoppeling van het nucleoskelet
met het cytoskelet vanwege verstoorde interacties tussen lamine, nesprine en emerine. Dilate-
rende cardiomyopathie is een ernstige afwijking van de hartspier die gekenmerkt wordt door een
progressieve ventriculaire dilatatie en een verminderde systolische functie253,37. Cardiomyopathie
kan veroorzaakt worden door accumulatie van ongefarnesyleerd prelamine A.65.
Vetweefselziekten en aanverwanten
De vetweefselziekten omvatten familiale partiële lipodystrofie van het Dunnigan-type (FPLD)
en mandibulaire acrale dysplasie (MAD). FPLD wordt gekenmerkt door verlies van bijna al
het subcutaan vetweefsel uit de bovenste en onderste ledematen, billen en romp en gelijktij-
dige accumulatie van vetweefsel in gezicht en nek260. Deze patiënten zijn insulineresistent en
kunnen diabetes mellitus ontwikkelen na hun 20ste levensjaar34. MAD-patiënten lijden net als
10
20. FPDL-patiënten meestal ook aan partiële lipodystrofie en insulineresistentie, maar lijden ook aan
craniofaciale anomalieën en misvormingen van het skelet en hebben een gevlekte huidpigementa-
tie122,232. Een aanverwante aandoening is polycysteus ovariumsyndroom met insulineresistentie
maar zonder lipodystrofie94. Hierbij ontwikkelen zich in de eierstokken meerdere follikels waar-
door er geen of een onregelmatige eisprong optreedt. Mutaties die leiden tot spierdystrofieën
bevinden zich binnenin het Ig-domein van lamine A en zouden op die manier de Ig-structuur van
lamine A/C vervormen, terwijl mutaties die leiden tot partiële lipodystrofieën zich bevinden op
het oppervlak van dit domein en de driedimensionale structuur niet aantasten, maar eerder inter-
actieplaatsen met andere eiwitten verstoren138. Dit wijst erop dat beide groepen van afwijkingen
een verschillend pathomechanisme hebben34.
Perifere neuropathie
Charot-Marie-Tooth-ziekte type 2B1 is een perifere neuropathie die wordt veroorzaakt door een
mutatie in het staafvormig domein van lamine A68. Symptomen zijn een sterke reductie van de
axondensiteit, vergroting van de axonen en aanwezigheid van niet-gemyeleerde axonen.
Progeroïde syndromen
Hutchinson-Gilford progeria (HGPS) is ongetwijfeld de meest bekende laminopathie. Symptomen
zijn o.a. verlies van hoofdhaar, wenkbrauwen en wimpers op jonge leeftijd, afbraak van onder-
huids vet, scleroderma, vertraagde groei en een smal gezicht119. De schedelgrootte is meestal
normaal, net als de cognitieve ontwikkeling. Opmerkelijk is dat progeriapatiënten een fenotype
van versnelde veroudering vertonen. Aandoeningen als artritis, artrose, nagelverkalking, haar-
uitval en vermindering van onderhuids vet die bij gezonde individuën enkel voorkomen op hogere
leeftijd observeert men bij progeriapatiënten immers reeds op jonge leeftijd. De patiënten ster-
ven rond de leeftijd van 12,6 jaar (mediaan) ten gevolge van progressieve arterosclerose van de
kransslagader en de cerebrovasculaire slagader, wat leidt tot hartaanvallen en beroertes119.Het
syndroom wordt meestal veroorzaakt door een de novo 1824C>T-mutatie die geen veranderin-
gen op niveau van de aminozuursequentie induceert, maar wel een splice-site op mRNA-niveau
toegankelijk maakt voor U1 spliceosomaal RNA, hetgeen na splicing leidt tot een prelamine A
dat nabij de C-terminus 50 aminozuren mist79,67,154. Dit prelamine A∆50, of progerine, dat nog
altijd een CAAX-box heeft, zal wel gefarnesyleerd worden en naar de lamina getransporteerd wor-
den, maar daaropvolgend zullen er geen C-terminale aminozuren worden afgesplitst omdat de
herkenningsplaats voor de tweede endoproteolytische splitsing weggesplicet is. Dit progerine, dat
dus nog steeds de hydrofobe farnesylgroep bezit, zal accumuleren in de lamina101. Recent werd
ontdekt dat deze progerineaccumulatie ook leidt tot accumulatie van SUN1 in de nucleaire enve-
loppe111,49. Deze accumulaties hebben een toxisch effect. Inderdaad, progerine- en mogelijk ook
SUN1-accumulatie veroorzaken niet alleen ernstige deformaties en invaginaties van de nucleaire
enveloppe168, maar leiden ook tot diverse epigenetische veranderingen229, een verhoging van de
concentratie aan schadelijke reactieve zuurstofradicalen (ROS)266 en genomische instabiliteit149.
De 1824C>T-mutatie is de meest voorkomende oorzaak van HGPS, maar er zijn in de literatuur
11
21. al minstens 21 andere LMNA-mutaties beschreven die leiden tot progeria249. In figuur 1.7 is
het typische progeroïde fenotype alsook de deformatie van de celkern in HGPS-patiëntencellen
weergegeven.
Figuur 1.7: De linkerfoto toont een zesjarige HGPS-patiënt. De celkern in HGPS-patiëntencellen heeft
een duidelijke aberrante morfologie (rechtsonder) vergeleken met die in normale cellen
(rechtsboven)220
.
Andere progeroïde syndromen die veroorzaakt kunnen worden door LMNA-mutaties zijn atypisch
syndoom van Werner en restrictieve dermopathie121. Het syndroom van Werner wordt net als
HGPS gekenmerkt door versnelde veroudering, maar hier treden de symptomen pas op tijdens
of na de puberteit50,205. Symptomen van restrictieve dermopathie zijn een te kleine mond en
onderkaak, een dunne huid die gemakkelijk scheurt en contractie van de gewrichten10. Er werd
ook accumulatie van gefarnesyleerd prelamine A vastgesteld bij niet-progeroïde laminopathieën
als FPLD en MAD42.
Er bestaat nog geen effectieve behandeling van progeroïde syndromen150. Dierproeven en klini-
sche trials hebben echter uitgewezen dat inhibitie van de farnesylatie van prelamine A teneinde de
toxische accumulatie van progerine te vertragen een gunstig effect heeft op het ziektebeeld279,104.
In afwezigheid van farnesyltransferase kan de CAAX-box van prelamine A echter ook herkend
worden door geranylgeranyltransferase I215,261. Daarom wordt voorgesteld de patiënten ook te
behandelen met geranylgeranyltransferaseinhibitoren261. Een recente studie vond echter dat ge-
ranylgeranyltransferaseinhibitoren mogelijk ook ZMPSTE24 inhiberen, wat zou leiden tot een
verhoging van de progerineaccumulatie in plaats van een verlaging48. Progerine komt niet alleen
voor in patiëntencellen, maar wordt ook in lage concentraties gevonden in de lamina van gezonde
cellen en de concentratie neemt toe naarmate de cellen ouder worden108,221,169,222,211. Dit im-
pliceert dat de splice-ratio tussen lamine A en progerine een belangrijke rol speelt bij normale
cellulaire veroudering154. Interessant is dat ook de niet-gefarnesyleerde vorm van prelamine A,
hoewel in veel mindere mate, toxisch is en dat zelfs verhoogde nucleaire accumulatie van ge-
woon lamine A bij chondrocyten van patiënten met osteoartritis kan leiden tot een vervroegde
veroudering en apoptose41,11.
12
22. 1.4.2 Type B-laminopathieën
In sterk contrast met de pathologieën veroorzaakt door mutaties in het LMNA-gen, komen patho-
logieën die geassocieerd zijn met aberrante type B-lamines veel minder frequent voor. Men ver-
moedt dat dit te wijten is aan het feit dat mutaties in de LMNB1- en LMNB2-genen bijna altijd
lethaal zijn278. Type B-laminopathieën die toch zijn gedocumenteerd omvatten o.a. autosomaal-
dominante leukodystrofie veroorzaakt door een duplicatie van het LMNB1-gen en verworven par-
tiële lipodystrofie veroorzaakt door LMNB2-mutaties186,115. Eliminatie van lamine B1-expressie
leidt tot perinatale sterfte bij muizen, wat erop wijst dat de basisfuncties van dit lamine niet kun-
nen worden overgenomen door andere types lamines264. Inderdaad, type B-lamines zijn essentieel
voor de overleving en migratie van neuronen tijdens de hersenontwikkeling56. Verminderde ex-
pressie van lamine B1 leidt tot ernstige inhibitie van RNA-synthese, eerst door inhibitie van
RNA-polymerase II en later ook door inhibitie van RNA-polymerase I250. Ook is vastgesteld dat
de verankering van de celkern aan het cytoskelet ernstig verstoord is wanneer lamine B1 wordt
uitgeschakeld127. In sommige celtypes wordt na uitschakeling van type B-lamines echter geen
pathologie waargenomen en muizen die stierven als gevolg van knock-out van zowel LMNB1 als
LMNB2, vertoonden geen enkele waarneembare leverafwijking282. Blijkbaar zijn type B-lamines
dus niet essentieel in elk celtype.
1.4.3 Envelopathieën van lamine-geassocieerde eiwitten
Vanwege het groot aantal interactiepartners van nucleaire lamines verbaast het niet dat ook
mutaties in lamine-geassocieerde eiwitten kunnen leiden tot ernstige aandoeningen. Zo kunnen
mutaties in LAP2α leiden tot dilaterende cardiomyopathie254. De recessieve geslachtelijk over-
erfbare vorm van Emery-Dreifuss-spierdystrofie wordt dan weer veroorzaakt door een mutatie
in emerine117. Heterozygote verlies-van-functiemutaties van MAN1 leiden tot osteopoikilose en
Buschke-Ollendorffsyndroom, al dan niet in combinatie met symptomen van melorheostose182,284.
Mutaties in LBR kunnen Pelger-Huët anaomalie, een milde afwijking van de granulocyten of
Greenberg-skeletale dysplasie, een ernstige chondrodystrofie die leidt tot abortus tijdens de em-
bryonale fase, als gevolg hebben285. Ook mutaties in eiwitten die betrokken zijn bij de processing
van lamines kunnen leiden tot laminopathieën. Zo zal het verlies van de ZMPSTE24-functie lei-
den tot restrictieve dermopathie of MAD met type B-lipodystrofie aangezien ZMPSTE24 als
enige in staat is de hydrofobe groep van gefarnesyleerd prelamine A af te splitsen218,4.
1.5 Een rol voor kleine signaalmoleculen?
Recent duikt er meer en meer evidentie op dat reactieve zuurstofspecies (ROS), die verantwoor-
delijk zijn voor oxidatieve stress, een belangrijke rol spelen bij de ontwikkeling van laminopa-
thieën231. Daarnaast zijn er aanwijzingen dat calciumbindende eiwitten mogelijk een rol spelen
bij deze pathologieën. In deze sectie wordt wat dieper ingegaan op de mogelijke werkingsmecha-
nismen.
13
23. 1.5.1 Oxidatieve stress
Zuurstofgas is essentieel voor de overleving van alle organismen met een aeroob metabolisme.
Eukaryoten halen meer dan 80 % van hun ATP immers uit de oxidatieve fosforylatie, die plaats-
vindt in de mitochondria188. Hierbij wordt zuurstofgas gebruikt als finale elektronacceptor.
Deze elektronentransportketen verloopt echter niet altijd perfect. Elektronen kunnen voortijdig
“weglekken” en naar zuurstofgas getransfereerd worden, waarbij superoxide (O·–
2 ) ontstaat190.
Dit gebeurt vooral bij complex I, waar O·–
2 in de matrix terecht komt151,16. O·–
2 kan ook in de
intermembraanruimte geproduceerd worden door complex III, maar deze O·–
2 -productie is ver-
waarloosbaar vergeleken bij die door complex I183. O·–
2 kan op zijn beurt verder omgezet worden
naar H2O2 en .OH257. O·–
2 , H2O2 en .OH worden reactieve zuurstofspecies (ROS) genoemd om-
dat ze (veel) reactiever zijn dan gewoon zuurstofgas. De oxidatieve fosforylatie en ROS-productie
door mitochondria wordt weergegeven in figuur 1.8.
Figuur 1.8: Weergave van de oxidatieve fosforylatie en de hiermee geassocieerde ROS-productie in een
mitochondrion16
. In complex I wordt NADH gereduceerd, waarbij er per NADH-molecule
twee elektronen worden overgedragen naar ubiquinon en twee protonen uit de matrix naar
de intermembraanruimte worden gepompt. Complex II levert additionele elektronen door
oxidatie van barndsteenzuur. Via complex III worden de elektronen overgedragen naar
cytochroom c en worden nogmaals twee protonen naar de intermembraanruimte gestuurd.
14
24. De elektronen geleverd door cytochroom c zullen worden overgedragen op complex IV, dat
opnieuw twee protonen over het membraan pompt en de ontvangen elektronen transfereert
naar zuurstofgas waardoor water gevormd wordt. Complex V zal tot slot de opgebouwde
protonengradiënt benutten om ATP te genereren. Complex I, en in mindere mate com-
plex III kunnen echter elektronen “lekken” naar O2 waardoor O·–
2 gevormd wordt. O·–
2 kan
spontaan of door Mn-superoxidedismutase (Mn-SOD) in de matrix of Zn-SOD in de in-
termembraanruimte en het cytosol omgezet worden naar H2O2. In de Fentonreactie kan
H2O2 dan op zijn beurt reageren met metaalionen waarbij het zeer reactieve .
OH-radicaal
gevormd wordt257
.
Onder bepaalde condities kan ook complex II bijdragen aan de O·–
2 -productie200 en ook mitochon-
driale enzymen als 2-oxoglutaraatdehydrogenase en elektrontransferflavoproteïne-co-enzym Q10-
oxidoreductase kunnen in min of meerdere mate ROS genereren241,240. De mate van mitochon-
driale ROS-productie hangt deels af van de mitochondriale membraanpotentiaal die veroorzaakt
wordt door de export van protonen naar de intermembraanruimte tijdens de oxidatieve fosfory-
latie. Een lichte afname van de membraanpotentiaal leidt tot een afname van de ROS-productie
doordat de elektronen steviger gebonden zijn aan de elektronentransportcomplexen en daardoor
minder gemakkelijk kunnen “weglekken” 216. Sterke depolarisatie leidt echter tot een toename
van ROS214. ROS kunnen op hun beurt leiden tot het openen van de mitochondrial permea-
bility transition pore, wat leidt tot depolarisatie, fissie en meer ROS-vorming133. Beschadigde
mitochondria worden gedepolariseerd, scheiden zich af door fissie en worden verwijderd door
mitofagie281. Naast ROS-productie door de mitochondria worden ROS ook geproduceerd door
NADPH-oxidasen, in peroxisomen, door cytochroom P450 en door lipo-oxygenase17,23,158.
ROS zijn zeer reactief. Zodoende zal een te hoge concentratie ROS leiden tot oxidatie van lipiden
en DNA en de accumulatie van irreversibel geoxideerde eiwitten5. Geaccumuleerde ROS-schade
leidt ook tot reductie van de mitochondriale energieproductie en transcriptionele downregula-
tie van mitochondriale genen196,35 alsook tot schade aan de telomeren191,208. Men gaat ervan
uit dat ROS-schade in belangrijke mate bijdraagt tot het verouderingsproces86. Om schade
door ROS tegen te gaan, beschikken cellen over verschillende anti-oxidatieve systemen, zoals
ROS-neutraliserende enzymen als katalase, superoxidedismutase en glutathionperoxidase alsook
antioxidanten (bv. vitamine A, C en E alsook glutathion), die ROS neutraliseren door er zelf
mee te reageren86. Oxidatieve stress wordt gedefinieerd als het uit balans zijn van pro- en an-
tioxidanten. Bij een sterk gereduceerde mitochondriale redoxpotentiaal, zal de ROS-productie
stijgen, waardoor die de neutraliserende capaciteit van de antioxidanten zal overschrijden. In
een sterk oxiderende omgeving, zal de antioxidatieve capaciteit om ROS te neutraliseren te
beperkt zijn. Beide situaties leiden dus tot een verhoogde cellulaire stress door ROS9. Lage
concentraties ROS hebben echter een functie in de normale cellulaire signalisatie, bijvoorbeeld
door reversibele oxidatie van een reactieve cysteïneresidu’s in eiwitten, waardoor hun werking
verandert207,85,64. Beperkte hoeveelheden ROS zouden zelfs de levensduur verlengen in Caenor-
habditis elegans 223,116. ROS kunnen tevens de genexpressie wijzigen door epigenetische effecten.
Bepaalde DNA-methylatiepatronen veranderen o.i.v. ROS en redoxgevoelige transcriptiefacto-
15
25. ren als pRb, p53, FoxO en NF-κB worden geactiveerd90,6. Van de tumorsuppressorfactor p53 is
geweten dat hij bij lage ROS-concentraties de antioxidant-respons induceert64. Bij hogere ROS-
concentraties activeert hij echter genen die groeivertraging, senescentie en apoptose induceren217.
ROS zijn ook betrokken bij de pro-inflammatoire respons239,36.
Oxidatieve stress in laminopathieën
Uit recente onderzoeken blijkt dat laminopathieën dikwijls gepaard gaan met verhoogde ROS-
concentraties en een grotere gevoeligheid aan oxidatieve stress231. De aanwezigheid van progerine
bevordert niet alleen de ROS-productie en de accumulatie van geoxideerde eiwitten,266 maar ver-
mindert ook de hoeveelheid ROS-neutraliserende enzymen als Mn-SOD, katalase en glutathion-
peroxidase276. Opmerkelijk is dat HGPS-fibroblasten repetitieve niet-lethale transiënte rupturen
van de celkern vertonen, wat leidt tot tijdelijke mislokalisatie van zowel cellulaire als nucleaire
componenten en mogelijk zelfs tot invaginatie van volledige organellen als mitochondria in de
celkern69,262. Wanneer dit laatste het geval is, zal dit leiden tot ROS-productie in de kern, met
verhoogde DNA-schade tot gevolg. Bovendien zullen nucleaire rupturen ook leiden tot verlies
van perifeer OCT1, waardoor OCT1-afhankelijke genen, die betrokken zijn bij de oxidatieve-
stressrespons geactiveerd worden. Knockout van lamine A leidt tot verhoogde concentraties aan
katalase, SOD en glutathion-S-transferase193. Type A-lamines bezitten in hun staartdomein drie
unieke cysteïneresidu’s die afwezig zijn in type B-lamines en die verantwoordelijk zijn voor de
vorming van intra- en intermoleculaire disulfidebruggen. Deze cysteïnes spelen een zeer belang-
rijke rol, aangezien verstoring van hun werking door mutatie, hyperoxidatie of knockdown van
het volledige lamine A/C, in combinatie met milde oxidatieve stress, leiden tot premature se-
nescentie193. Men vermoedt dat lamine A dient als een ROS-sink in de kern waarbij oxidatie
van lamine A andere minder abundante en meer kritieke eiwitten beschermt tegen transiënte,
milde oxidatieve stress231. Lamines kunnen echter maar bufferen tot op een zeker niveau waar-
door chronische of sterke acute oxidatieve stress leidt tot irreversibele oxidatieve schade aan de
lamina. Tevens is het opvallend dat het fenotype van de type A-laminopathie Charcot-Marie-
Tooth-ziekte ook veroorzaakt kan worden door mutaties in GADP1, een eiwit dat aanwezig is in
het buitenste mitochondriale membraan en twee GST-domeinen bezit45. Deze GST-domeinen
spelen een sleutelrol bij de detoxificatie en reductie van ROS. Bij Zmpste24-deficiënte muizen
zijn de kleinere isovormen van vimentine, een intermediair filament verantwoordelijk voor de
organisatie van de mitochondria251,184 downgereguleerd, terwijl verschillende subunits van de
complexen verantwoordelijk voor de oxidatieve fosforylatie opgereguleerd zijn192. Ook type B-
lamines spelen een rol bij oxidatieve stress. Blootstelling aan oxidatieve stress leidt immers tot
accumulatie van lamine B1 door activatie van de p38-MAPK-pathway13. Vermoedelijk tracht
de cel op deze wijze oxidatieve stress tegen te gaan. Het is immers bekend dat downregulatie
van lamine B1 de expressie van verschillende antioxidanten wijzigt door regulatie van Oct-1 of
p53163,226.
16
26. 1.5.2 Calciumsignalisatie
Calcium is een belangrijke intracellulaire signalisatiemolecule betrokken bij zeer diverse proces-
sen als bevruchting, proliferatie, ontwikkeling, geheugenopslag en spiercontractie21. De vrije
calciumconcentratie in het cytosol wordt daarom constant gehouden op ongeveer 100 nM in het
cytosol, waar dit in de extracellulaire ruimte enkele mM is55,28. Dit wordt bewerkstelligd door
Ca2+
-ATPasen, Na+
/Ca2+
-uitwisselaars en bufferende moleculen. De eerste twee zorgen voor
actieve export van calcium naar de extracellulaire ruimte en de mitochondria, alsook, in het
geval van de Ca2+
-ATPasen, naar het ER en het Golgi20,51. In de mitochondria kan calciumuit-
wisseling daarnaast ook gebeuren via Ca2+
/H+
-uitwisselaars en de "mitochondrial permeability
transition pores". Veranderingen in voltage, of de binding van intra- of extracellulaire liganden
zullen leiden tot de transiënte opening van calciumkanalen in het plasmamembraan en het ER,
waardoor de calciumconcentratie in het cytosol lokaal kan oplopen tot 10 µM51. Na stimulatie
nemen lokale mitochondria het calcium snel op via een uniporter om het nadien langzaam vrij
te stellen in het cytosol zodat het kan worden geëxporteerd door de cytoplasmatische Ca2+
-
exporters180,20. De daaropvolgende signaaltransductiecascade leidt finaal tot de stimulatie van
transcriptiefactoren (bv. CREB, NFAT3 en MEF2) die genen zullen activeren die betrokken zijn
bij de diverse cellulaire responsen20.
Het is ook bekend dat het ROS-metabolisme en het calciummetabolisme elkaar wederzijds op
vele manieren beïnvloeden277. Zo kunnen ROS leiden tot een verhoging van de frequentie van
zogenaamde “Ca2+
-sparks”, zeer lokale en kortstondige vrijstellingen van Ca2+ 275. Verder leidt
mitochondriale depolarisatie tot een toename van de intracellulaire Ca2+
-concentratie, een verho-
ging van het aantal Ca2+
-sparks en een transiënte inhibitie van de Ca2+
-gevoelige K+
-kanalen52.
De betrokkenheid van calciumbindende eiwitten bij het herstel van beschadigde plasmamem-
branen is goed beschreven in de literatuur. Een gescheurde plasmamembraan is immers niet in
staat zichzelf te herstellen indien de poriën groter zijn dan 0,2 µm vanwege de membraanspanning
en trekkrachten uitgeoefend door het subcorticaal cytoskelet75. Wanneer het plasmamembraan
beschadigd wordt, zal dit leiden tot een influx van calcium vanuit de extracellulaire ruimte.
Hierdoor worden calciumafhankelijke fusogene eiwitten gemobiliseerd, die een snelle fusie van
membraanvesikels met het plasmamembraan zullen mediëren75. Deze membraanvesikels kunnen
zowel afkomstig zijn van het lysosoom als van het enlargosoom, een exocytotisch compartiment
gecoat met annexine A2 waarin het membraaneiwit AHNAK/desmoyokine aanwezig is24,170,155.
Figuur 1.9 geeft aan hoe het membraanherstelproces zich voltrekt in spiercellen.
17
27. Figuur 1.9: Herstel van het plasmamembraan in spiercellen: beschadiging van het plasmamembraan
leidt tot influx van calcium en oxidanten en de ontvouwing van cholesterol. De motoreiwit-
ten kinesine en myosine zullen vervolgens membraanherstelvesikels transporteren naar de
beschadigde plaats, een proces dat op een cholesterol- en oxidatieafhankelijke manier wordt
gefaciliteerd door Mitsugumine 53 (MG53). De vesikels hechten aan geoxideerd MG53 en
fuseren met elkaar en het plasmamembraan. Ze worden daarbij geassisteerd door SNAREs,
dysferline en annexines, die allen afhankelijk zijn van calcium110
.
Annexines zijn eiwitten die op een calciumafhankelijke manier kunnen binden aan negatief ge-
laden fosfolipiden en die vier of acht zgn. annexinerepeats bezitten in hun eiwitstructuur. Over
het algemeen lijken ze zowel een cytoplasmatische als membraangebonden lokalisatie te verto-
nen, maar een verhoging van de calciumconcentratie leidt tot meer membraangebonden annex-
ines97,175. Annexines kunnen onder andere binden aan eiwitten van de S100-familie. S100-
eiwitten zijn kleine dimere calciumbindende eiwitten die gevarieerde functies hebben in de cel,
waaronder fosforylatie. Gebonden aan annexines reguleren ze de organisatie van membranen en
vesikels en kunnen ze ook membraanherstel mediëren175,206.
18
28. Calciumbindende eiwitten in laminopathieën
HGPS-cellen bezitten een verhoogde concentratie aan vrij calcium in het cytoplasma267. Zeer
recent onderzoek toont bovendien aan dat calcium vereist is voor de associatie van progerine
met het kernmembraan. Binding van calcium aan het staartdomein induceert immers een con-
formationele wijziging t.h.v. het Ig-domein die verhindert dat de farnesylgroep weggeborgen
wordt in een hydrofobe regio van het staartdomein128. De toestand van het kernmembraan na
het optreden van een ruptuur in laminopathiecellen (vnl. LMNA-deficiënte cellen) vertoont ook
veel gelijkenissen met het gescheurde plasmamembraan in een spiercel. Het dubbele membraan
dat de kern omhult, is een uitloper van het ER, waarin de calciumconcentratie ongeveer 1 mM
bedraagt55. Bij het barsten van dit membraan, zal dus ook calcium worden vrijgesteld. Net
als bij rupturen van het plasmamembraan is spontaan herstel moeilijk vanwege membraanspan-
ning en omdat een onderliggend netwerk (de lamina) mogelijk door contractie spontaan herstel
verhindert.62. Observaties wijzen echter uit dat ook het kernmembraan zich snel herstelt van
deze rupturen, aangezien De Vos et al.69 herstel van nucleaire compartimentalisatie waarnamen
na 5 tot maximaal 60 minuten. Interessant is dat calciumbindende eiwitten als annexine A1,
annexine A4, annexine A11 en S100A6 ook werden waargenomen in associatie met het kern-
membraan82,178. De vraag stelt zich dus of dergelijke eiwitten een rol spelen in het herstel van
kernmembraanrupturen bij laminopathieën.
1.6 Objectieven van deze thesis
Ondanks de hoger aangehaalde hypothesen van lamine A/C als ROS-buffer en de zeldzame
inclusie van mitochondria in de kern na herstel van rupturen van het kernmembraan, blijft
het onduidelijk hoe bijvoorbeeld progerine-accumulatie kan leiden tot een algemene verhoging
van de ROS-gehaltes. De hypothese van de betrokkenheid van calciumbindende eiwitten bij
membraanherstel in laminopathieën is ook nog nooit experimenteel getoetst. Deze thesis heeft
dus als doel een bijdrage te leveren aan het ophelderen van deze verbanden. Eerst wordt nagegaan
welke impact perturbaties van de lamina hebben op de lokalisatie van eiwitten in hun directe
omgeving, meer bepaald lamine B en SUN2. Daarna worden ROS-gehaltes geëvalueerd en wordt
ook de mitochondriale morfologie en potentiaal bestudeerd. Tot slot wordt bekeken hoe de de
expressiepatronen van calciumbindende eiwitten annexine A11 en S100A6 wijzigen na verstoring
van de lamina.
Om de invloed van ROS en calciumsignalisatie op de pathologieën van de lamina te evalueren
is het echter cruciaal om over goede modellen te beschikken zodanig dat de bekomen resultaten
ook enige klinische relevantie hebben. Celculturen lijken hiervoor een geschikte keuze aangezien
ze de kleinste eenheden van het leven zijn die toch als geïntegreerd geheel werken en reageren op
een veranderende omgeving. Ze zijn klein en schaalbaar en gemakkelijk genetisch, chemisch en
mechanisch te manipuleren, in tegenstelling tot bijvoorbeeld proefdieren. In cultuur gebrachte
patiëntencellen zijn tot nu toe de meest gebruikte modellen. Zij hebben echter als nadeel dat er
een grote variabiliteit bestaat in hun genetische achtergrond en dat ze vanwege hun zeldzaamheid
19
29. moeilijk te verkrijgen zijn. Daarom werd in het eerste deel van deze thesis een aantal experimen-
tele methoden (waaronder knockdown voor ZMPSTE24) op punt gesteld om zo de effecten van
prelamine A-accumulatie in een primaire celcultuur met eenzelfde genetische achtergrond als de
controle te kunnen bestuderen.
20
30. 2. Materiaal en methoden
2.1 Celculturen
2.1.1 Onderhoud en bewaring van de celculturen
Alle experimenten werden uitgevoerd op primaire normale humane dermale fibroblasten (NHDF)
alsook op patiëntencellen met een lethale homozygote verlies-van-functiemutatie (Y259X/Y259X)
voor LMNA (HDF−/−). NHDF werden onderhouden in Advanced Dulbecco’s Modified Eagle’s
Medium (DMEM) (Gibco, 12491) waaraan 2 % foetaal bovien serum (FBS) (Gibco, 10500-056) en
1 % penicilline-streptomycine-L-glutamine (PSL) (Gibco, 10378-016) is toegevoegd. Dit medium
wordt hierna DMEM+suppl. genoemd. HDF−/− werden onderhouden in Advanced DMEM/F-
12 (Gibco,12634-010) waaraan 10 % FBS en 1 % PSL werd toegevoegd. Alle culturen werden
bewaard in een Innova CO-170 incubator (New Brunswick Scientific) bij 37 ◦C en 5 % CO2.
Celmanipulaties vonden plaats in een klasse II-laminaire flow.
Splitsing van de cellen gebeurde via trypsinisatie: cellen werden eerst gewassen met fosfaatbuffer
(PBS) zonder MgCl2 en CaCl2 (Gibco, 14190-094). Nadien werd 0,05 % trypsine in DMEM
op de cellen gebracht en 1 min. geïncubeerd bij 37 ◦C. De trypsineactiviteit werd stopgezet
door toevoeging van DMEM+suppl. Nadien werden de cellen gecentrifugeerd bij 196 g, gere-
suspendeerd in DMEM+suppl. en uitgezet in verse cultuurflesjes. Cellen die gebruikt werden
in experimenten werden voorafgaand aan de uitzetting geteld. Deze telling gebeurde a.h.v. een
Bürker-Türktelkamer (Marienfeld; diepte: 0,100 mm) waarbij dode cellen gekleurd werden met
0,4 % trypaanblauw (Gibco, 15250-061). De replicatieve ouderdom van de cellen werd uitgedrukt
als passage (p), het aantal keren dat de cellen reeds het splitsingsprotocol doorlopen hebben.
De voorraad primaire cellen werd bewaard in cryovials met 900 µl FBS en 100 µl dimethylsu-
foxide (DMSO, Sigma-Aldrich, D8418) in vloeibare stikstof (-196 ◦C). Invriezen gebeurde door
de cryovials 24 uur te bewaren bij -80 ◦C in een isopropanolvat, waarna ze werden overgebracht
naar het vloeibarestikstofvat. Uitvriezen verliep door de cryovials op te warmen in het warm-
waterbad (37 ◦C) tot de inhoud bijna volledig ontdooid was, waarna de cellen onmiddellijk werd
overgebracht naar een T25-cultuurfles waarin reeds 5 ml DMEM+suppl. aanwezig was bij een
temperatuur van 37 ◦C.
2.1.2 Transfectie van de celculturen
In het kader van deze thesis werden knockdowns gemaakt voor lamine A/C (LMNA-kd) en ZMP-
STE24 (ZMPSTE24-kd). Dit gebeurde via RNA-interferentie (RNAi). RNAi is een proces waar-
bij korte (19-25 nucleotiden) RNA-fragmenten binden op een RNasecomplex (het RISC-complex),
dat complementair mRNA zal herkennen en degraderen waardoor er geen transcriptie van dat
mRNA meer kan plaatsvinden3. Het resulterende fenotype heeft dus een sterk verlaagde aanwe-
zigheid van het eiwit dat werd uitgeschakeld. Concreet werd hierbij synthetisch dubbelstrengig
21
31. RNA (dsRNA) van 19-22 nucleotiden lengte met een antisense-homologie tegen het gewenste
gen ingebracht in de cel via liposoom-gemedieerde transfectie. De gebruikte dsRNA’s zijn Tuschl
(sense: CUGGACUUCCAGAAGAAGAACA, Biolegio), siGENOME Lamin A/C Control siRNA
(Thermo Scientific, D-001050-01-05), ZMPSTE24 siRNA volgens Gruber et al.105 (AAGCTAT-
CTTCGGGGCCGTG, Biolegio) en siGENOME Human ZMPSTE24 siRNA (Thermo Scientific,
M-006104-02-0005). Beide Biolegio-siRNA’s hadden overhangende TT aan het 3’-uiteinde. Als
negatieve controle werden stealth (Negative Control, Invitrogen, 46-2001) en siGENOME Non-
Targeting siRNA Control Pool #1 (Thermo Scientific, D-001206-13-05) gebruikt. Transfectie
in een T25-celcultuurfles gebeurde als volgt: 12 µl lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies,
13778-075) werd toegevoegd aan een eppendorfje met 500 µl DMEM zonder supplementen. Te-
vens werd 5 µg dsRNA toegevoegd aan een ander epje met 500 µl DMEM zonder supplementen.
Na 1 – 5 minuten werd de lipofectaminemix zachtjes bij de dsRNA-mix gedruppeld. Dit mengsel
werd 20 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Ondertussen werden alle cellen gewassen
met DMEM zonder supplementen, waarna 1 ml DMEM zonder supplementen aan de cellen werd
toegevoegd. Na de incubatie werd het transfectiemengsel zacht druppelend op de celcultuur ge-
bracht. Daaropvolgend werden de cellen 1 uur geïncubeerd bij 37 ◦C en 5 % CO2, waarna 5 ml
DMEM+suppl. werd toegevoegd. Ten slotte werden de cellen 48 uur geïncubeerd bij 37 ◦C en
5 % CO2. Transfecties die niet werden uitgevoerd in een T25, vereisen andere volumes. Voor
glass bottoms moet men alle hier vermelde volumes vermenigvuldigen met een factor 1/2, voor
een 12 wellplaat is dit 1/4 en voor een 96 wellplaat is dit 1/40.
2.1.3 Chemische behandeling van de celculturen
Cellen werden behandeld met volgende chemicaliën: saquinavirmesylaat (SAQ, Sigma-Aldrich,
S8451), zoledroninezuur (ZOL, Santa Cruz, sc-202859), farnesyltransferase-inhibitor-276-triflu-
oroacetaat (FTI, Sigma-Aldrich, F9553) en N-acetyl-S-farnesyl-L-cysteïne-methylester (AFCME,
Enzo Life Sciences, ALX-290-010-M010). SAQ is een HIV-protease-inhibitor die ook het ZMP-
STE24-enzym inhibeert, waardoor het in staat is accumulatie van gefarnesyleerd prelamine A te
induceren26. AFCME is een competitieve inhibitor van ZMPSTE24, waardoor het eveneens ac-
cumulatie van gefarnesyleerd prelamine A induceert. ZOL is een geneesmiddel tegen osteoporose
dat in staat is de biosynthese van farnsesylpyrofosfaat, een cosubstraat van farnesyltransferase en
een precursor van geranylgeranylpyrofosfaat, te inhiberen. Hierdoor inhibeert ZOL de prenylatie,
hetgeen leidt tot accumulatie van niet-gefarnesyleerd prelamine A. FTI is een inhibitor die veel
selectiever is voor farnesyltransferase dan voor geranylgeranyltransferase I, waardoor behande-
ling met FTI eveneens leidt tot accumulatie van ongefarnesyleerd prelamine A, maar alternatieve
geranylgeranylatie niet uitgesloten is66. De 10 mM-stockoplossingen van AFCME, FTI en SAQ
waren opgelost in DMSO, de 10 mM stockoplossing van ZOL was opgelost in NaOH. De finale
concentraties waaraan de cellen werden blootgesteld in DMEM+suppl. waren de volgende: 10 µM
AFCME, 10 µM FTI, 20 µM SAQ en 1 µM ZOL. Aan de controle werd het oplosmiddel DMSO
toegevoegd in een hoeveelheid overeenkomstig met de behandeling die de grootste hoeveelheid
DMSO kreeg toegediend (dit was SAQ). Na een eerste incubatie van 24 uur in het behandelings-
medium werd vers medium met de chemische component toegediend waarna de cellen opnieuw
22
32. 24 uur werden geïncubeerd.
2.2 Genomics
2.2.1 RNA-extractie
RNA werd geëxtraheerd met de "RNeasy Mini Kit"(Qiagen, 74104) waarbij het protocol "Purifi-
cation of Total RNA from Animal Cells Using Spin Technology"(RNeasy Mini Handbook, versie
09/2010) werd gevolgd. De cellen werden geoogst via trypsinisatie (zie 2.1.1). Resuspenderen
gebeurde nu echter in 1 ml PBS, waarna de cellen opnieuw werden gecentrifugeerd. Het superna-
tans werd afgegoten, waarna 350 µl RLT-buffer werd toegevoegd en 5 seconden werd gevortext
op volle snelheid. Nu werd 350 µl 70 % ethanol toegevoegd waarna het mengsel gehomogeniseerd
werd door op en neer te pipetteren. 700 µl van dit mengsel werd op een RNeasy Mini Spin Column
gebracht waarna 15 seconden gecentrifugeerd werd bij 10 000 g. Het eluaat werd afgegoten, 350 µl
RW1-buffer werd toegevoegd en de kolom werd een aantal keer geïnverteerd, waarna opnieuw
15 seconden bij 10 000 g werd gecentrifugeerd. Het eluaat werd afgegoten, waarna 80 µl 12,5 %
DNase I in RDD-buffer op de kolom werd gebracht en 15 minuten werd geïncubeerd. Vervolgens
volgde opnieuw een wasstap met 350 µl RW1-buffer. Na verwijdering van het eluaat, werd 500 µl
RPE-buffer toegevoegd, waarna de spin columns werden geïnverteerd, gecentrifugeerd en het elu-
aat werd verwijderd. Nu werden de spin columns overgebracht naar een nieuw 2 ml-epje, waarna
500 µl RPE-buffer werd toegevoegd en 2 minuten werd gecentrifugeerd bij 10 000 g. De spin co-
lumns werden overgebracht naar een leeg 1,5 ml-epje, waarna 2 minuten gecentrifugeerd werd bij
20 870 g om de membraan te drogen. Vervolgens werden de spin columns overgebracht naar een
nucleasevrij 1,5 ml-epje en werd 30 µl gedistilleerd water op de spin columns gebracht. Het RNA
werd geëlueerd door 1 minuut te centrifugeren bij 10 000 g. Na elutie werd 2 µl RNA-oplossing
genomen om de concentratie te bepalen op de NanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Sci-
entific), waarbij nucleasevrij water werd gebruikt als blanco. De rest van de RNA-oplossing werd
zo snel mogelijk overgebracht naar de −80 ◦C-diepvriezer om een goede bewaring te verzekeren.
Alle stalen hadden verwaarloosbare contaminatie aan proteïnen (A260/A280-ratio > 2) of andere
contaminanten als EDTA of fenolen (A260/A280-ratio > 1,7).
2.2.2 cDNA-synthese
cDNA-synthese werd uitgevoerd aan de hand van SuperScript III Reverse Transcriptase-protocol
(Invitrogen, revisiedatum 7 december 2004). Volgende zaken werden toegevoegd aan RNasevrije
microcentrifuge-epjes (Biolabo, 3245-00): 1 µg RNA-staal, 1 µl oligo(dT) (50 µM) (Invitrogen,
18418-020), 1 µl dNTP-mix (10 µM) (Invitrogen, 18427-013) en nucleasevrij water tot een to-
taal volume van 13 µl. Vervolgens werden de microcentrifuge-epjes 5 minuten geïncubeerd bij
65 ◦C, waarna ze 1 minuut werden geïncubeerd op ijs. De microcentifuge-epjes werden kort ge-
centrifugeerd om condens op de dekseltjes terug te collecteren. Daarna werden volgende zaken
toegevoegd: 4 µl 5x First-Strand Buffer (Invitrogen, 18080-093), 1 µl DTT (0,1 M) (Invitrogen,
18080-093), 1 µl RiboLock RNase Inhibitor (Thermo Scientific, # EO0381) en 1 µl Superscript
23
33. III RT (Invitrogen, 18080-093) De inhoud van de microcentrifuge-epjes werd gemixt door zacht
op en neer te pipetteren. Tot slot werden de microcentrifuge-epjes 60 minuten geïncubeerd bij
50 ◦C. De reactie werd geïnactiveerd door 15 minuten te verhitten tot 70 ◦C.
2.2.3 qPCR
Voor aanvang van de qPCR wordt 70 µl nucleasevrij water toegevoegd aan de cDNA-stalen.
De qPCR wordt uitgevoerd in een 72 well PCR-ring. Aan elke well wordt 5 µl forward primer
(Biolegio, 5 µM), 5 µl reverse primer (Biolegio, 5 µM), 10 µl Sensimix (Bioline, QT650-05), 4 µl
nucleasevrij water en 1 µl cDNA-staal toegevoegd. Dit gebeurt met behulp van een CAS1200-
pipetteerrobot (Qiagen). Daarna wordt de 72 wellring geseald m.b.v. een Gene Disk 72 Heat
Sealer (Qiagen) en in het Rotor Gene 3000 qPCR-toestel (Qiagen) geplaatst. De ring werd eerst
10 minuten opgewarmd bij 95 ◦C. Vervolgens werden 40 cycli doorlopen van 35 seconden bij
95 ◦C om denaturatie van het cDNA te bewerkstelligen, 35 seconden bij 60 ◦C om het Super-
script III RT de gelegenheid te geven om te binden aan zijn template en 50 seconden bij 72 ◦C
waarin de amplificatie plaatsvindt. Voor normalisatie werd gebruik gemaakt van primers voor
de genen AP2A1 en VPS52, waarvan de expressie ongewijzigd blijft bij laminaperturbaties. De
gebruikte primers waren de volgende: AP2A1 (forward: GGTGTTCATCTCCGACATCC, re-
verse: TCTCCTTTGAACTTGGAGCG), VPS52 (forward: TGCAGATGACAGCAAAGAGG,
reverse: CACAAATGCCACTAAACCCC), ZMPSTE24 (forward: CGAGAAGCGTATCTT-
CGGGG, reverse: TGTGCTAGGAAGGTCTCCCA) en LMNA (forward: TGGACGAGTAC-
CAGGAGCTT, reverse: ACTCCAGTTTGCGCTTTTTG). Voor elke combinatie van cDNA en
primer werden drie replica’s uitgevoerd. De data werd bekomen in de Corbett Rotor-Gene 3000
Application Software (versie 6.1, build 93). Daar werden enkel de take off-waarden weerhouden
waarvoor voldaan is aan volgende condities:
• De amplificatiewaarden (comparative quantitation in de software) zijn groter dan 1,6.
• De smeltcurve vertoont één duidelijke piek die mooi samenvalt voor alle drie replica’s bij
een temperatuur hoger dan 60 ◦C.
• De take off-waarde van elke biologische replica wijkt niet meer dan 0,3 af van de take
off-waarde van een andere biologische replica. Indien één biologische replica meer dan 0,3
afwijkt van de andere twee, wordt deze uit de dataset verwijderd. Indien alle biologische
replica’s meer dan 0,3 van elkaar afwijken, wordt deze conditie volledig verwijderd uit de
dataset.
De take off-waarden werden vervolgens geëxporteerd naar Microsoft Excel 2013 en geanalyseerd
volgens de ∆∆CT-methode zoals beschreven door Livak & Schmittgen152. Hierbij wordt voor
elke behandeling het gemiddelde van de take off-waarden van de drie replica’s afgetrokken van
het gemiddelde over de drie replica’s van alle referentiegenen van die behandeling (in dit geval
AP2A1 en VPS52). Dit getal wordt ∆CT genoemd. De ∆∆CT-waarde wordt bekomen door
voor elke behandeling de ∆CT-waarde van de controle af te trekken. De uiteindelijke fold change
t.o.v. de controle voor een bepaald gen is dan 2∆∆CT .
24
34. 2.3 Immunofluorescentiekleuring
Cellen werden opgekweekt op optische glaasjes in 12 wellplaten. 48 uur na de eerste chemische of
genetische perturbatie werden de cellen gewassen met 1 ml PBS, waarna ze 30 minuten gefixeerd
werden in 2 % paraformaldehyde in PBS. Nadien werden de cellen opnieuw gewassen met 1 ml
PBS. Daarna werd 1 ml PBS aan de cellen toegevoegd waarbij 2 druppels 2 % paraformaldehyde
werden toegediend. De 12 wellplaten werden geseald met parafilm en bewaard bij 4 ◦C.
Voor de eigenlijke kleuring ging men als volgt te werk. De cellen werden driemaal 5 minuten
gewassen met 1 ml PBS. Dan werden de cellen 5 minuten gepermeabiliseerd met 1 ml 0,5 % Triton
X-100 (Sigma-Aldrich, 9002-93-1), waarna de cellen opnieuw 5 minuten met 1 ml PBS werden
gewassen. Nadien volgde de primaire blokkering: de glaasjes met cellen werden overgebracht naar
een druppel 60 µl 50 % FBS in PBS en 20 minuten geïncubeerd. Vervolgens werden de glaasjes
60 minuten geïncubeerd op een druppel 60 µl primairantilichaamoplossing in 50 % FBS. Na drie
nieuwe wasstappen van 5 minuten in 1 ml PBS, volgde 20 minuten secundaire blokkering op een
druppel 60 µl 50 % FBS. Daarna werden de glaasjes 30 minuten geïncubeerd op een druppel 60 µl
secundairantilichaamoplossing in 50 % FBS. Tot slot werd nogmaals driemaal 5 minuten gewassen
in 1 ml PBS. Dehydratatie gebeurde door telkens 3 minuten te incuberen in achtereenvolgens
70 %, 90 % en 100 % ethanol. Er werd een oplossing van 1 mg/ml 4’,6-diamidino-2-fenylindool
(DAPI) (Invitrogen, D-1306) in methanol gemaakt. Hieruit werd een 1 µl/ml DAPI-oplossing in
Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000) bereid. Van deze laatste oplossing
werd een druppel (9 µl) op een draagglaasje geplaatst, waarna een glaasjes met cellen 2 minuten
geïncubeerd werd op deze druppel. Vervolgens werd het draagglaasje omgekeerd om overbodige
Vectashield-oplossing te laten weglekken. Om de glaasjes vast te hechten, werd nagellak (CG,
Boundless Color) op de randen gesmeerd, die 10 minuten werd gedroogd. Draagglaasjes werden
in het donker bewaard bij 4 ◦C. Vanaf de incubatie met secundaire, aan fluorochroom gekoppelde
antilichamen, gebeurde het protocol in het schemerdonker (d.w.z. dat de blinderingen half werden
neergelaten en een scherm werd opgesteld om direct zonlicht te weren). De gebruikte antilichamen
met hun corresponderende verdunning worden weergegeven in tabel 2.1.
Het Lamin B (C-20)-antilichaam van Santa Cruz detecteert volgens de fabrikant vooral lamine
B1, maar kan ook gebruikt worden om lamine B2 te detecteren, vandaar dat we als ligand
slechts algemeen “lamine B” vermelden. Als secundaire antilichamen werden Donkey anti-goat
Fab (Dylight 649 deep red) (Jackson, 711506152), Donkey anti-rabbit Fab (Dylight 549 red)
(Jackson, 711506152) en Donkey anti-mouse Fab (Dylight 488 green) (Jackson, 715486150), allen
in een 1/300-verdunning in FBS, gebruikt.
2.4 Live Cell Imaging
2.4.1 TMRM-kleuring
TMRM is een fluorescente molecule die sterker zal accumuleren in de matrix van de mitochon-
dria naarmate de Nernstpotentiaal over het binnenste mitochondriale membraan hoger is219,179.
25
35. Tabel 2.1: Gebruikte primaire antilichamen en hun verdunningen. Elke rij geeft telkens de naam van
ligand waarop het primaire antilichaam bindt, de naam, de verdunning, het bedrijf en het
catalogusnummer van het primaire antilichaam.
ligand naam dier verdunning bedrijf cat.-nr.
prelamine A Lamin A (C-20) geit 1/200 Santa Cruz sc-6214
lamine A Lamin A konijn 1/1000 Abcam ab26300
lamine B Lamin B (C-20) geit 1/1000 Santa Cruz sc-6216
lamine B1 Lamin B1 konijn 1/1000 Abcam ab16048
SUN2 SUN2 (whole serum) konijn 1/500 Abcam ab87036
vimentine Vimentin konijn 1/1000 Abcam ab45939
S100A6 S100alpha6 (CACY-100) muis 1/1000 Abcam ab11181
annexine A11 Annexin XI (E10) muis 1/1000 Santa Cruz sc-271487
annexine A11 Annexin XI (L19) geit 1/500 Santa Cruz sc-9322
pRbSer608-PO4 Rb (phospho S608) konijn 1/500 Abcam ab60025
PCNA PCNA konijn 1/2000 Abcam ab18197
Het TMRM-kleuringsprotocol verliep als volgt. Eerst wordt voldoende HEPES/Tris (HT)-buffer
gemaakt. HT-buffer is een oplossing van 7,74 g/l NaCl, 2,38 g/l 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-
ethaansulfonzuur (HEPES) (Sigma-Aldrich, H3375), 0,314 g/l KCl, 0,246 g/l MgCl2−6H2O, 1 g/l
D-(+)-Glucose (Sigma-Aldrich, G5400) en 1 mM CaCl2 in gebidestilleerd water (bidest), op pH
7,4 gesteld met 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propaandiol (tris, Sigma-Aldrich, T6066). HT-
buffer−Ca2+
is dezelfde oplossing zonder glucose en zonder CaCl2. Deze buffers werden bewaard
bij 4 ◦C. De glucosecomponent wordt pas vlak voor gebruik aan de HT-buffer met calcium toege-
voegd om de bewaringstermijn te verbeteren. Uit een stockoplossing van 1 mM tetramethylrhoda-
minemethylester (TMRM) (Invitrogen, T-668) in DMSO wordt een 20 µM TMRM-werkoplossing
in HT-buffer−Ca2+
bereid. Hieruit wordt een 100 nM-TMRM-gebruiksoplossing gemaakt door
de werkoplossing te verdunnen in medium van de cellen. Cellen worden geladen met deze ge-
bruiksoplossing en 25 minuten in het donker bij 37 ◦C geïncubeerd. Daaropvolgend worden de
cellen twee maal gewassen met HT-buffer. Onmiddellijk daarna worden opnames gemaakt van de
cellen in HT-buffer. De experimenten werden uitgevoerd in 35 mm-glass bottom dishes (MaTek).
2.4.2 CM-H2DCFDA-kleuring
Er wordt een 2’,7’-dichlorodihydrofluoresceïnediacetaat (CM-H2DCFDA)-stockoplossing van 1 mM
CM-H2DCFDA-poeder (Invitrogen, C6827) in DMSO gemaakt. Deze stockoplossing wordt be-
dekt met N2-gas en in amberkleurige epjes opgeslagen bij −20 ◦C. Deze CM-H2DCFDA-oplossing
wordt verdund tot een 2 µM-oplossing in HT-buffer. De cellen worden twee maal gewassen in HT-
buffer en 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd in de 2 µM-CM-H2DCFDA-oplossing.
Vervolgens worden de cellen opnieuw tweemaal gewassen met HT-buffer, waarna onmiddellijk
opnames van de cellen in HT-buffer worden gemaakt. CM-H2DCFDA is chemische component
26
36. die doorheen het celmembraan zal diffunderen. In de cel worden de acetaatgroepen afgesplitst
door cellulaire esterasen waardoor niet-fluorescent CM-H2DCF ontstaat dat de cel niet meer kan
verlaten137,225. Na oxidatie door intracellulaire oxidanten ontstaat fluorescent CM-DCF. Hoe
intenser het CM-DCF-signaal, hoe hoger het gehalte aan oxidanten in de cel. Als positieve con-
trole wordt na de opnames t-butylhydroperoxide toegevoegd. t-butylhydroperoxide is immers
een krachtige ROS-generator130. Concreet gebeurde de toediening als volgt: uit een stockoplos-
sing van 0,7 M t-butylhydroperoxide (Siqma-Aldrich, 458139) wordt een 10 mM werkoplossing in
bidest gemaakt. Uit deze werkoplossing wordt op zijn beurt 100 µl 100 µM t-butylhydroperoxide
in HT-buffer bereid. Deze gebruiksoplossing wordt na het nemen van de foto’s toegevoegd aan de
oplossing die reeds op de cellen ligt teneinde een concentratie van 50 µM t-butylhydroperoxide te
bekomen. Na 3 minuten incubatie wordt een nieuwe foto genomen en wordt de intensiteitswaarde
na beeldverwerkingsanalyse tussen beide foto’s vergeleken. Indien de signaalintensiteit na toe-
diening van de t-butylhydroperoxidegebruiksoplossing (sterk) toeneemt, is dit een indicatie dat
de genomen beelden nog binnen het intensiteitsbereik van de CM-DCF-kleurstof vielen. Beelden
waarbij dit niet het geval is, moeten als verdacht worden beschouwd en werden als dusdanig
ook niet meegenomen in de beeldanalyses. De experimenten werden uitgevoerd in 96 wellpla-
ten (Thermo Scientific, 165305) waarin de volgorde van de behandelingen gerandomiseerd was.
Bovenstaande cyclus werd rij per rij uitgevoerd.
2.5 Microscopie
De opnames van alle gefixeerde cellen behalve die voor pRb, PCNA en S100A6 werden gemaakt
met een Nikon Eclipse Ti-microscoop (Nikon Instruments, Amsterdam, Nederland) voorzien van
een 40x-olielens (40x, plan fluor, NA 1.30, WD 0.2, Nikon) en een iXon+ 885-camera (Andor).
De opnames voor de TMRM-gekleurde cellen die chemische behandelingen ondergingen werden
gemaakt met een Nikon Eclipse TE2000-E widefield microscoop (Nikon Instruments, Amsterdam,
Nederland) voorzien van dezelfde camera en een 60x-oliens (60x, plan apo VC, DIC N2, NA 1.40,
WD 0.13, Nikon). Alle andere opnames werden gemaakt met de Nikon TE2000-E-microscoop
voorzien van de 40x-olielens en dezelfde iXon+ 885-camera. Er werd gebruik gemaakt van de
volgende filterkubussen. DAPI werd geëxciteerd bij 340 – 380 nm, de dichroïsche spiegel had
een cut-offwaarde van 400 nm en de emissie werd gemeten bij 435 – 485 nm. Voor Dylight 488
en CM-DCF werd een excitatiegolflengte van 460 – 500 nm gebruikt met een cut-offwaarde van
505 nm voor de dichroïsche spiegel. Opname van de emissie gebeurde bij 510 – 560 nm. Bij
Dylight 549 en TMRM bedroegen de waarden voor de excitatie en de emissie respectievelijk 528
– 553 nm en 590 – 650 nm met een cut-offwaarde van 505 nm voor de dichroïsche spiegel. Dylight
649 werd geëxciteerd bij 625 – 650 nm en gemeten bij 670 nm waarbij een dichroïsche spiegel met
een cut-offwaarde van 625 nm werd gebruikt.
De uitgevoerde live cell imaging-experimenten vereisen een grote mate van consistentie m.b.t.
het behandelingsprotocol, maar ook m.b.t. de belichting. Het wassen en laden van de cellen
gebeurt immers aan de werkbank bij kamertemperatuur aan atmosferische CO2-concentraties.
Deze condities kunnen reeds leiden tot cellulaire stress wat een verhoogde ROS-productie tot
27
37. gevolg kan hebben. Verder is het zeer goed gedocumenteerd dat ook de belichting zelf ROS kan
induceren144,145. Daarom moet de lichtintensiteit zo laag mogelijk zijn en de belichtingstijd zo
kort mogelijk worden gehouden.
2.5.1 Beeldverwerking en -analyse
Alle opnames werden gemaakt via de software horende bij de microscoop, terwijl beeldverwer-
king en -annotatie werd gedaan met ImageJ freeware v1.47 en Adobe Photoshop CS5 (Adobe
Systems Inc., CA, USA). In overlays wordt een pseudokleur toegekend om visuele vergelijking
te vereenvoudigen. Beeldanalyse werd gedaan a.h.v. ImageJ freeware v1.47, waarvan de uit-
komst werd verwerkt in Microsoft Excel 2013 en Matlab 8.0. CM-DCF-fluorescentie werd via
drie verschillende methodes gekwantificeerd. Een eerste, naïeve methode bestond erin telkens
de gemiddelde CM-DCF-intensiteit te meten over de volledige foto. Methode 2 en 3 genereren
beiden een masker dat de cellen zo goed mogelijk omvat en meten zo enkel de intensiteit op de
plaatsen waar zich effectief cellen bevinden. De scripts van beide methoden zijn te vinden in de
addenda. Voor de TMRM-kleuringen werd gebruikt gemaakt van een masker dat het mitochon-
driale netwerk zo goed mogelijk tracht te omvatten. Van elk mitochondriaal segment dat op deze
wijze omvat werd, werden 14 verschillende parameters bepaald voor zowel de individuele mito-
chondriale fragmenten als het volledige mitochondriale netwerk per foto. Deze parameters zijn:
oppervlak, gemiddelde intensiteit, standaardafwijking van de intensiteit, perimeter, circulariteit,
Feret-diameter, geïntegreede densiteit, ruwe geïntegreede densiteit, Feret-x, Feret-y, minimale
diameter, aspectratio en rondheid. Het bijhorende ImageJ-script is terug te vinden in de ad-
denda. De berekeningswijze van elke parameter is te vinden in de ImageJ-gebruikshandleiding
(http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Voor de analyse van de mitochondri-
ale morfologie maakten we gebruik van de morfologische parameters die betrekking hadden op
de individuele mitochondriale fragmenten. Voor de analyse van de mitochondriale potentiaal
analyseerden we de intensiteit over het volledige mitochondriale netwerk per foto.
2.6 Statistiek
Voor methode 2 en 3 van de CM-H2DCFDA-kleuring werd de volgende statistische procedure
toegepast. Om te corrigeren voor eventuele tijdseffecten, werd de data gerangschikt volgens het
moment waarop de foto’s genomen werden. Vervolgens werden telkens de gemiddelde intensiteit
van de 4 foto’s per replica berekend, waarna deze gemiddelde intensiteit werd afgetrokken van
de gemiddelde intensiteit van de 4 foto’s van de overeenkomstige DMSO-controle. Normaliteit
van dit verschil voor elke conditie werd nagegaan a.h.v. D’Agostino’s K2-test. De data worden
vervolgens geanalyseerd a.h.v. one sample t-testen indien de verschillen normaal verdeeld zijn
en Wilcoxon signed rank-testen indien de verschillen niet normaal verdeeld zijn. Correctie voor
multipliciteit gebeurde a.h.v. de Holm-Bonferronimethode124.
Voor getelde data waarvan het totaal aantal telpunten kleiner was dan 300, werd gebruik ge-
maakt van de Freeman-Halton-uitbreiding voor 2x3-kruistabellen van Fisher’s exact test. Voor
28
38. data waarvan het totaal aantal telpunten groter was dan 300 en waarvan het effect van be-
handelingen moest worden getoetst t.o.v. de controles, werd een χ2-aanpassingstoets gebruikt.
Als “expected”-waarden werden de gepoolde data van de NT- en DMSO-controle gebruikt. Elke
behandeling werd apart getoetst t.o.v. de “expected”-waarden. Correctie voor multipliciteit
gebeurde a.h.v. de Holm-Bonferronimethode.
29
39. 3. Resultaten
3.1 Optimalisatie
3.1.1 Evidentie voor knockdown op mRNA-niveau
Eerst werd een knockdownprotocol geoptimaliseerd voor LMNA en ZMPSTE24. Hierbij werden
voor LMNA Tuschl (Biolegio) en siGENOME Lamin A/C Control siRNA (Thermo Scientific)
gebruikt. Voor ZMPSTE24 gebruikten we een knockdown die geoptimaliseerd was door Gruber
et al.105 (Biolegio) en ZMPSTE24 siRNA (Thermo Scientific). Als controles werden stealth
(Biolegio) en NT (Non-Targeting siRNA Control Pool #1, Thermo Scientific) gebruikt. Via
een reeks experimenten werd uiteindelijk het protocol zoals beschreven in sectie 2.1.1 (materiaal
en methoden) bekomen, waarbij de ZMPSTE24-kd en de LMNA-kd het meest efficiënt waren
voor de siRNA’s van Thermo Scientific. Deze siRNA’s zijn degene die verder doorheen deze
thesis gebruikt worden. De knockdown werd gevalideerd via qPCR. Hiertoe werden NHDF p 10
opgekweekt in T25-cultuurflessen en getransfecteerd met ZMPSTE24-kd en LMNA-kd. 48 uur
later RNA werd geëxtraheerd, waarna cDNA-synthese en qPCR volgden. De LMNA-kd is een
positieve controle die reeds geoptimaliseerd was, maar ook in het vernieuwde protocol werkzaam
is. De fold change (FC) voor de ZMPSTE24-kd bedroeg 0,1289 en die voor de LMNA-kd 0,0592.
Dit wil zeggen dat voor de ZMPSTE24-kd en de LMNA-kd gemiddeld nog slechts 12,89 % resp.
5,92 % van de mRNA-hoeveelheid in de controle aanwezig is in de kd. De knockdown is dus
werkzaam op mRNA-niveau. Deze resultaten zijn visueel weergegeven in figuur 3.1.
30
40. Figuur 3.1: Visuele weergave van de fold change t.o.v. de stealth-controle berekend volgens de ∆∆CT-
methode van Livak & Schmittgen152
met als basisreferenties de pseudo-huishoudgenen
AP2A1 en VPS52. Foutenvlaggen geven de standaardafwijking over drie biologische re-
plica’s aan. De fold change voor de LMNA-expressie in de LMNA-kd bedraagt 0,0592.
De fold change voor de ZMPSTE24-expressie in de ZMPSTE24-kd bedraagt 0,1289. De
fold change voor de ZMPSTE24-expressie in de LMNA-kd en de LMNA-expressie in de
ZMPSTE24-kd bedragen respectievelijk 1,222 en 0,8123. Deze waarden liggen binnen de
normale variatie. Er is dus geen effect van de LMNA-kd op de ZMPSTE24-expressie of
omgekeerd.
3.1.2 Validatie van de knockdown op proteïneniveau
ZMPSTE24-knockdown
Nadat geverifieerd was dat de ZMPSTE24-knockdown betrouwbaar was op mRNA-niveau, moest
worden nagegaan of deze knockdown ook werkelijk leidde tot het gewenste effect op eiwitniveau,
met name accumulatie van prelamine A. Hiertoe werd een immunofluorescentiekleuring uitge-
voerd tegen prelamine A. Dit gebeurde in NDHF p 15 die werden uitgezet in 12 wellplaten en 48
uur na behandeling werden gefixeerd. Als negatieve controle werd een NT-siRNA-oligonucleotide
gebruikt. Representatieve beelden van dit experiment zijn weergegeven in figuur 3.2. In elke fi-
guur van deze thesis zijn de beelden in elk experiment opgenomen met identieke settings en werd
het dynamisch bereik van weergave voor alle beelden van hetzelfde kanaal gelijk gemaakt.
31
41. Figuur 3.2: Immunofluorescente detectie van prelamine A (B, E) in NHDF p 15 getransfecteerd met NT
(controle) en ZMPSTE24-kd. Kernen werden gekleurd met DAPI (A, D). De laatste kolom
is een overlay van DAPI (pseudokleur blauw) en prelamine A (pseudokleur geel). Prelamine
A is quasi afwezig in de controle (B), terwijl het duidelijk zichtbaar is in de ZMPSTE24-kd
(E). Prelamine A accumuleert niet alleen in de lamina, maar ook in nucleoplasmatische foci
van de ZMPSTE24-kd (inset in F).
We evalueerden op dezelfde manier ook het effect van 48 uur behandeling met vier chemische
componenten, waarvan er twee (FTI en ZOL) de farnesylatie van prelamine A verhinderen en
twee andere (SAQ en AFCME) de afsplitsing van het gefarnesyleerde C-terminale fragment door
ZMPSTE24 verhinderen. FTI en ZOL zullen dus accumulatie van ongefarnesyleerd prelamine
A induceren, terwijl SAQ en AFCME accumulatie van gefarnesyleerd prelamine A induceren.
DMSO, het oplosmiddel van deze chemicaliën werd als negatieve controle gebruikt. Figuur 3.3
toont representatieve beelden voor deze immunofluorescentiekleuring.
32
42. Figuur 3.3: Immunofluorescente detectie van prelamine A (B, E, H, K, N) in NHDF p 15 behandeld
met 10 µM FTI, 10 µM AFCME, 1 µM ZOL en 20 µM SAQ. Het oplosmiddel DMSO geldt
als negatieve controle. Kernen werden gekleurd met DAPI (A, D, G, J, M). De laatste
kolom is een overlay van DAPI (pseudokleur blauw) en prelamine A (pseudokleur geel).
Prelamine A accumuleert zeer sterk in de SAQ-behandeling, relatief zwak in de AFCME-
en ZOL-behandeling en zeer zwak in de FTI-behandeling. Op de insets in I, L en O is te
zien dat prelamine A ook accumuleert in de nuceloplasmatische foci. Dit werd zeer af en toe
ook in de FTI-behandeling geobserveerd. De DMSO-controle bezit bijna geen prelamine A
(B).
33
43. Uit figuur 3.2 blijkt duidelijk dat de ZMPSTE24-kd accumulatie van prelamine A induceert.
Deze accumulatie ligt nog een stuk hoger in fibroblasten die behandeld werden met 20 µM SAQ
(figuur 3.3). Net als matuur lamine A, wordt ook dit aberrante prelamine A geïncorporeerd in
de nucleoplasmatische foci. Fibroblasten behandeld met AFCME en ZOL vertonen een lichte
aanrijking aan prelamine A vergeleken met de DMSO-controle, maar veel minder sterk dan
de ZMPSTE24-kd en de SAQ-behandeling. Het signaal in FTI-behandelde NHDF is slechts
marginaal sterker en vertoont enkel sporadisch een cel met een duidelijk hogere intensiteit voor
prelamine A vergeleken met de DMSO-controle. Er werd ook een prelamine A-kleuring uitgevoerd
voor HDF−/− p 30 en LMNA-kd, maar deze zijn niet weergegeven in een figuur. Prelamine A
is volledig afwezig in de lamina en kern van HDF−/− en de LMNA-kd, terwijl er in de controle
toch een zeer zwak nucleair signaal aanwezig is. Dit is vermoedelijk te wijten aan het feit dat ook
gezonde cellen prelamine A aanmaken154, daar waar in de LMNA-kd de aanmaak van prelamine
A bijna volledig gesilenced is.
LMNA-knockdown
Na validatie voor knockdown van LMNA op mRNA-niveau, moest worden nagegaan of de knock-
down ook resulteerde in het gewenste effect op eiwitniveau. Hiervoor werd opnieuw gebruik ge-
maakt van een immunofluorescentiekleuring op NHDF p 15 die 48 uur na behandeling gefixeerd
werden, alsook onbehandelde gefixeerde HDF−/− p 30, als negatieve controle. Lamine B-kleuring
werd meegenomen als positieve controle. Opnames van representatieve cellen voor de relevante
condities worden weergegeven in figuur 3.4.
34
45. Figuur 3.4: Boven: immunofluorescente detectie van lamine A (B, F, J) en lamine B (C, G, K) in NHDF
p 15 getransfecteerd met NT, respectievelijk LMNA-kd alsook in HDF−
/−
p 30. Nuclei
werden gelabeld met DAPI (A, E, I). De laatste kolom is een overlay van het lamine A-
signaal (pseudokleur rood) en het lamine B-signaal (pseudokleur cyaan). HDF−
/−
vertoont
zoals verwacht geen expressie van lamine A/C (J), terwijl het effect van de LMNA-kd
variabel is. Sommige cellen vertonen in het geheel geen afname van lamine A/C, andere
hebben wel een verminderde lamine A/C-aanwezigheid (pijlpunt in F). Opmerkelijk is de
verhoogde expressie van type B-lamines in HDF−
/−
(K), maar vooral in de LMNA-kd (G).
Op de inset in H is te zien dat onderbrekingen in type B-lamines soms opgevuld zijn met
lamine A/C. Pijlpunten in L wijzen naar verlies aan lamine B aan de polen van de celkern in
HDF−
/−
. Onder: LMNA-kd-cellen vertonen dikwijls honingraatvormige structuren. Deze
beelden werden gemaakt in NHDF p 11. B – E en G – J tonen lamine B-kleuring voor twee
cellen waarin het fenomeen werd waargenomen. De beelden zijn opnames op verschillende
hoogten met een verticaal interval van 1 µm. A en F zijn de DAPI-kleuringen.
De knockdown van LMNA lijkt op het eerste zicht niet zeer efficiënt op eiwitniveau. Sommige
cellen vertonen een signaal dat ongeveer even sterk is als dat van de controle, maar andere
vertonen toch een sterke reductie in aanwezigheid van lamine A/C (zie pijlpunt in subfiguur F).
Er bestaat dus een vrij grote variabiliteit tussen de cellen in transfectie-eficiëntie. Opvallend is
dat LMNA-kd cellen af en toe honingraatvormige structuren vertonen in het lamine B-netwerk.
Een andere opmerkelijke vaststelling is dat deze openingen in het lamine B-netwerk dikwijls
opgevuld worden met lamine A/C. Dit effect werd ook geobserveerd door Shimi et al.227. Bij de
chemische behandelingen, waarvoor ook een lamine A/C-kleuring gebeurde die hier niet getoond
is, zijn de conclusies minder duidelijk vanwege de vrij grote variabiliteit in intensiteit tussen de
verschillende replica’s. Voor AFCME en ZOL werd geen duidelijk verschil waargenomen. FTI
en SAQ leken over het algemeen een zeer beperkte toename van de lamine A/C-intensiteit te
induceren. Het is echter niet duidelijk of deze effecten werkelijk aanwezig zijn, en als dat zo is,
dan zijn ze in elk geval zeer zwak.
3.1.3 Conclusies
• Het nieuwe kd-protocol kan op betrouwbare wijze LMNA-kd en ZMPSTE24-kd induceren
op mRNA-niveau.
• ZMPSTE24-kd induceert accumulatie van prelamine A. Fibroblasten behandeld met 20 µM
SAQ zullen echter nog meer prelamine A accumuleren.
• AFCME en ZOL veroorzaakten een beperkte toename van prelamine A. In FTI-behandelde
cellen leek het signaal slechts marginaal toegenomen en vertoonden maar enkele cellen een
duidelijke toename t.o.v. de DMSO-controle.
• LMNA-kd induceert een algemene verlaging van het lamine A/C-gehalte, maar deze verla-
ging is in sommige cellen veel sterker uitgesproken dan in andere.
36
46. • Chemische behandelingen (AFCME, ZOL, FTI, SAQ) die ingrijpen op de maturatie van
prelamine A wijzigen het lamine A/C-gehalte niet of nauwelijks.
• HDF−/−-fibroblasten vertonen een sterke elongatie en hebben dikwijls grote openingen in
het lamine B-netwerk aan de polen.
• De LMNA-kd vertoont af en toe beperkte lokale depletie van lamine B. In de meest extreme
gevallen zijn deze kleine openingen zo talrijk dat het lamine B-netwerk een honingraatstruc-
tuur vertoont.
3.2 Invloed van laminaperturbaties op andere eiwitten van de
nucleaire enveloppe
3.2.1 Genetische laminaperturbaties verhogen de aanwezigheid van type B-
lamines
Een verrassend resultaat is dat LMNA-kd en in mindere mate HDF−/− sterk verhoogde hoe-
veelheden type B-lamines tot expressie lijken te accumuleren (zie figuur 3.4). We vroegen ons
daarom af of ook andere vormen van laminaperturbatie kunnen interfereren met de lamine B-
turnover. Hiertoe voerden we immunofluorescentiekleuringen uit met het eerder gebruikte lamine
B (C-20)-antilichaam (Santa Cruz) dat zowel lamine B1 als lamine B2 detecteert met een lichte
voorkeur voor lamine B1 alsook met een antilichaam dat specifieker lamine B1 detecteert (Lamin
B1, Abcam). De resultaten voor het lamine B1-antilichaam zijn weergegeven in figuur 3.5 en 3.6.
37
