Разработка и аттестация отраслевого стандартного образца специфической активности эритропоэтина
•Download as PPTX, PDF•
0 likes•182 views
Разработка и аттестация отраслевого стандартного образца специфической активности эритропоэтина
Recommended
Recommended
More Related Content
What's hot
What's hot (20)
Similar to Разработка и аттестация отраслевого стандартного образца специфической активности эритропоэтина
Similar to Разработка и аттестация отраслевого стандартного образца специфической активности эритропоэтина (20)
Разработка и аттестация отраслевого стандартного образца специфической активности эритропоэтина
- 1. Разработка и аттестация отраслевого стандартного образца специфической активности эритропоэтина 13.04.2017 Яковлев А.К., ведущий микробиолог Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской федерации
- 2. Строение эритропоэтина Молекула эритропоэтина состоит из 165 аминокислотных остатков Молекулярная масса – 18,4 кДа Имеет: - 2 дисульфидные связи - 4 сайта гликозилирования Гликозилирование приводит к образованию нескольких биологически активных форм с молекулярной массой около 28-37 кДа Источник - http://commons.wikimedia.org/wiki/Category:Erythropoietin 2
- 3. Дозозависимое увеличение артериального давления и тромбоцитоз способствуют : •развитию ишемии миокарда •инфаркту миокарда •инсульту •тромбозу глубоких вен •артериальному тромбозу Нежелательные последствия от применения препаратов эритропоэтинов при превышении дозы 3
- 4. Фармакокинетика эритропоэтинов МНН ММ, кДа Период полувыведения при подкожном введение, ч Эпоэтин альфа 28 -34 24 Эпоэтин бета 34-37 13-28 Эпоэтин тета 30,6 34 Дарбэпоэтин альфа 37,1 73 Эпоэтин бета [метоксиполи- этиленгликоль] ≈ 60 139-142 4
- 5. In vitro (эритропоэтин зависимые культуры клеток) In vivo по влиянию на стимуляцию гемопоэза у полицитемических и нормоцитемических мышей ELISA Американская фармакопея Британская фармакопея Европейская фармакопея 5 Китайская фармакопея
- 6. ЦЕЛЬ Разработка и аттестация отраслевого стандартного образца специфической активности эритропоэтина ЗАДАЧИ: 1. Разработать отраслевой стандартный образец специфической активности эритропоэтина; 2. Аттестовать полученный ОСО по специфической активности; 3. Обосновать сроки годности ОСО специфической активности эритропоэтина. 6 Работа проведена в соответствии с Государственным заданием Министерства Здравоохранения РФ (приказ МЗ РФ № 056-00109-16 от 15.01.2016 г.) в рамках темы НИР «Совершенствование системы разработки и применения стандартных образцов, предназначенных для оценки качества, эффективности и безопасности лекарственных средств».
- 7. Материалы и методы: • Рэпоэтин-СП/ ФГУП "Гос.НИИ ОЧБ" ФМБА России – Россия • Эритропоэтин человека рекомбинантный/Микроген НПО ФГУП - Россия • Эритропоэтин человека рекомбинантный/ООО "ФАРМАПАРК" – Россия • 3ий международный стандарт эритропоэтина (3rd IS EPO Кат. №11/170) • Стандартный образец эриропоэтина Европейской фармакопеи (Erythropoietin BRP batch#3, Кат. № Е1515000) • Метод in vivo на нормоцитемических мышах • Метод «ускоренного старения» 7
- 8. Кандидаты в ОСО Наименование/Производитель Дата регистрац ии Срок действия Срок годности, лет Торговое МНН Эритропоэтин человека рекомбинантный/ Микроген НПО ФГУП - Россия Эпоэтин бета 1998 1998-2006 2 Эритропоэтин человека рекомбинантный/ ООО "ФАРМАПАРК" - Россия 1998 - 2 Рэпоэтин-СП/ ГосНИИ ОЧБ ФМБА ФГУП России - Россия Эпоэтин альфа 1999 1999-2009 3 8
- 9. Лиофилизация кандидата Субстанцию Рэпоэтин-СП разбавили буферным раствором до концентрации 54000 МЕ/мл, разлили по ампулам и лиофилизировали Каждая ампула содержит сухой остаток после лиофильного высушивания 50 мкл раствора: •Рекомбинантный эпоэтин альфа человека – 20 мкг; •Стабилизаторы. 9
- 10. Подразделение Центр Организация Лаборатория вирусных вакцин Испытательный центр экспертизы качества медицинских иммунобиологических препаратов Научный центр экспертизы средств медицинского применения Лаборатория иммунологии Лаборатория фармакологии Испытательный центр экспертизы качества лексредств 10 Участники аттестации ОСО
- 11. № лаборатории № испытания ОСО относительно WHO 3nd IS ОСО относительно BRP # 3 Среднее Значение МЕ/амп 95 % доверительный интервал, % Среднее значение МЕ/амп 95 % доверительный интервал, % 1 1 2300 79 – 127 1972 73 – 137 2 2236 76 – 132 2108 77 – 130 3 2526 79 – 126 2627 79 – 126 2 1 2365 81 – 124 3021 72 – 138 2 2143 75 – 133 1982 65 – 154 3 2541 76 – 132 1945 66 – 151 3 1 2502 80 – 125 2250 67 – 150 2 2288 81 – 124 2734 79 – 127 3 2205 80 – 125 3077 78 – 128 Объединенный результат n=9 2345 93 – 108 2489 91 – 110 n=18 2401 (94,5 – 105,8 %) 11 Результаты межлабораторных исследований
- 12. Сравнение отечественного ОСО со стандартом Европейской фармакопеи Показатель ОСО относительно WHO 3nd IS и BRP # 3 BRP # 4 относительно WHO 3nd IS 95 % доверительный интервал рассчитанной активности 94,5-105,8 % 94,3-106,0 % Стоимость 1000-5000 руб (ориентировочная) 50284,49 руб. (Sigma Aldrich) 12
- 13. Температура хранения, ° С Период хранения (мес.) Активность, % Доверительный интервал, % 37±0,2 8 108 84 - 139 28±0,2 8 97 76 - 123 4±1,0 9 107 81 - 141 минус 20±1,0 9 109 87-138 13 Оценка стабильности ОСО
- 14. ВЫВОДЫ 1. ОСО специфической активности эритропоэтина, полученный на основе субстанции РЭПОЭТИН-СП аттестован по результатам исследований в трех лабораториях: специфическая активность составила 2401 МЕ в ампуле, доверительный интервал (94,5-105,8 %), что сопоставимо с доверительными интервалами международного стандартного образца и стандартного образца европейской фармакопеи (94,8-105,5 % и 94,3-106,0 %) соответственно; 2. Аттестованный ОСО специфической активности эритропоэтина при соблюдении условий хранения (температура минус 20 ºС) стабилен в течение 5 лет и соответствует требованиям ВОЗ, предъявляемым к СО; 3. Аттестованный ОСО специфической активности эритропоэтина позволяет получать сопоставимые результаты при испытаниях в различных лабораториях, корректно определять дозу действующего вещества в лекарственных препаратах эритропоэтинов и, соответственно, адекватно их дозировать при клиническом применении. 14
Editor's Notes
- Эритропоэтин это цитокин, который регулирует эритропоэз, стимулируя созревание эритроцитов. По своей природе это кислый гликопротеин, молекулярная масса которого зависит от степени гликозилирования. Протеиновая часть молекулы состоит из 165 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 18,4 кДа, между цистеинами в положении 7–161 и 29–33 имеются две дисульфидные связи, которые необходимы для проявления биологической активности. В положениях 24, 38 и 83 находятся три участка N-гликозилирования по аспарагиновым аминокислотным остаткам, в положении 126 – О-гликозирование по серину. Белковая часть молекулы эритропоэтина - стабильная структура, а углеводная - может меняться и достигать 39 % молекулярной массы, при этом около 17 % всех углеводных компонентов приходится на сиаловую кислоту. Посттрансляционное гликозилирование приводит к образованию нескольких биологически активных форм с различной молекулярной массой и биологической активностью. Ген эритропоэтина был клонирован в 1983 году, а через два года начались клинические исследования первого лекарственного препарата. Лекарственные препараты рекомбинантного эритропоэтина применяют для профилактики и лечения анемий различного генеза, в том числе при хронической почечной недостаточности, при онкологических заболеваниях после химиотерапии препаратами, угнетающими эритропоэз, а также для увеличения объема донорской крови для последующей аутотрансфузии. За последние два десятилетия препараты эритропоэтинов были использованы более чем у миллиона пациентов. Данные средства входят в «Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов для медицинского применения».
- Основным показателем качества, который влияет на эффективность и безопасность лекарственных препаратов эритропоэтинов является специфическая активность, поскольку ошибка в сторону завышения ее значения отразится на эффективности препарата, а в сторону занижения может привести к нежелательным последствиям. Опыт клинического применения показал, что передозировка препаратов эритропоэтина опасна гипертонией и тромбоцитозом с ишемией и инфарктом миокарда, инсультом, тромбозами вен и артерий.
- На проявление специфической активности эритропоэтина, его фармакокинетику и иммуногенные свойства влияет гликозилирование. Сиаловые кислоты, входящие в состав углеводной части эритропоэтина, маскируют сахара, являющиеся антигенными детерминантами, при отщеплении сиаловых кислот концевым сахаром становится галактоза и такой эритропоэтин поглощается клетками печени, что ухудшает фармакокинетику препарата и его эффективность. Период полувыведения препаратов эритропоэтинов с разной степенью гликозилирования различается и составляет при подкожном применении от 13 до 142 ч. Чем больше молекулярная масса эритропоэтина, тем дольше его циркуляция в организме. Качественный и количественный состав олигосахаридных цепей зависит от клеток-продуцентов, условий их культивирования и может меняться в процессе производства. По этой причине лекарственные препараты, выпускаемые разными производителями, отличаются по степени гликозилирования и кроме того сам препарат представляет собой смесь изоформ разной активности.
- Специфическую активность лекарственных препаратов эритропоэтинов оценивают биологическим методом по стимуляции гемопоэза у полицитемических и нормоцитемических мышей в ответ на введение им испытуемого препарата в сравнении со стандартным образцом и выражают в относительных единицах – международных единицах. Поэтому для контроля качества препаратов рекомбинантных эритропоэтинов необходим стандартный образец. В РФ нет национального стандартного образца эритропоэтина, что ставит отечественных производителей в зависимость от держателей данных стандартов и курса валюты. Это приобретает особое значение в условиях санкций, поэтому разработка национального ОСО имеет ключевое значение для развития отечественного фармрынка и импортозамещения. Таким образом актуальность работы обусловлена значимостью лекарственных препаратов эритропоэтинов в медицинской практике, необходимостью использования стандартного образца для контроля их качества и отсутствием национального стандартного образца в РФ.
- Целью работы была разработка и аттестация отраслевого стандартного образца специфической активности эритропоэтина Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие ЗАДАЧИ: 1. Разработать отраслевой стандартный образец специфической активности эритропоэтина; 2. Аттестовать полученный отраслевой стандартный образец; и 3. Обосновать сроки его годности. Работа была проведена в соответствии с Государственным заданием Министерства Здравоохранения РФ в рамках темы НИР «Совершенствование системы разработки и применения стандартных образцов, предназначенных для оценки качества, эффективности и безопасности лекарственных средств».
- Материалы и методы: Специфическую активность оценивали в соответствии с Европейской фармакопеей, по стимуляции гемопоэза у нормоцитемических мышей в ответ на введение им отраслевого стандартного образца в сравнении с международным стандартом и стандартным образцом Европейской фармакопеи. Ретикулоциты окрашивали 5 микромолярным раствором акридинового оранжевого, подсчет проводили на проточном цитофлуориметре Navios фирмы Бекман Культер. Стабильность кандидата изучали методом ускоренного старения и в реальном времени.
- Результаты: Кандидат в стандартный образец выбирали из зарегистрированных в РФ субстанций отечественного производства. По данным государственного реестра лекарственных средств на момент выбора было зарегистрировано 3 фармацевтических субстанции: две эпоэтин бета и одна эпоэтин альфа. В соответствии с требованиями ВОЗ к кандидатам в СО учитывали следующие критерии: Стандарт должен максимально соответствовать исследуемым образцам; Иметь высокую стабильность; Обладать достаточной активностью для целей, которым он предназначен. Основанием для выбора субстанции Рэпоэтин-СП в качестве кандидата в ОСО, явилось подобие по составу его полисахаридных цепей действующему международному стандарту эритропоэтина, кроме того срок его годности в 1,5 раза больше по сравнению с другими субстанциями.
- Для проведения лиофилизации субстанцию Рэпоэтин-СП разбавили буферным раствором стабилизированным альбумином и трегалозой до концентрации 54000 МЕ/мл, разлили по ампулам и лиофилизировали.
- Назначение разрабатываемого стандартного образца – определение специфической активности лекарственных препаратов рекомбинантных эритропоэтинов человека. В связи с этим аттестуемой характеристикой кандидата была специфическая активность. Межлабораторные исследования по аттестации проходили в трех лабораториях научного центра экспертизы средств медицинского применения, каждая лаборатория выполнила по три независимых испытания относительно международного стандартного образца и три – относительно европейского стандартного образца, всего проведено 18 испытаний.
- Полученные первичные данные статистически обрабатывали методом параллельных линий. Необходимые критерии параллельности и линейности соблюдены при уровне вероятности 0,05. Индивидуальные результаты каждой лаборатории объединили и рассчитали среднее взвешенное значение. В соответствии с требованиями европейской фармакопеи перед объединением результатов была проведена проверка на однородность объединяемых значений. Для этого использовали критерий хи-квадрат. Рассчитанное значение критерия было меньше табличного, что свидетельствовало об однородности объединяемых значений, а среднее взвешенное значение и рассчитанные доверительные интервалы статистически обоснованы. Таким образом, активность отраслевого стандартного образца относительно международного стандарта составила 2345 МЕ/амп, а относительно стандарта европейской фармакопеи 2489 МЕ/амп. По результатам всех испытаний активность отраслевого стандартного образца составила 2401 МЕ/амп.
- Доверительный интервал аттестованной величины отраслевого стандартного образца составил от 94,5 до 105,8 %, что сопоставимо с доверительным интервалом стандартного образца европейской фармакопеи. Ориентировочная стоимость отечественного отраслевого стандартного образца существенно ниже стоимости стандарта европейской фармакопеи.
- Стабильность стандартного образца, изучали при температурах хранения от +37 до минус 20 ° С в течение 8-9 мес . За этот период времени не выявлено достоверных отличий активности образцов хранившихся при положительных температурах от активности образца хранившегося при температуре минус 20 ° С. И активность составила 108, 97 и 107 % соответственно. Поэтому для установления стабильности были учтены данные, опубликованные Комитетом экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов о стабильности 2ого международного стандарта эритропоэтина. Стабильность этого стандарта в условиях реального времени при темп минус 20 С показана на протяжении 24 лет и он был заменен лишь по причине израсходования. Таким образом, полученные результаты и опыт по изучению стабильности международного стандартного образца в условиях хранения при температуре минус 20 С в течении 24 лет позволили установить срок годности для отраслевого стандартного образца 5 лет при температуре минус 20 С.
- Таким образом можно сделать следующие выводы: