D3 slides (Satoshi Kume)

リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素の
脂溶性低分子に対する系統的相互作用解析
生命環境科学研究科応用生命科学専攻
生体高分子機能学研究室
久米慧嗣
Systematic Interaction Analysis of Human
Lipocalin-type Prostaglandin D Synthase
with Small Lipophilic Ligands
2013.02.06

リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素 (L-PGDS)
異性化酵素
PGD2
PGH2
L-PGDS
O
COOH
OH
OH
O
O
OH
COOH
睡眠誘発作用
脳脊髄液中においてアルブミンに次いで２番目に多く存
在するタンパク質である(約12 µg/ml)。
正常圧水頭症、脊柱管狭窄症、クモ膜下出血のような
神経疾患の診断マーカーとして有用である。

生体内輸送タンパク質（リポカリンファミリー）
アミノ酸残基数140∼200程度の分泌型タンパク質で
あり、ビタミンA誘導体や脂肪酸のような脂溶性低
分子を結合・輸送する。
ヘム代謝産物、ビタミンA誘導体、甲状腺ホルモン
などの脂溶性低分子と結合する。
マウス由来L-PGDS
リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素 (L-PGDS)

研究の目的
脂溶性低分子に対するヒト由来L-PGDSの結合特性
特に結合比、親和性、熱力学的駆動力を明らかにする
蛍光消光効果を用いたL-PGDSの様々な脂溶性低分子
に対する相互作用解析
1.
誘起円偏光二色性分光法（ICD）、および等温滴定
型熱測定法（ITC）を用いたL-PGDSとビリベルジン
との相互作用解析
2.
ITCを用いたL-PGDSと様々な脂溶性低分子との
熱力学的相互作用解析
3.

内因性Trp残基の蛍光消光効果による
結合親和性測定
Trp43
Trp54
Trp112
ヒト由来L-PGDSの立体構造
(PDB ID: 3O2Y)
290 nmの励起光に対する
334 nmのTrp蛍光を測定
１個の結合部位を持つモデル
解離定数(Kd)を求めた
L-PGDS + Ligand L-PGDS/Ligand
Kd
⌦

相対蛍光強度
(%)
L-PGDSとヘム代謝産物との相互作用解析
ビリベルジン
(分子量: 583)
L-PGDS濃度: 1.5 µM, 緩衝液: 5 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 5% DMSO
励起波長: 290 nm, 蛍光波長: 334 nm, 温度: 25 °C, 測定機器: F-7000蛍光分光計 (日立)
[ビリベルジン]/[L-PGDS]

Kd = 20 nM
相対蛍光強度
(%)
L-PGDSとヘム代謝産物との相互作用解析
ビリベルジン
(分子量: 583)
L-PGDS濃度: 1.5 µM, 緩衝液: 5 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 5% DMSO
励起波長: 290 nm, 蛍光波長: 334 nm, 温度: 25 °C, 測定機器: F-7000蛍光分光計 (日立)

脂溶性低分子に対するL-PGDSの結合親和性
リガンド
(分子量)
化学構造式 Kd
リガンド
(分子量)
化学構造式 Kd
ヘム代謝産物
ビタミンA誘導体
甲状腺ホルモン
L-サイロキシン
(777)
335 nM
ビリベルジン
(583)
20 nM
黄体ホルモン
プロゲステロン
(314) H
H
H
O
H
O
2.3 µM
レチノイン酸
(300)
OH
O
308 nM 植物ホルモン
11.3 µM
ゲニステイン
(270)

クモ膜下出血
脳脊髄液
ビリベルジンと結合
L-PGDS濃度上昇
(約12 → 26 µg/ml)
ビリベルジンに対するL-PGDSの高い結合親和性は、
生理的な機能と関係がある。
クモ膜下出血時におけるL-PGDSによる
ビリベルジン結合の生理的意義

吸光度
波長 (nm)
ビリベルジンの吸収スペクトル
ビリベルジン濃度: 20 µM, 緩衝液: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 5% DMSO, セル長: 10 mm
測定機器: DU® 800 spectrophotometer (Beckman coulter)
遊離型ビリベルジン
L-PGDS/ビリベルジン複合体
ICD

L-PGDS/ビリベルジン複合体のICDスペクトル
L-PGDS濃度: 5 µM, 緩衝液: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 5% DMSO, 温度: 25 °C, 測定機器: 円二色性分散計J-820 (JASCO)
数字: モル濃度比 ([ビリベルジン]/[L-PGDS])
0.2
0.4
0.8
1.0
波長 (nm)
I
ICD
(mdeg)

0.2
0.4
0.8
1.0
1.2
1.4
1.8
2.1
2.7
5.2
波長 (nm)
I
ICD
(mdeg)

I
ICD
(mdeg)

2個の独立な結合部位を持つモデル
L-PGDS + Ligand L-PGDS/Ligand L-PGDS + Ligand L-PGDS/Ligand
Kd2
Kd1
€
IICD
=
n1[Lf ]
[Lf ]+ Kd1
ICD1 +
n2[Lf ]
[Lf ]+ Kd2
ICD2
[Lf ] =
2
3
a2
− 3b cos
1
3
arccos
−2a3
+ 9ab − 27c
2 a2
− 3b
( )
3
#
$
%
%
%
&
'
(
(
(
−
a
3
a = Kd1 + Kd2 +[Pt ] n1 + n2
( )−[Lt ]
b =[Pt ] n1Kd1 + n2Kd2
( )− Kd1 + Kd2
( )[Lt ]+ Kd1Kd2
c = −Kd1Kd2[Lt ]
#
$
%
&
%
IICD: 観察されたICD強度
ICD1 & ICD2: 各結合によるICD強度
n1 & n2: 結合比
Kd1 & Kd2: 解離定数
[Pt]: 全タンパク質濃度
[Lt]: 全リガンド濃度
[Lf]: 遊離型リガンド濃度
解析式
２個の独立な結合部位モデル (各部位において1:n結合を仮定)
⌦
⌦

⌦
⌦ Kd2 = 710 nM
Kd1 = 2.8 nM
I
ICD
(mdeg)

・Gibbs エネルギー変化 (ΔG)
・エンタルピー変化 (ΔH)
・エントロピー変化 (ΔS)
ΔG = RT ln Kd
ΔG = ΔH – TΔS
熱力学方程式
L-PGDS
(500 µM)
ビリベルジン
(40 µM)
ΔT
Sample
Cell
Reference
Cell (H2O)
ITCを用いたL-PGDSとビリベルジンとの相互作用解析

µJ/sec
滴定毎エンタルピー
(kJ/mol)
時間 (分) [L-PGDS]/[ビリベルジン]
L-PGDS濃度: 500 µM, ビリベルジン濃度: 40 µM, 緩衝液: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 5% DMSO,温度: 25 °C,
測定機器: MicroCal VP-ITC
Kd2
Kd1
⌦
⌦

⌦
⌦
Kd2 = 1200 nM
Kd1 = 6.9 nM
[L-PGDS]/[ビリベルジン]
µJ/sec
時間 (分)
L-PGDS濃度: 500 µM, ビリベルジン濃度: 40 µM, 緩衝液: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 5% DMSO,温度: 25 °C,
測定機器: MicroCal VP-ITC
(kJ/mol)

時間 (分)
µJ/sec
(kJ/mol)
ΔH° ΔΔH°
高親和結合 –12.6
低親和結合 –23.9
11.3

L-PGDS
リガンド
高親和部位
低親和部位
過剰な遊離リガンド存在下
発熱反応
(kJ/mol)
ΔH° ΔΔH°
高親和結合
低親和結合
–12.6
–23.9
11.3
時間 (分)
µJ/sec

吸熱反応
高親和部位
低親和部位
(kJ/mol)
ΔH° ΔΔH°
高親和結合
低親和結合
L-PGDS
遊離リガンド非存在下
–12.6
–23.9
11.3
時間 (分)
µJ/sec
リガンド

ΔG° –TΔS°
ΔH°
(kJ/mol)
蛍光消光 ICD ITC
(nM)
相互作用の熱力学パラメータ
高親和結合 19 2.8 6.9
低親和結合 710.0 1200.0
高親和結合 –46.6 –12.6
低親和結合
–34.0
–9.9
–23.9
–33.8
各測定法により得られたビリベルジンのKd値の比較

ΔG° –TΔS°
ΔH°
(kJ/mol)
蛍光消光 ICD ITC
(nM)
高親和結合 19 2.8 6.9
低親和結合 710.0 1200.0
高親和結合 –46.6 –12.6
低親和結合
–34.0
–9.9
–23.9
–33.8
各測定法により得られたビリベルジンのKd値の比較
相互作用の熱力学パラメータ

L-PGDS/ビリベルジン複合体のモデル構造
ソフトウェア: 統合計算化学システム (MOE),
アルゴリズム: ASEDock
高親和結合
低親和結合

ヘム代謝産物結合の生理的意義
ヘムの代謝分解経路
ビリベルジン
ヘム
(ヘミン)
ビリルビン
ヘミン、およびビリルビンは、神経細胞に対してアポトーシス
を介する細胞死を誘発する。

ヘム代謝産物結合の生理的意義
ヘムの代謝分解経路
ビリベルジン
ヘム
(ヘミン)
ビリルビン
L-PGDSはヘム代謝産物のスカベンジャーである
ヘミン、およびビリルビンは、神経細胞に対してアポトーシス
を介する細胞死を誘発する。

L-PGDSによるヘム代謝産物の結合モデル
ビリベルジンの急激な濃度上昇に伴い、２分子のビリベルジン
を捕捉する。
L-PGDSの濃度上昇に伴い、エネルギー的により安定なビリベル
ジン１分子複合体の形成が起こり、分解・排出が促進される。

ビリベルジンの急激な濃度上昇に伴い、２分子のビリベルジン
を捕捉する。
L-PGDSによるヘム代謝産物の結合モデル
L-PGDSの濃度上昇に伴い、エネルギー的により安定なビリベル
ジン１分子複合体の形成が起こり、分解・排出が促進される。

まとめ
ヒト由来L-PGDSは，２分子のビリベルジンを高親和、お
よび低親和性で結合する。
ビリベルジンに対するL-PGDSの高い結合親和性には、
本タンパク質の疎水性キャビティからの水分子の脱水和
によるΔS利得が大きく寄与する。
L-PGDSの高親和、および低親和結合によるヘム代謝産物
の結合モデルを提案した。
Kume, S., et al. Biochem. J. 446, 279-289 (2012)

本研究において使用した脂溶性リガンド
ビタミンA誘導体甲状腺ホルモン PGH2アナログ
ステロイドホルモン植物ホルモン
蛍光プローブ
L-サイロキシン (T4)
(777 Da)
(314 Da)
All-rans レチノイン酸
(300 Da)
ゲニステイン
(270 Da)
9-cis レチノイン酸
(300 Da)
L-サイロニン (T3)
(651 Da)
U-46619
(350 Da)
テストステロン
(288 Da)
ナリンゲニン
(272 Da)
ダイゼイン
(254 Da)
TNS
(335 Da)
コルチコステロン
(346 Da)

ITCを用いたL-PGDSとL-サイロキシン(T4)
との相互作用解析
µJ/sec
(kJ/mol)
時間 (分) [L-PGDS]/[T4]
T4 (777 Da)
Kd (µM)
n
ΔH°
ΔG° –TΔS°
(kJ/mol)
1.0 2.1 –63.8
–32.4 31.4
L-PGDS濃度: 500 µM, T4濃度: 30 µM, 緩衝液: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 5% DMSO,温度: 25 °C, 測定機器: MicroCal VP-ITC

L-PGDSと脂溶性リガンドの相互作用系における
エンタルピー・エントロピー補償
ΔH° (kJ/mol)
–TΔS°
(kJ/mol)
ヘミン (高親和)
ヘミン (低親和)
ビリベルジン (低親和)
ビリベルジン (高親和)
ビリルビン (低親和)
ビリルビン (高親和)
All-trans レチノイン酸
T4
T3
テストステロン
ゲニステイン
ナリンゲニン
ダイゼイン
U-46619
TNS

タンパク質/リガンド複合体予測アルゴリズムを用いた
熱力学パラメータの予測
水素結合による寄与
(kJ/mol)
疎水性結合数
ΔH° (kJ/mol) –TΔS° (kJ/mol)
ソフトウェア: AutoDock4、アルゴリズム: Lamarckian genetic algorithms
タンパク質: ヒト由来L-PGDS (PDB ID: 3O2Y)
TNS
ヘミンビリベルジン
ビリルビン
All-trans レチノイン酸
T4 T3
プロゲステロンテストステロン
ゲニステインナリンゲニン
ダイゼイン
U-46619 TNS

まとめ
ヒト由来L-PGDSは、ヘム代謝産物や甲状腺ホルモンなど
の様々な脂溶性低分子を結合する。
L-PGDSと脂溶性低分子との相互作用は、水素結合の再構
成に起因するエンタルピー・エントロピー補償を示す。
L-PGDSの幅広い結合選択性は、エンタルピー変化、およ
びエントロピー変化両方のバランスによって熱力学的に最
適化される。

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