Eksperimen 3 anis hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321
PENGASINGAN ENZIM FOSFORILASE DARIPADA UBI KENTANG DAN
PENENTUAN AKTIVITI SPESIFIK ENZIM
1. Abstrak
Eksperimen ini juga menggunakan teknik fotometri bagi mengkaji aktiviti spesifik enzim
fosfat di dalam ekstrak fraksi S1, S2, M1 dan M2. Jarak gelombang yang digunakan ialah
700-725nm. Nilai bacaan kepekatan fosfat yang diperolehi daripada daya penyerapan larutan
di catatkan. Kemudian, nilai kepekatan protein pula dirujuk dari graf penentuan protein yang
menggunakan kaedah Folin. Aktiviti sepesifik enzim diperoleh dari aktiviti enzim
dibahagikan dengan kepekatan protein. Akhir sekali, ekstrak fraksi yang mempunyai
kepekatan yang tinggi akan disimpan untuk digunakan untuk eksperimen yang seterusnya.
2. Pengenalan
Eksperimen ini adalah mengenai pengasingan enzim fosforilase, daripada ubi kentang dan
kemudian aktiviti spesifik enzim ini ditentukan dalam ekstraknya.
Aktiviti spesifik enzim = Jumlah aktiviti enzim = μmol substrat diguna/min
Jumlah protein mg protein
Jika suatu ekstrak enzim menunjukkan aktiviti spesifik enzim yang tinggi, ianya hanya
mempunyai enzim ini dalam quantiti yang tinggi. Ekstrak enzim ini dikatakan separa tulen
kerana protein lain yang wujud dengan enzim dalam ekstrak dapat diasingkan. Jadi, dalam
cara penceraiaan suatu enzim, unit aktiviti spesifik enzim boleh menunjukkan samada, suatu
sampel ekstrak enzim adalah separuh tulen atau tidak. Sebelum kita boleh menentukan aktiviti
spesifik enzim kita akan menentukan aktiviti enzim dan kepekatan proteinnya.
Enzim fosforilase memainkan peranan yang penting dalam proses pemecahan karbohidrat
dalam sel. Tindakbalas yang dimangkinkan oleh enzim ini adalah berikut:
NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 1

A. Prinsip mengenai pengasingan protein
Untuk mengasingkan suatu enzim daripada suatu tisu, anda perlu mengetahui prinsip asas
mengenai pengasingan protein. Protein boleh terlarut dalam larutan berair kerana:
 Terdapat kumpulan berion seperti NH3⁺ dan COD dalam molekul protein yang boleh
bertindak balas dengan molekul air.
 Hasil daripada pengionan terdapat kumpulan berkutub pada permukaan molekul
protein yang boleh bertindakbalas dengan molekul air.
Suatu protein (contohnya enzim) dapat dimendakkan daripada larutan berair jika keadaan
perlarutnya boleh mengurangkan cas bersih pada permukaan protein atau mengurangkan
saling tindakan antara kumpulan berkutub pada permukaan molekul protein dengan molekul
air. Ia juga boleh dimendakkan jika protein asli (native) boleh menukarkan konformasi
kumpulan dalam kepada konformasi lain supaya sifat permukaan protein tidak akan
bertindakbalas dengan molekul air lagi. Oleh kerana itu, permukaan molekul protein tidak
distabilkan dengan molekul air lagi, dan seterusnya ia akan mengalami pemendakan daripada
larutan. Proses ini dikatakan ‘salting-out’.
Pemendakkan suatu protein pada titik isoelektrik atau dengan menggunakan kepekatan garam
yang tinggi adalah cara yang sangat berguna dan ianya biasa digunakan dalam pengasingan
enzim kerana kedua-dua kaedah ini selalunya tidak akan mendenaturasikan protein.
Dalam eksperimen ini, pengasingan enzim fosforilase dengan meggunakan garam ammonium
sulfat sebagai bahan mendakan melalui proses salting-out dilakukan. Secara amnya,
keterlarutan sesuatu protein dipengaruhi oleh kekuatan ion seperti yang berikut:
μ = 1 cizi²
2
Di mana :
μ = kekuatan ion
Ci = kepekatan ion
zi = Ca pada ion itu.
Enzim boleh dimendakkan dengan menggunakan larutan yang mempunyai kekutan ion
tertentu. Setelah enzim dimendakkan dengan menggunakan garam, misalnya ammonium
sulfat dalam eksperimen ini ianya boleh diceraikan dengan menggunakan teknik-teknik
tertentu seperti kromatografi, elektroforesis dan lain-lain.

B. Penentuan aktiviti fosforilase
Fosforilase memangkinkan tindakbalas berikut:
(kanji)n + pi ******* (kanji)n-1 + glukosa-1-fostat
3. Bahan-bahan
Ubi kentang
Alat pengemparan meja
Tabung emparan
Bikar
Tabung uji(1ml,2ml, 5ml, 10ml)
Kelalang
Kain muslin
Natrium ditionit(0.7%)
Ammonium sulfat(1 botol)
25% larutan asid trikloroasetik(TCA)
0.025M glukosa 1-fosfat
Larutan tampan tris malat pH 7.4
Reagen fosfat
Spektrofotometer
Kuvet
Rendaman air, 37%
Jam
Penurus Buchner
Ais
4. Tatacara
Pengasingan fosforilase daripada ubi kentang
i. Ubi kentang dikupaskan kemudian dipotongkan menjadi keping-keping sebesar ½ inci
besar. Ditimbangkan 200g keeping ubi kentang itu dan direndamkannya selama 5 minit
dalam larutan natrium dilionit (7g/liter). Kemudian ia dibasuhkan dengan air suling, dan
dimasukkan ke dalam alat pengisar dengan 50 ml air suling dan dikisar hingga lumat.
Kemudian, perahan ubi kentang itu didapatkan dengan menggunakan kain muslin atau
turasan vakum penuras Buchner yang dilapik dengan kain muslin. Penurasan harus
dilakukan dengan cepat untuk mengelakkan kehilangan aktiviti enzim. Emparkan perahan
ini selama 3 minit pada kelajuan putaran 5,000 rpm. Supernatant ddiambil dan ditentukan
isipadunya. Diasingkan 10ml supernatant itu dan dilabelkannya sebagai S1.
Disimpankannya dalam ais.
ii. Supernatan yang selebihnya ditambahkan ammonium sulfat (3g ammonium sulfat/10 ml
supernatant) dengan beransur-ansur dan dibancuhkan hingga semua hablur (NH₄)₂ SO₄
telah terlarut. Diemparkan campuran ini pada 5,000 rpm selama 10 minit. Dipisahkan
mendapan dan supernatan yang diperolehi. Ditambahkan air suling kepada mendapan ini
dengan nisbah 1 ml mendapan; 2 ml air suling. Dilabelkan bahagian ini sebagai M1 dan
letakkan kedalam ais.

iii. Kepada supernatant yang diperolehi dari emparan kedua, tambahkan 2gm ((NH₄)₂ SO₄ /10
ml supernatant beransur-ansur sambil membancuh dengan sempurna. Diemparkan
campuran selama 10 minit pada 5,000 rpm. Dipisahkan mendapan dan supernatant yang
diperolehi. Ditambahkan mendapan yang kedua ini dengan air suling dengan nisbah 1 ml
mendapan; 4 ml air suling. Dilabelkan bahagian mendapan ini sebagai M2 dan supernatan
tadi sebagai S2 dan letakkan kedalam ais.
Langkah-langkah untuk pengasingan bahagian yang akan mengandungi fosforilase
ditunjukkan dalam carta aliran berikut:
Carta aliran
Homogenant ubi kentang
5000 rpm selama 3 minit
Supernatan (SI) Mendapan
Ambil
10 ml Sl
+ 3 g (NH₄)₂ SO₄
Emparkan
Mendapan supernatant (S2)
Tambah air + 2g (NH₄)₂ SO₄ 10 ml
Suling (v/v1:4) supernatant 5,000 rpm, 10 minit
M1
Mendapan Supernatan (S2)
Air suling
Suling (v/v1:4)
M2
iv. Digunakan semua bahagian ekstrak (S1, S2, M1, M2) untuk menentukan aktiviti fosforilase.

Penentuan aktiviti fosforilase
i. Sediakan 4 tabung uji bagi setiap bahagian ekstrak ubi kentang (S1, S2 dan M1, M2)
seperti berikut:
Tabung uji 3 dan 4 digunakan sebagai tabung kawalan untuk tabung uji 1 dan 2
masing-masing yang mengandungi larutan ekstrak enzim tertentu. Diulangkan
prosedur ini untuk ekstrak lain. Jumlah tabung uji yang digunakan ialah 16.
ii. Dieramkan semua tabung uji ini dalam sebuah rendaman air pada 37°C selama 2
minit.
iii. Ditambahkan 1 ml 25% TCA ke dalam tabung uji 3 dan 4 bagi setiap larutan ekstrak.
Dibancuhkannya
iv. Ditambahkan 1 ml larutan glukosa-1-fostat ke dalam semua tabung uji termasuk
tabung uji kawalan. Dibancuhkan dan dieramkan semua tabung uji bagi setiap ekstrak
pada 37°C selama 15 minit.
v. Selepas eraman, ditambahkan 1 ml 25% TCA kedalam tabung uji 1 dan 2 bagi setiap
bahagian ekstrak.
vi. Diemparkan semua tabung uji dan digunakan 1 ml supernatant daripada setiap tabung
uji untuk penentuan kepekatan Pi. Pi ini terhasil dalam setiap tabung uji.
Penentuan kepekatan Pi
i. Diambil 1 ml supernatant (dari langkah 6) bagi setiap bahagian ekstrak dan
dimasukkan ke dalam sebuah tabung uji bersih. 17 tabung uji digunakan ; satu tabung
uji digunakan sebagai blank. Tabung uji blank ini hanya mengandungi 1 ml air suling.
ii. Ditambahkan 2 ml reagen fostat kepada setiap tabung uji. Diancuhkan dan kemudian
ditinggalkan tabung uji ini pada suhu bilik selama 10 minit.

iii. Ditentukan daya penyerapan untuk semua tabung uji ini pada 72 nm dengan
menggunakan air suling sebagai blank.
iv. Digunakan lengkok piawai daya penyerapan lawan kepekatan fostat takorganik yang
telah didapati daripada eksperimen 1 untuk pengiraan kepekatan fostat terhasil bagi
setiap ekstrak S1, S2 dan M1, M2.
v. Aktiviti enzim fosforilase diberikan dalam sebutan μ mole Pᵢ yang dihasilkan/min/ml
bagi setiap bahagian ekstrak.
vi. Ditentukan bahagian ekstrak yang mempunyai aktiviti enzim tertinggi. Keputusan
dibincangkan.
vii. Bahagian ekstrak yang mempunyai aktiviti enzim tertinggi disimpankan kedalan peti
sejuk untuk eksperimen 3.
Penentuan Kepekatan Protein
i. Tabung uji bersih djsediakan untuk menentukan kepekatan protein dalam ekstrak S1,
S2 dan M1, M2 dengan menggunakan reagen Folin-Clocalteau. Rujukan kepada
Jadual 1.1 eksperimen 1 untuk menjalankan penentuan kepekatan protein ini.
ii. Digunakan 0.5 ml daripada setiap ekstrak untuk ujian ini.
iii. Ditentukan kepekatan protein dalam larutan ekstrak dengan mengikuti kaedah Folin
yang diberi dalam eksperimen 1.
iv. Dikirakan kepekatan protein dalam ekstrak S1, S2 dan M1, M2 dan kemudian
dikirakan aktiviti spesifik enzim fosforilase dalam ekstrak ini.

5. Keputusan

6. Perbincangan
Eksperimen yang dijalankan menunjukkan ekstrak enzim S2 mempunyai aktiviti enzim
fosforilase yang paling tinggi dengan menggunakan tindak balas terbalikan melalui penentuan
kadar pembentukan fosfa takorganik Pi. Ini bermakna ekstrak enzim S2 mempunyai kuantiti
yang tinggi. Setelah di bahagikan dengan kepekatan protein, didapati ekstrak enzim S2 juga
mempunyai aktiviti spesifik enzim yang paling tinggi. Berdasarkan teori, ekstrak enzim ini
dikatakan separa tulen kerana protein lain yang wujud dengan enzim dalam ekstrak dapat
diasingkan. Pada awalnya kami telah mendapat bacaan yang negatif, kemudian setelah
mengulangi semula eksperimen, kami berjaya melakukan eksperimen dengan baik kerana
sentiasa berhati-hati ketika melakukan prosedur dan menggunakan peralatan yang digunakan
dengan baik. Setelah berbincang, kami dapati keputusan yang negatif yang kami peroleh di
awal eksperimen berkemungkinan disebabkan kuantiti reagen yang kami ambil menggunakan
pipet kurang dari kuantiti yang telah ditetentukan.
7. Kesimpulan
Kami telah berjaya menjalankan eksperimen dengan baik. Eksperimen ini perlu
mengambil kira aktiviti enzim fosfat dan kepekatan protein bagi menentukan aktiviti spesifik
enzim bagi ekstrak tertentu. Ekstrak enzim S2 menunjukkan aktiviti spesifik enzim yang
paling tinggi. Oleh itu, ekstrak enzim S2 akan disimpan untuk digunakan di dalam eksperimen
seterusnya.

8. Soalan perbincangan
i. Apakah maksudnya aktiviti dan aktiviti spesifik bagi suatu enzim?
Aktiviti enzim adalah kerja yang dilakukan oleh enzim untuk menghasilkan
produk sebanyak 1 umol per minit. Manakala, aktiviti spesifik enzim ialah
magnitud aktiviti enzim per jumlah protein yang terkandung dalam campuran
enzim yang diuji. Semakin besar suatu aktiviti tertentu enzim, maka makin besar
tingkat penulenan suatu enzim.
ii. Huraikan prinsip fotometri untuk penentuan kepekatan suatu sebatian dalam suatu
larutan.
Prinsip fotometri berdasarkan dari perbezaan jarak dari dua sumber cahaya
dari titik pengukuran bagi menghasilkan intensiti yang sama pada titik
pencahayaan. Erti kata lain, cahaya pada jarak gelombang tertentu akan diserap
apabila suatu cahaya putih melalui suatu larutan yang mengandungi sebatian
berwarna. Warna yang terhasil adalah disebabkan oleh cahaya yang tidak dapat
diserap oleh sampel itu. Ini boleh dibuktikan oleh spektrum penyerapan
riboflavin, iaitu graf yang menunjukkan kuantiti cahaya yang diserap melawan
jarak gelombang. Prinsip fotometri ditunjukan dengan penggunaan
spektrofotometer bagi menentukan kepekatan sesuatu bahan. Prinsip fotometri
merujuk kepada Hukum Lambert dan Hukum Beer. Spektrofotometer adalah
alat yang pentingbagi ahli biologi dan biokimia kerana banyak sebatian biologi
dan biokimia boleh menyerap cahaya dalam julat ultra-lembayung (200-400nm),
sinaran ternampakkan (400-700nm) dan sinaran inframerah dekat (700-900nm).
iii. Mengapakah anda menentukan kepekatan fostat takorganik tetapi bukan kepekatan
glukosa-1-fostat dalam tindakbalas enzim fosforilase dalam eksperimen ini?
Ini kerana aktiviti fosforilase boleh ditentukan dengan menggunakan
tindakbalas terbalikan melalui kadar penentuan kadar pembentukan fosfa
takorganik Pi

iv. Bagaimanakah protein dapat dimendakkan daripada larutan?
Protein (contohnya enzim) dapat dimendakkan daripada larutan berair jika
keadaan perlarutnya boleh mengurangkan cas bersih pada permukaan protein
atau mengurangkan saling tindakan antara kumpulan berkutub pada
permukaan molekul protein dengan molekul air. Ia juga boleh dimendakkan jika
protein asli (native) boleh menukarkan konformasi kumpulan dalam kepada
konformasi lain supaya sifat permukaan protein tidak akan bertindakbalas
dengan molekul air lagi. Oleh kerana itu, permukaan molekul protein tidak
distabilkan dengan molekul air lagi, dan seterusnya ia akan mengalami
pemendakan daripada larutan. Proses ini dikatakan ‘salting-out’. Pemendakkan
suatu protein pada titik isoelektrik atau dengan menggunakan kepekatan garam
yang tinggi adalah cara yang sangat berguna dan ianya biasa digunakan dalam
pengasingan enzim kerana kedua-dua kaedah ini selalunya tidak akan
mendenaturasikan protein. Eksperimen ini, mengasingkan enzim fosforilase
dengan meggunakan garam ammonium sulfat sebagai bahan mendakan melalui
proses salting-out.
v. Mengapakah telur membeku jika ianya dipanaskan?
Putih telur merupakan protein yang dipanggil albumin. Protein terdiri dari
molekul asid amino yang membentuk rantaian panjang. Rantaian yang panjang
ini akan bergabung dan akhirnya bergumpal membentuk globul. Apabila
dipanaskan, rantaian globul terurai sebab adanya haba.kemudian, molekul-molekul
bergabung antara satu sama lain lalu membentuk ikatan yang kuat.
Rujukan
A microcolometric method for the determination of inorganic phosphorus,H Taussky, E.
Shorr and Gloria Kurman, J. Biochem 202, 675-685, 1953.
Practical modules 1-6 / Biochemistry / Nik Norulaini Nik Ab Rahman
Campbell, Farrell. (2012). Biochemistry . Brooks / Cole.
Chang, R. (2010). Chemistry . Singapora: Mc Graw Hill.

Eksperimen 3 anis hidayah edited

Recommended

Recommended

More Related Content

Featured

Featured (20)

Eksperimen 3 anis hidayah edited