2. EXPERIMENT 1
• Uns investigados estan estudiant l’expressió gènica d’un operó bacterià de
regulació positiva reprimible utilitzant el sistema del promoter bashing.
Per fer-ho, clonen la regió reguladora de l’operò davant del gen reporter i
mesuren l’activitat transcripcional de la regió sencera i dels diferents
fragments indicats, en absència d’efector.
3. Promoter bashing
• Tècnica per a saber la importància d’un promotor específic en l’expressió
d’un gen.
• Ús de gens reporters Codifiquen per a proteïnes de simple detecció
(per exemple, gràcies a la emissió de llum)
1. Clonar promotor
2. Seqüenciar-lo
3. Digerir-lo mitjançant enzims de restricció
4. Lligar-lo al gen reporter
5. Mesurar la transcripció Si s’expressa
el reporter vol dir que és la seqüència
reguladora.
5. EXPERIMENT 1. Resultats
• Uns investigados estan estudiant l’expressió gènica d’un operó bacterià de
regulació positiva reprimible utilitzant el sistema del promoter bashing.
Per fer-ho, clonen la regió reguladora de l’operò davant del gen reporter i
mesuren l’activitat transcripcional de la regió sencera i dels diferents
fragments indicats, en absència d’efector.
• CONCLUSIÓ: La regió reguladora es troba a la regió B doncs és la regió que
es troba a la construcció 2 i no a la 3 (resposta c)
7. EXPERIMENT 1. Resultats (2)
• CONCLUSIÓ: Observarem els mateixos resultats que en
l’experiment anterior: (+,+,-)
8. EXPERIMENT 2
• Posteriorment es va amplificar per PCR la regió reguladora de
l’apartat 1, i es va utilitzar per fer un experiment de retard en gel
utilitzant extractes de proteïnes bacterianes.
- PCR
- Retard en gel
9. TÈCNICA DE PCR
-Desnaturalització
- Hibridació dels
encebadors a la zona
3’ específica de cada
cadena
-Extensió del primer
per actuació de la
DNA-polimerasa
11. TÈCNICA DE RETARD EN GEL
- Localitzar llocs d’unió de les proteïnes dins de fragments de DNA
- Migració del DNA per un gel d’agarosa: separació de molècules de DNA
segons la seva mobilitat en un camp elèctric
- Proporcional a voltatge i càrrega
- Inversament proporcional a mida
- Condicions reductores
17. + 1 2 3 4
- DNA DNA
+
DNA + proteïnes
+
proteïnes Competidors
específics
18. + 1 2 3 4
- DNA DNA
+
DNA + proteïnes
+
proteïnes Competidors
específics
19. + 1 2 3 4
- DNA DNA
+
DNA + proteïnes
+
DNA + proteïnes
+
proteïnes Competidors Competidors no
específics específics
20. EXPERIMENT 2
• Si l’operó fos de regulació negativa induïble, i si l’experiment es fa en absència
de l’efector, els resultats esperats del retard en gel serien:
a) Els mateixos per a tots els carrils
b) Diferents a tots els carrils
c) Els mateixos per a carrils 1 i 2, però diferents en els carrils 3 i 4
d) Els mateixos en els carrils 1 i 3, però diferents en els carrils 2 i 4
24. Proteïna Bcd
• La proteïna Bcd controla l’expressió d’altres gens unint-se al seu promotor
• Factor de transcripció
• Activació de la transcripció de gens cigòtics
• Implicada en el desenvolupament embrionari
• Reconeix un enhancer del DNA i s’hi uneix
• Té la següent estructura:
25. Enhancer de DNA
• Determinada seqüència curta de DNA situada al promotor
d’un gen
TAATCCGGATTA
26. EXPERIMENT 3
• Demostrar la unió de la proteïna Bcd al DNA
• Identificar la regió de la proteïna responsable d’aquesta unió
• Coneixer l’estructura de la proteïna
27. EXPERIMENT 3
• 1) Clonem 4 cDNA parcials que codifiquen per la proteïna Bcd
• 2) Transcribim i traduïm els cDNA
cDNA1 -----------
cDNA2 -----------
cDNA3 -----------
cDNA4 -----------
29. EXPERIMENT 3
• 3) Barregem els productes de la traducció dels cDNA amb un fragment de
DNA marcat radioactivament (amb l’enhancer)
• 4)Preparem el gel d’electroforesi (mètode del retard en gel)
46. EXPERIMENT 4
3. Volem analitzar com afecta una mutació en la proteïna Bcd (Bcdmut)
a la unió a la seqüència TAATCCGGATTA.
Per fer-ho produïm proteïna Bcdmut i la fem servir en un experiment de retard
en gel amb un fragment de DNA marcat radioactivament que conté la seqüència
TAATCCGGATTA.
El resultat d’aquest experiment, amb competidors específics i amb competidors
no específics es mostra a continuació:
47. Què utilitzem en el retard en gel?
DNA marcat radioactivament
Amb la seqüència TAATCCGGATTA
48. Què utilitzem en el retard en gel?
DNA marcat radioactivament
Amb la seqüència TAATCCGGATTA
Proteïna Bcdmut
49. Què utilitzem en el retard en gel?
DNA marcat radioactivament
Amb la seqüència TAATCCGGATTA
Proteïna Bcdmut
50. Què utilitzem en el retard en gel?
DNA marcat radioactivament
Amb la seqüència TAATCCGGATTA
Proteïna Bcdmut
DNA NO marcat radioactivament però
en major concentració
51. Què utilitzem en el retard en gel?
DNA marcat radioactivament
Amb la seqüència TAATCCGGATTA
Proteïna Bcdmut
DNA NO marcat radioactivament però
en major concentració
52. Què utilitzem en el retard en gel?
DNA marcat radioactivament
Amb la seqüència TAATCCGGATTA
Proteïna Bcdmut
COMPETIDOR
DNA NO marcat radioactivament però
en major concentració
53. Perquè utilitzem competidors?
Una seqüència
del DNA Unió Competidor
específica específic
concreta
Per saber si
la proteïna
té afinitat
per…
DNA en general Unió Competidor
inespecífica inespecífic
54. Competidors Específics
DNA no marcat radioactivament que conté la seqüència que estudiem.
No apareix en el retard en gel però segresta proteïnes que en cas d’unió
específica sense competidor s’unirien a la seqüència estudiada del DNA
marcat.
Aquest descens de DNA marcat unit a proteïnes sí que apareix en el retard
en gel i demostra la unió específica si només té lloc en el carril del
competidor específic.
55. Competidors Inespecífics
DNA qualsevol no marcat radioactivament
No apareix en el retard en gel però segresta proteïnes que en cas d’unió
específica sense competidor s’unirien a qualsevol punt del DNA marcat.
Aquest descens de DNA marcat unit a proteïnes sí que apareix en el retard
en gel i demostra la unió inespecífica si té lloc tant en el carril del
competidor específic com en el d’inespecífic.
56. EXPERIMENT 4
3. Volem analitzar com afecta una mutació en la proteïna Bcd (Bcdmut)
a la unió a la seqüència TAATCCGGATTA.
Per fer-ho produïm proteïna Bcdmut i la fem servir en un experiment de retard en gel
amb un fragment de DNA marcat radioactivament que conté la seqüència TAATCCGGATTA.
El resultat d’aquest experiment, amb competidors específics i amb competidors no
específics es mostra a continuació:
59. Mm
M
M
M
M
M
M
Z
DNA DNA DNA + Prot
+ (en presència del
Prot comp. específic)
60. DNA DNA DNA + Prot DNA + Prot
+ (en presència del (en presència del
Prot comp. específic) comp. inespecífic)
61. EXPERIMENT 4. Resultats
a) la proteïna mutant Bcdmut s'uneix de forma específica a la seqüència TAATCCGGATTA
de DNA.
b) la proteïna mutant Bcdmut s'uneix a la seqüència TAATCCGGATTA de DNA, però ho fa
de forma inespecífica
c) la proteïna mutant Bcdmut no és capaç d'unir-se al DNA.
d) la proteïna mutant Bcdmut s'uneix al DNA però no podem saber si ho fa
específicament o inespecíficament.
62. b) la proteïna mutant Bcdmut s'uneix a la seqüència
TAATCCGGATTA de DNA, però ho fa de forma inespecífica
63. 4. Descubrim que la proteïna Bcdmut ha canviat la seva afinitat en el
reconeixement de seqüència i de fet sʼuniex específicament a seqüències
del tipus TTTTCCGGAAAA.
Si repetíssim els experiments de retard en gel amb un fragment de DNA
amb aquesta sequencia, el resultat esperat seria:
